一种促进植物吸收锌离子的基因、氨基酸序列和表达载体及应用的制作方法

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种促进植物吸收锌离子的基因、氨基酸序列和表达载体及应用。

背景技术：

锌是植物生长必需的矿质元素，是生物体多种酶的辅助因子，参与生物体各种生化代谢反应。缺乏锌将严重影响植物体生理代谢过程，因此严格控制植物体内锌元素的平衡至关重要。包括中国在内的世界上30％左右的土壤存在缺锌胁迫现象。调查研究表明我国约45.7％的可耕地面积土壤有效锌低于0.5mg/kg的临界水平。

在20世纪40年代，Stout和Arnon、Skoog、Hoagland通过试验证实，锌在高等植物的生长发育过程中是必不可少的微量矿质元素。此后的研究也证明锌在植物的生理生化过程、分子水平的调控方面起到重要的作用。研究表明，锌与色氨酸的合成密切相关，色氨酸本身又是形成吲哚乙酸的前体物质，故而锌对生长素合成、植物的生长发育起到明显的调控作用；锌还会抑制核糖核酸酶的分解作用，与RNA的代谢有紧密联系，进而影响植物体内蛋白质的合成；锌还与细胞叶绿体及叶绿体中的碳酸酐酶的活性有关，所以锌与植物的光合作用有一定的关系。此外，锌在植物体内仅仅以二价阳离子的形式存在，不参与细胞内的氧化还原反应。正因为锌的特殊理化性质，使其成为多种酶的结构与功能成份。前人研究已证实，锌是300多种酶类的的辅助因子，是锌指结构域的重要组成部分，调节着DNA的复制、RNA的转录及基因表达的过程，能够参与植物的核酸合成、碳水化合物代谢、脂质代谢、有机酸代谢、激素代谢、生物膜完整性的维持、活性氧的清除等多种细胞活动。

分子生物学研究认为：至少有6个不同家族转运蛋白参与锌的吸收、转运过程，包括ZIP(Zrt/Irt-like proteins)、CDF(Cation Diffusion Facilitator proteins)、P-type ATPase(metal transporting ATPase)、NRAMP(natural resistance-associated macrophage proteins)和CAX(calcium and other divalent cation exchange antiporters)家族蛋白。在众多相关基因中，ZIP家族基因在参与植物中Zn²⁺、Fe²⁺等二价阳离子吸收转运的功能被研究较多，主要负责将Zn²⁺等二价阳离子跨膜运输进细胞以及负责木质部锌的卸载。ZIP转运蛋白是“Zrt/Irt-like proteins”的首字母缩写，ZRT1(zinc-regulated transporter)和IRT1(iron-regulated transporter)是最早被鉴定分离的ZIP家族成员。大多数ZIP蛋白含有8个跨膜结构区域，编码309到476个氨基酸残基。目前为止，85个以上的ZIP家族成员已在不同的生物的组织、器官中被鉴定出来，包括18个位于拟南芥中的ZIP家族基因。

但是，目前促进植物吸收锌离子的基因的研究还不够透彻，新的影响促进植物吸收锌离子的基因还有待挖掘。

技术实现要素：

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种促进植物吸收锌离子的基因、氨基酸序列和表达载体及应用。

本申请的发明人通过植物生理和分子生物学手段找到Zn²⁺吸收与分布的重要基因ZNE，为培育Zn²⁺吸收能力强的农作物及牧草做了很好的理论及实验技术基础。

本发明所采用的技术方案为：一种促进植物吸收锌离子的基因，所述基因的序列如SEQ ID NO：1所示。所述基因来源于植物拟南芥，在本发明中，被命名为ZNE基因。

在得到了所述基因的序列之后，为了进一步研究确认所述基因的作用，本申请的发明人有设计了多组引物对所述基因序列进行鉴定。多组引物分别为：

一种鉴定所述基因突变的第一引物组，包括上游引物F1和下游引物R1，所述上游引物F1的序列如SEQ ID NO：2所示，所述下游引物R1的序列如SEQ ID NO：3所示。

一种鉴定所述基因突变的第二引物组，包括上游引物F2和下游引物R2，所述上游引物F2的序列如SEQ ID NO：4所示，所述下游引物R2的序列如SEQ ID NO：5所示。

一种鉴定所述基因突变的第三引物组，包括上游引物Actin F和下游引物Actin R，所述上游引物Actin F的序列如SEQ ID NO：6所示，所述下游引物Actin R的序列如SEQ ID NO：7所示。

其中，SEQ ID NO：2为CAGTAGCATCCATGGAAGCTC；

SEQ ID NO：3为GAATTGCAGTAGGGTGTGTGC；

SEQ ID NO：4为GATAGCAGCAGTTGAAGTGGG；

SEQ ID NO：5为CTGTGCCCTTCTTCTTTGTTG；

SEQ ID NO：6为ACGGTAACATTGTGCTCAGTGGTG；

SEQ ID NO：7为CTTGGAGATCCACATCTGCTGGA；

相对应的，本发明还提供了一种所述基因编码得到的氨基酸序列，所述氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

进一步地，本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体含有所述基因序列。

作为一种的选择，所述所述表达载体为含有所述基因序列的质粒。

本发明还公开了所述基因、氨基酸序列以及所述表达载体在农作物及牧草中的应用。

从本申请的实施例能够看出，所述基因在拟南芥根以及叶肉细胞内表达，缺失这个基因的拟南芥突变体在相对高锌的环境下，叶子出现早衰同时叶脉周围细胞死亡。通过互补锌离子吸收缺陷型酵母证明该基因编码蛋白是参与锌离子的吸收的重要因子。所述促进植物吸收锌离子的基因、氨基酸序列和表达载体对改良、增加植物体锌离子含量，加速培育含有高锌的作物和牧草新品种具有十分重要的理论和实践意义。

本发明的有益效果为：

1、本发明提供了一种促进植物吸收锌离子的基因、氨基酸序列和表达载体及应用，所述促进植物吸收锌离子的基因、氨基酸序列和表达载体对改良、增加植物体锌离子含量，加速培育含有高锌的作物和牧草新品种具有十分重要的理论和实践意义。

2、另外，为鉴别所述基因和在基因编码区序列中插入T-DNA得到的缺失纯合突变体，本发明还公开了多组引物，使用所述引物能够简单快捷的对基因的突变后有无进行鉴定。

附图说明

图1为实施例2中不同酵母菌的生长菌落图；

图2为实施例3中PCR扩增产物电泳图；

图3为实施例3中Col-0、zne1-1和zne1-2在MQA CK培养基的生长形态图；

图4为实施例3中Col-0、zne1-1和zne1-2在MQA 5X Zn²⁺培养基的生长形态图；

图5为实施例3中Col-0、zne1-1和zne1-2在MQA CK培养基的鲜重统计图；

图6为实施例3中Col-0、zne1-1和zne1-2在MQA 5X Zn²⁺培养基的根长统计图；

图7为实施例3中Col-0、zne1-1和zne1-2在MQA CK水培体系的叶片形态图；

图8为实施例3中Col-0、zne1-1和zne1-2在MQA 5X Zn²⁺水培体系的叶片形态图；

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本实验所用的材料拟南芥野生型材料(Columbia ecotype，Col-0)和zne1-1，zne1-2，zne家族突变体购买自拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center)。大肠杆菌菌株DH5α由实验室保存；锌离子缺陷型酵母来自美国Wisconsin-Madison大学；Primer Star HS DNA Polymerase购自TaKaRa；EasyTaq PCR Supermix DNA聚合酶和T4DNA连接酶购自全式金公司；实验所用MQA CK药品及浓度为：5mM KNO₃；1mM H₃PO₄；1mM MgSO₄；1mM CaCl₂；1/2MS微量元素；1/2MS Fe盐；5mM MES；BTP调pH至5.7。

所述MQA 5X Zn²⁺培养基中锌离子含量为MQA CK的5倍。

实施例1

一种促进植物吸收锌离子的基因，所述基因的序列如SEQ ID NO：1所示。相对应的，一种所述基因编码得到的氨基酸序列，所述氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

一种鉴定所述基因突变的第一引物组，第二引物组和第三引物组，第一引物组包括上游引物F1和下游引物R1，所述上游引物F1的序列如SEQ ID NO：2所示，所述下游引物R1的序列如SEQ ID NO：3所示；第二引物组包括上游引物F2和下游引物R2，所述上游引物F2的序列如SEQ ID NO：4所示，所述下游引物R2的序列如SEQ ID NO：5所示；第三引物组包括上游引物Actin F和下游引物Actin R，所述上游引物Actin F的序列如SEQ ID NO：6所示，所述下游引物Actin R的序列如SEQ ID NO：7所示。

实施例2

本实施例为ZNE基因的功能鉴定。

将冻存的锌离子缺陷型酵母划线至YPDA固体培养基上30℃倒置培养直至长出单克隆菌落。随后将单克隆菌落转移至3mlYPDA培养基中30℃250rpm培养8-12h。取其中5ul培养液扩培至50mlYPDA培养基中30℃250rpm继续培养直至OD600达0.15-0.3。700g室温离心5min，弃上清，用100ml新鲜YPDA重悬菌体。30℃250rpm继续培养直至OD600达0.4-0.5。将培养基分装到2个50ml无菌管内，700g室温离心5min，弃上清，每管加入30ml超纯水重悬菌体。700g室温离心5min，弃上清，每管加入1.5ml 1.1X TE/LiAc重悬菌体。将重悬液分装至1.5ml离心管12000g离心15s，弃上清，每管加入600ul 1.1X TE/LiAc重悬菌体，完成感受态的制备。

将含有ZNE基因的质粒以及热变性的Yeastmaker Carrier DNA加入酵母感受态细胞中温和混匀，再加入PEG/LiAc温和混匀30℃孵育30min，每10min轻轻混匀一次。之后加入DMSO 42℃水浴15min，每5min轻轻混匀一次。高速离心15s，弃上清，加入YPD Plus复苏培养基重悬酵母细胞。30℃振荡孵育90min，高速离心15s，弃上清，加入0.9％Nacl重悬酵母细胞。将重悬酵母细胞按比例稀释10倍或100倍涂布于SD筛选培养基，30℃倒置培养直至长出阳性单克隆酵母菌落。将阳性单克隆酵母菌落按比例稀释滴于低浓度锌离子的酵母培养基中，观测锌离子缺陷型酵母再转入ZNE基因后是否能在缺失锌离子的酵母培养基中正常生长。

如图1所示，将锌离子缺陷型酵母ZHY3与转入ZNE基因、ZIP7基因以及空载体PFL61的锌离子缺陷型酵母ZHY3按相同比例稀释，在低锌含量的培养基上共同培养发现，未转入任何质粒的锌离子缺陷型酵母ZHY3在正常培养基YPD中可正常生长，而在低锌培养基中无法正常生长，进一步说明ZHY3为锌离子缺陷型酵母。分别将空载体PFL61，ZIP7基因，ZNE基因转入ZHY3酵母中发现阳性对照具有编码吸收Zn²⁺蛋白的ZIP7基因使ZHY3锌离子缺陷型酵母在低锌培养基中可正常生长，而阴性对照转入空载体PFL61的ZHY3锌离子缺陷型酵母在低锌培养基中依然不能正常生长。同时发现转入ZNE基因的锌离子缺陷型酵母ZHY3在低锌培养基中可正常生长，说明ZNE具有吸收锌离子的功能。

实施例3

本实施例为ZNE基因在拟南芥植物中作用的验证试验。

本实施例的实验材料主要为含ZNE基因的拟南芥野生型材料Col-0、以及使用插入T-DNA的方法得到的ZNE基因的缺失纯合突变体zne1-1和zne1-2，其中，zne1-1为拟南芥野生型基因编码区序列chr 3 2625013bp插入T-DNA得到的缺失纯合突变体；zne1-2为拟南芥野生型基因编码区序列chr 3 2626125bp插入T-DNA得到的缺失纯合突变体。zne1-1和zne1-2因为基因中插入了T-DNA，导致基因的作用被破坏，均属于ZNE基因缺陷型。

一、对Col-0、zne1-1和zne1-2进行基因型的验证。

使用实施例1中的引物组对Col-0、zne1-1和zne1-2分别进行PCR扩增，以验证其基因型。

具体实验过程为：用Trizol提取拟南芥野生型以及突变体的总RNA，用PrimeScript II 1st Stand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)反转录酶反转录得到cDNA。因为zne1-1和zne1-2分别为T-DNA插入拟南芥ZNE基因编码区序列chr 3 2625013bp以及chr 3 2626125bp处从而得到突变体，故在T-DNA插入位点两侧外显子区分别设计引物F1、R1和F2、R2同时设立阳性对照Actin，以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增。鉴定突变体材料是否为ZNE基因T-DNA插入缺失纯合突变体。结果如图2所示。

图2表示，管家基因Actin全部具有条带，说明PCR模板及体系的正确性，而引物F1、R1和F2、R2分别只有以Col-0cDNA为模板时有条带说明zne1-1、zne1-2均没有产生ZNE相应的成熟的mRNA，表明zne1-1、zne1-2为ZNE基因T-DNA插入缺失纯合突变体。

二、缺失ZNE基因的突变体(zne1-1和zne1-2)具有高锌离子敏感表型的验证。

为了研究ZNE基因是否参与Zn营养，我们对缺失相应基因的突变体进行表型分析。将野生型Col-0、突变体zne1-1和zne1-2种子分别播种在MQA CK和MQA 5X Zn²⁺固体培养皿中，春化3天后，培养室竖直光照培养15天左右采集数据，结果发现缺失ZNE基因的突变体zne1-1、zne1-2在5X Zn²⁺浓度下生长受到抑制，表现为叶小、根短，如图3和4所示。对地上部分鲜重及根长进行称量，并对同一个浓度下的Col-0和突变体进行统计学分析。如图5和6所示(图5和图6中，三个柱状图依次为Col-0、zne1-1和zne1-2)，在MQA CK培养基下，Col-0、zne1-1和zne1-2鲜重、根长相似，统计学分析没有差异；在MQA 5X Zn²⁺培养基下生长，zne1-1、zne1-2植株鲜重、根长明显小于Col-0，统计学分析两者具有显著差异(p<0.01)。说明缺失ZNE基因的突变体具有高锌离子敏感表型。

三、水培体系下进一步证明缺失ZNE基因的突变体(zne1-1和zne1-2)具有高锌离子敏感表型。

水培体系使用4×8的32孔4ml离心管盒为主要支持物。将同管架大小一致并预先打孔的黑胶纸贴在离心管盒的管架上，孔大小随苗大小而定，确保幼苗地上部分不可通过即可(一般是0.6mm×0.6mm圆形孔)，盒里加入水培溶液650ml，将培养皿上生长10天的幼苗的根全部放入孔内的溶液中，幼苗地上部分架于溶液上，幼苗全部放好后盖上离心管盒盖，用于保湿。待植株再生长15-25天分别用MQA CK、MQA 5X Zn²⁺液体培养基处理，观察水培表型变化。

将野生型Col-0、突变体zne1-1和zne1-2种子播种在MQA CK固体培养皿中，春化3天后，培养室水平光照培养20天后移入MQA CK水培液中培养10天，然后水培液更换为MQA CK、5X Zn²⁺水培液继续培养20天。采集数据，结果发现缺失ZNE基因的突变体zne1-1、zne1-2在5X Zn²⁺浓度下，叶片叶脉周围黄化并同时开始死亡，如图7和图8所示。进一步证明缺失ZNE基因的突变体具有高锌离子敏感表型。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 内蒙古和盛生态科技研究院有限公司

<120> 一种促进植物吸收锌离子的基因、氨基酸序列和表达载体及应用

<130> 2010

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1788

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.）

<400> 1

atgatgcatt caagctgcaa aggacttgtg ctgcttctat tcttatttgt cgttgtattc 60

attggaaaca ccgatgcgaa tgctcagtgg gaggtttcac ataaagtaag agcttctccc 120

catgaaaaca tgggacgtaa tgttattgac ggaagtggtg tagagaaaac attacatgac 180

attggaatgg gtgaaaagag aggcactcac aacaaagttt cagtctcaac agttgcgttg 240

ttcaccttgg ctatggctgc tgccactggg ttaggtgctg tgcccttctt ctttgttgag 300

cttgatcctc aatgggctgg aatttgcaat ggcatggctg ctggtgtgat gttggccgct 360

agctttgatc ttgttaagga agggcaggaa catggctctg gaaactgggt tgttactggg 420

atcctagccg gtgctttgtt catttggctc tgtaagcaga ttcttgaaca atatggtgaa 480

gttagtatgc tggatattaa aggcgcagat gcaactaaag ttgttctcgt cataggaatt 540

atgacacttc attctttcgg ggaaggatca ggggttggtg tatcattcgc tggctcaaaa 600

ggttttagcc aagggcttct ggtcactttg gccatagctg ttcataacat tccagaaggg 660

ttggctgtta gcatggtgtt ggcatcaagg ggtgtctctc cacaaaatgc catgctctgg 720

agtataataa catccttacc tcagcctctc gtcgccgtgc cagctttttt atgcgctgat 780

gcgttcagca agtttttgcc tttttgcact ggatttgctg ccggatgcat gatttggatg 840

gttattgctg aagtgcttcc tgatgctttt aaggaagcgt ctccttcgca agtggcatct 900

gcagccacca tatcagtagc atccatggaa gctcttagca ctcttttcga gagtttcaca 960

catgattaca actcagagga tgcttctggc ttcttcgttt cactcctctt tggtctgggt 1020

ccattgcttg ggggagtatt tctggttgca tcggcagtca ccttccgtct ccagcacgcc 1080

cttctcatgg gagttgcctc aggcattgct tttgtccttg gtctctggcg cccacttcaa 1140

ctgctgctat ccgcaaaaat gggattaatc cctctggtta gtctacttgc aattggagct 1200

ggactgagcc atttcactag ctcaaccatc ctgaatgtaa ctggtcggaa aaagtcccgg 1260

gctggcagtt taataaaccc agtaaccaat tttccaacca gtgtgataac actccaatca 1320

ttattagcgt gtggagcggt tgggttccat gcattagccg aggggcttgc tctcggggtg 1380

gctgctccaa atgcttatgg ccttggccga catatggttc tcccggtttc cctacacggg 1440

ctcccaagag ggacagcggt tgcaagctgt gtctttgggg ctacagacag ttggcacgca 1500

gctcttgcag cagcagcttt gataggattt gtgggaccca tatcggccat aggatccata 1560

ttagcaggga tagattacag cggactggac cacgtgatgg tggtggcgtg cggtggatta 1620

ctacccagct tctggcaggt gattaagaga gcagtgaggt tagagagaag gaaaggcagt 1680

gtggggatgg tgctgggact agcgtgtgcg gttgtgtgtc tgactttcac gagacttgtg 1740

tgcttgcaca caccctactg caattctgca cctgaggctg ttaggtga 1788

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<400> 2

cagtagcatc catggaagct c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<400> 3

gaattgcagt agggtgtgtg c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<400> 4

gatagcagca gttgaagtgg g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<400> 5

ctgtgccctt cttctttgtt g 21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 未知

<400> 6

acggtaacat tgtgctcagt ggtg 24

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 未知

<400> 7

cttggagatc cacatctgct gga 23

<210> 8

<211> 595

<212> PRT

<213> 拟南芥Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.

<400> 8

Met Met His Ser Ser Cys Lys Gly Leu Val Leu Leu Leu Phe Leu Phe

1 5 10 15

Val Val Val Phe Ile Gly Asn Thr Asp Ala Asn Ala Gln Trp Glu Val

20 25 30

Ser His Lys Val Arg Ala Ser Pro His Glu Asn Met Gly Arg Asn Val

35 40 45

Ile Asp Gly Ser Gly Val Glu Lys Thr Leu His Asp Ile Gly Met Gly

50 55 60

Glu Lys Arg Gly Thr His Asn Lys Val Ser Val Ser Thr Val Ala Leu

65 70 75 80

Phe Thr Leu Ala Met Ala Ala Ala Thr Gly Leu Gly Ala Val Pro Phe

85 90 95

Phe Phe Val Glu Leu Asp Pro Gln Trp Ala Gly Ile Cys Asn Gly Met

100 105 110

Ala Ala Gly Val Met Leu Ala Ala Ser Phe Asp Leu Val Lys Glu Gly

115 120 125

Gln Glu His Gly Ser Gly Asn Trp Val Val Thr Gly Ile Leu Ala Gly

130 135 140

Ala Leu Phe Ile Trp Leu Cys Lys Gln Ile Leu Glu Gln Tyr Gly Glu

145 150 155 160

Val Ser Met Leu Asp Ile Lys Gly Ala Asp Ala Thr Lys Val Val Leu

165 170 175

Val Ile Gly Ile Met Thr Leu His Ser Phe Gly Glu Gly Ser Gly Val

180 185 190

Gly Val Ser Phe Ala Gly Ser Lys Gly Phe Ser Gln Gly Leu Leu Val

195 200 205

Thr Leu Ala Ile Ala Val His Asn Ile Pro Glu Gly Leu Ala Val Ser

210 215 220

Met Val Leu Ala Ser Arg Gly Val Ser Pro Gln Asn Ala Met Leu Trp

225 230 235 240

Ser Ile Ile Thr Ser Leu Pro Gln Pro Leu Val Ala Val Pro Ala Phe

245 250 255

Leu Cys Ala Asp Ala Phe Ser Lys Phe Leu Pro Phe Cys Thr Gly Phe

260 265 270

Ala Ala Gly Cys Met Ile Trp Met Val Ile Ala Glu Val Leu Pro Asp

275 280 285

Ala Phe Lys Glu Ala Ser Pro Ser Gln Val Ala Ser Ala Ala Thr Ile

290 295 300

Ser Val Ala Ser Met Glu Ala Leu Ser Thr Leu Phe Glu Ser Phe Thr

305 310 315 320

His Asp Tyr Asn Ser Glu Asp Ala Ser Gly Phe Phe Val Ser Leu Leu

325 330 335

Phe Gly Leu Gly Pro Leu Leu Gly Gly Val Phe Leu Val Ala Ser Ala

340 345 350

Val Thr Phe Arg Leu Gln His Ala Leu Leu Met Gly Val Ala Ser Gly

355 360 365

Ile Ala Phe Val Leu Gly Leu Trp Arg Pro Leu Gln Leu Leu Leu Ser

370 375 380

Ala Lys Met Gly Leu Ile Pro Leu Val Ser Leu Leu Ala Ile Gly Ala

385 390 395 400

Gly Leu Ser His Phe Thr Ser Ser Thr Ile Leu Asn Val Thr Gly Arg

405 410 415

Lys Lys Ser Arg Ala Gly Ser Leu Ile Asn Pro Val Thr Asn Phe Pro

420 425 430

Thr Ser Val Ile Thr Leu Gln Ser Leu Leu Ala Cys Gly Ala Val Gly

435 440 445

Phe His Ala Leu Ala Glu Gly Leu Ala Leu Gly Val Ala Ala Pro Asn

450 455 460

Ala Tyr Gly Leu Gly Arg His Met Val Leu Pro Val Ser Leu His Gly

465 470 475 480

Leu Pro Arg Gly Thr Ala Val Ala Ser Cys Val Phe Gly Ala Thr Asp

485 490 495

Ser Trp His Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ala Leu Ile Gly Phe Val Gly

500 505 510

Pro Ile Ser Ala Ile Gly Ser Ile Leu Ala Gly Ile Asp Tyr Ser Gly

515 520 525

Leu Asp His Val Met Val Val Ala Cys Gly Gly Leu Leu Pro Ser Phe

530 535 540

Trp Gln Val Ile Lys Arg Ala Val Arg Leu Glu Arg Arg Lys Gly Ser

545 550 555 560

Val Gly Met Val Leu Gly Leu Ala Cys Ala Val Val Cys Leu Thr Phe

565 570 575

Thr Arg Leu Val Cys Leu His Thr Pro Tyr Cys Asn Ser Ala Pro Glu

580 585 590

Ala Val Arg

595