本发明属于基因工程领域，公开了小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918中一个NLR类基因NLR1-V及其表达载体和应用。
背景技术：
：：小麦(Triticumaestivum)的整个生育期受到多种病虫的危害，其中由小麦白粉病菌(Blurmeriagraminisf.sp.tritici，Bgt)侵染引起的小麦白粉病是小麦最严重的真菌病害之一。由于小麦白粉病菌生理小种多、毒力变异快，一旦产生新的毒性小种或小种种群发生变化，会导致小麦白粉病的大爆发，给农业生产带来灾难性后果。广谱、持久抗病基因的发掘和利用对白粉病防治具有重要意义。簇毛麦(Haynaldiavillosa，2n＝2x＝14，VV)携带的抗白粉病基因Pm21对小麦白粉病具有广谱、高抗特性，该基因定位于6V染色体短臂上。南京农业大学细胞遗传研究所利用四倍体圆锥小麦与二倍体簇毛麦杂交，再与普通小麦回交多代后，选育出了普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系，将含有Pm21基因的6VS导入普通小麦。普通小麦-簇毛麦6VS/6AL易位系自1994年进入国内育种利用以来，在白粉病常发区进行了多年种植，对白粉病表现出了广谱、高抗特性，以之为亲本已经选育出一批高抗白粉病的小麦新品种，南农9918即选育出的其中一个品种，Pm21在育种中得到广泛应用。分析Pm21介导的广谱抗性机理和克隆其候选基因对于利用基因工程手段培育具有白粉病广谱抗性的小麦品种具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一个NLR类基因NLR1-V的表达载体和应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现：NLR类基因NLR1-V来自普通小麦(TriticumasetivumL.)南农9918，其核苷酸序列为SEQIDNO.1。该NLR类基因NLR1-V的蛋白质为NLR1-V，其氨基酸序列为SEQIDNO.2。含有所述的NLR类基因NLR1-V的重组表达载体pBI220:NLR1-V。所述的NLR类基因NLR1-V的重组表达载体优选以pBI220为出发载体，将NLR1-V基因插入pBI220的BamHI和StuI酶切位点间所得。所述的NLR类基因NLR1-V的表达载体在构建抗白粉病小麦品种中的应用。有益效果：本发明从小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918的6VS染色体臂上克隆获得小麦中克隆得到了一个NLR类基因NLR1-V及其所编码的蛋白质NLR1-V，将其插入表达载体pBI220，得到的该基因的过量表达载体导入感病小麦品种中，可以提高感白粉病小麦品种对白粉病的抗性。NLR1-V的超量表达载体用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，能够获得具备白粉病抗性的小麦种质。附图说明图1NLR1-V在抗白粉病南农9918中受白粉菌诱导表达图2pBI220:NLR1-V超量表达载体图谱图3与白粉菌互作的表达GUS基因的表皮细胞A图:白粉菌侵入GUS表达的表皮细胞后未形成吸器；B图:白粉菌侵入GUS表达的表皮细胞后形成吸器；其中，co:分生孢子；pp:侵入钉；ha:吸器；hy:菌丝图4利用瞬间表达研究NLR1-V基因对吸器形成的影响和抗白粉病效应具体实施方式实施例1小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918中一个NLR类基因NLR1-V的克隆小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918是南京农业大学细胞遗传所育成的含有广谱抗白粉病基因Pm21的小麦品种(公知公用，陈佩度，张守忠，王秀娥，王苏玲，周波，冯祎高，刘大钧.抗白粉病高产小麦新品种南农9918.南京农业大学学报,2002,25(4):1438-1444)。前期已经在南农9918的6VS上开发了多个6VS的转化序列，进一步利用小片段插入易位系NAU418将Pm21限定在6EST258和CINAU15之间，并且在Pm21所在染色体区间还有6EST243和6EST238两个标记(公知公用，Radiation-inducedtranslocationswithreducedHaynaldiavillosachromatinatthePm21locusforpowderymildewresistanceinwheat.Molecularbreeding,2013,31:477–484)。将6EST258、CINAU15、6EST243、6EST238序列与水稻(http://rice.plantbiology.msu.edu)、大麦(http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley/viroblast.php)、短柄草(http://plants.ensembl.org/Brachypodium_distachyon/Info/Index)的序列数据库进行Blastn比对分析，分别提取出水稻、大麦、短柄草中位于6EST258和CINAU15所在染色体区间的序列。根据其中一个大麦的序列设计引物，在南农9918受白粉菌诱导的cDNA样品中进行扩增，获得NLR1-V全长序列。cDNA样品准备及扩增流程如下：具体流程如下：(1)将抗白粉病小麦南农9918的种子播于培养皿中发芽，露白后移栽到盆钵，一叶期把从感白粉病小麦材料上搜集的白粉菌孢子接种到苗上进行诱导，并于接种不同时间段取样(0h,1h,6h,12h,24h)，分别提取RNA(用Invitrogen公司的Trizol试剂提取)，并且反转录成cDNA样品(用Takara公司的AMV反转录酶反转)。(2)以南农9918经白粉菌诱导24小麦的cDNA为模板，以NLR1-V基因引物P1(ATTGAGATGTCTGCACCGGTCGT,SEQIDNO.3)和P2(CTCTCTTCGTTACATAATGTAGTGCC,SEQIDNO.4)为引物进行RT-PCR，获得NLR1-V基因的cDNA全长片段。对该基因片段进行测序和比对，发现该基因为一个NLR类基因，命名为NLR1-V。对NLR1-V进行生物信息学分析，发现ORF(开放阅读框)2730bp，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，编码909个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。实施例2NLR类基因NLR1-V在小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918中受白粉菌诱导表达以小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918受白粉菌诱导不同时间段的cDNA样品为模板，以根据NLR1-V设计的引物P3(ACGGGCTTATTCCAAGTCCT,SEQIDNO.5)和P4(ACGCTTCTGAAGGCAGACTC，SEQIDNO.6)为引物进行Q-PCR分析。PCR程序为：PCR反应在实时荧光定量PCR仪(MyIQ，Bio-Rad公司，美国)上扩增并检测荧光。20uLPCR反应体系中含2×SYBRGreenPCRMasterMix10uL，0.5μM引物P3和P4，反转录cDNA模板2uL。扩增参数为：95℃10分钟，然后95℃15秒、60℃30秒，72℃1分钟，共40个循环。反应结束后，进行熔解曲线的测定。检测基因表达水平用MyiQ系统软件进行分析。结果表明：在南农9918中，NLR1-V在小麦-簇毛麦易位系6VS/6AL南农9918受白粉菌诱导上调表达，12h小时表达水平最高，24h后表达水平开始下降(图1)。实施例3NLR1-V基因瞬间表达载体的构建以经白粉菌诱导的南农9918中克隆的NLR1-V基因cDNA为模板，使用引物对NLR1-V-BamHI-F(GGAGAGAACACGGGGGATCCATGTCTGCACCGGTCGTCAG，SEQIDNO.7)和NLR1-V-StuI-R(AACGTCGTATGGGTAAGGCCTTTAAAGTAAAACTGGGACCACATTCATAG，SEQIDNO.8)进行PCR扩增，回收扩增片段。用BamHI和StuI对扩增产物进行双酶切，将酶切产物插入到BamHI和StuI双酶切后的载体pBI220(JeffersonRA,KavanaghTA,BevanMW.GUSfusions:beta-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ.1987,6:3901-3907.)，将NLR1-V置于35S启动子后面的多克隆位点处。由此将目标基因NLR1-V克隆到强启动子35S的下游，获得表达载体pBI220:NLR1-V(图1)。经测序验证，表明载体构建成功。实施例4利用瞬间表达方法将NLR1-V基因转入小麦叶片瞬间表达方法是一种可靠且快速鉴定基因功能的方法(Schweizer,Pokornyetal.ATransientAssaySystemfortheFunctionalAssessmentofDefense-RelatedGenesinWheatMolecularPlant-MicrobeInteractions.1999,12:647-654.)。本研究利用瞬间表达方法，将质粒DNA包裹到金属微粒外层，借助基因枪将金属微粒和基因轰击到小麦叶片的表皮细胞，然后统计轰击NLR1-V细胞的白粉菌吸器指数与未轰击NLR1-V细胞的白粉菌吸器指数，明确目标基因是否具有白粉病抗病功能。载体DNA与金属微粒包裹的程序如下：制备钨粉：称取30mg的钨粉于1.5mleppendorf管中，加入1ml70％酒精，涡旋3-5min后静置15min，使钨粉完全沉淀。12000rpm离心1min后弃上清。加入1mlddH2O水，涡旋混匀后，离心弃上清(重复三次)。最后加入500μl50％甘油涡旋混匀，以备用。包裹子弹：吸取5μl涡旋均匀的钨粉于1.5ml的eppendorf管中，加入5μl质粒DNA(总量应为1μg)。边涡旋边向eppendorf管内滴加50μl2.5MCaCl2，然后加入20μl0.1M亚精氨(现配先用)，涡旋3min。静置1min后离心2s，弃上清。加入140μl70％酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。然后加入140μl100％酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。最后加入15μl100％酒精，充分涡旋，以备使用。实施GUS基因单转化时，将含有GUS基因表达载体pAHC25(ChristensenAH,QuailPH.Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,1996,5:213-218.)的质粒DNA与钨粉包裹；当实施NLR1-V与GUS基因共转化时，将含有NLR1-V基因表达载体pBI220:NLR1-V的质粒DNA与含有GUS基因表达载体pAHC25的质粒DNA按摩尔浓度1:1的比例混合，包裹钨粉。当GUS基因与NLR1-V基因进行共转化时，Marker基因GUS转入的细胞也是NLR1-V转入的细胞。因GUS基因表达的细胞经染色整个细胞呈现蓝色，所以本研究以蓝色细胞作为NLR1-V的表达细胞。基因枪轰击程序如下：剪下长约6cm的小麦幼苗叶片端部，平行贴在载玻片上，每张玻片贴6片叶片左右。基因枪使用PDS1000/He系统，采用1350psi的可裂膜片，真空度为28inHg。轰击后将叶片置于垫有润湿滤纸的瓷盘内，罩以打有小孔的保鲜膜，保湿并透气，18-20℃恢复培养4h后，高密度接种白粉菌分生孢子。接种48h后用GUS染液(配方为：0.1mol/LNa2HPO4/NaH2PO4缓冲液(pH7.0)，含10mmol/LEDTA，5mmol/L铁氰化钾和亚铁氰化钾，0.1mg/mlX-Gluc，0.1％TritonX-100，20％甲醇)真空渗透10min,37℃染色12h，然后用70％酒精脱色2天直至叶片变成白色为止，最后利用浓度为0.6％的考马斯亮蓝对白粉菌孢子染色。实施例5NLR1-V抗病功能的分析白粉菌侵入小麦叶片表皮细胞后，在表皮细胞中产生的指状物称为吸器。吸器不能正常产生是叶片细胞对白粉菌具有抗性的重要指标。在GUS表达的细胞中，吸器会被GUS染色液染成蓝色，在显微镜下容易辨认(图3)。在GUS基因转化细胞后，通过统计与白粉菌互作的GUS表达细胞中，吸器形成的细胞所占的比例(％)，即为“吸器指数”(Schweizer,Pokornyetal.ATransientAssaySystemfortheFunctionalAssessmentofDefense-RelatedGenesinWheatMolecularPlant-MicrobeInteractions.1999,12:647-654.)。吸器指数越小，表明抗病性越强。本研究利用“吸器指数”作为抗病强弱的衡量指标。当单转化GUS基因时，感病小麦扬麦158的吸器指数为41.33％(统计了675个互作细胞)，当GUS基因与NLR1-V共转化感病小麦扬麦158后，统计了GUS基因表达(即NLR1-V表达)且有白粉菌互作的细胞的吸器指数，结果表明当NLR1-V转入后，扬麦158的吸器指数从41.33％降到19.23％(统计了603个细胞)(图4)。该结果说明，NLR1-V能显著降低吸器指数，对白粉菌具有抗病作用。<110>南京农业大学<120>一个NLR类基因NLR1-V及其表达载体和应用<160>8<210>1<211>2730<212>DNA<213>普通小麦（TriticumasetivumL.）南农9918<220><223>NLR1-V<400>1atgtctgcaccggtcgtcagcgccaccatgggggcgatgaaccccctcatcggcaagctc60gccgcactgattggtgacgagtacaagaaactcacaggggtgaggagacaggcctccttc120ctcaaggatgagcttagcgccatgaaagctctccttgagaagcttgagctcatggatgaa180ctggatcccttggccaagaactggagggattatgtccgggagatgtcctacgacatggag240aattgcattgatgacttcatgcgagaccttggaggtgccgatgcaaagacgggctttatc300aagaagacggctaaacgtctcaagacgttgcggaagcgtcatcgtattgctgatcggatg360gaagagctcaaggggcttgctttgcaagcaaatgaacgacgcatgaggtacaagattgat420gattgcgccaattctaccaatcgtgtcgttcccatcgatactcggatgttggcaatctac480aagcaggcaacggggcttgttggtattgatggcccaaagaaagagcttgtaagttggttg540acagatactcaggaaaaactcaaggtggtggctattgttggatttggaggccttggtaaa600actacacttgccaaacaagtatatgatacgattggagggcaattcagctgtaaaatattt660ttctctgtttctcaaagacctgatatgtcaagcctccttcgtggtctccaatcggagctt720aatatggaagaggagttaactcagcctcacgaggtgcaacacatcattggccgtcttaga780gaatatctcacacataagaggtaccttattgttgttgatgacttgtggtatcaatcaaca840tggaatatcatgagttgtatctttccagaagtcgggaatggaagtagagtaatagtaact900acacgagtggaggatgtggctatttgggcatgtcgtgatgaccatgagtgtgtttataga960atggaacccctcaaagaacaagactcaagaatgctgttctgtaatagagtatttggttcc1020ggatatgcctgtccactgccgttaaaaaaagtttcagatgaaattttgaagaagtgtgga1080gggttgccacttgcaattatcactatagctagtctattagcaagtcgtcaagcaagatca1140gacgagtgggagagcataagaaattgtttgggcgctaagcttgccataaattccaccttg1200gaagagatgaggagtatactgaaccttagctacatgcatcttcctcttcatctccgtcca1260tgtctcctgtactttggcatgtatccagaagacaaaattatcaggaggcgtgacatggtt1320ctacagtgggtagccgaaggctttgtcaataattctcatggatctaatctagaggatgtt1380gcagagagttatttcaatgagcttatcaatagaagtctaattcagcctggagaatccata1440gatggaaagattgagtcttacaaagtacacgatatgatgcttgatttgatcctcagcaag1500tgtgcagaaaataattttataagtgtggcatataattgtgaagacgtggcaagaatgcat1560ggccgcgaatacaaggtccgtagattgtccttgacttcaagtgctaacgatgcaacatca1620gaaaacattcatactagcatgcaacaaattcgctcattttcatgctttggagagcctaaa1680tacacacctcctcttttgctatttaaataccttcgggtgctagtgtttatatcctcagac1740gcgtttggtccgatagtggaccttactgctattggtcaattgtttcagctaaggtatgtc1800aaggtttctgcttcatacggaatagattttcctaccgaatttcgcaagcttgttcatttg1860gagacgctggaagtatctggtttttcaccaagcatcccgtcagatattgtttgcttgcca1920cggttatctcgtctgatccttccgtgtcttacacgtcttcctcaagggattgccaacata1980aaatcattgcgtgcattgcactgtatggagcacatctcgctagaggatattaatggcctt2040ggcgagctgaccagtctgagggagctgaggctttacactaaaatggtggcgggtgaagtt2100gatgctttggtatccctaattggaaagctccatgacctaaaatacctcgcggtctctgtt2160gagtcttctaaacatcattgcgacccgttgtactcattatcaaaccctcctctccatatc2220gaggaacttgatctgtacgggtggacactgaagagagttcccacatggattggtgacctc2280catttccttcggatcctggatttgtgtgtctacaacttgttgaacgacgaggttcatgtt2340gtgggaaatcttccctgcctcgtccatctgcgtctaagggtgttcgctgaaggcggggcc2400gtaatctgcacgggcttattccaagtcctgaaagtccttcgtctcttctctcatgatgtg2460gaagacatgcagtttcagatagggctaatgcccagcctgcgacagctcactctagaagta2520aataatggctggggtggtgctgtgcctcgaggcatggagcacctattggccctcgatcac2580atctctgtatttgccagacgcggcgtcaatcaccgtgatgtcgagtctgccttcagaagc2640gtcttcgatgtgcacccaagacaaccttccttagaaataatacctgatgttcccctcagt2700tctatgaatgtggtcccagttttactttaa2730<210>2<211>909<212>PRT<213>普通小麦（TriticumasetivumL.）南农9918<220><223>蛋白NLR1-V<400>2MetSerAlaProValValSerAlaThrMetGlyAlaMetAsnProLeu151015IleGlyLysLeuAlaAlaLeuIleGlyAspGluTyrLysLysLeuThr202530GlyValArgArgGlnAlaSerPheLeuLysAspGluLeuSerAlaMet354045LysAlaLeuLeuGluLysLeuGluLeuMetAspGluLeuAspProLeu505560AlaLysAsnTrpArgAspTyrValArgGluMetSerTyrAspMetGlu65707580AsnCysIleAspAspPheMetArgAspLeuGlyGlyAlaAspAlaLys859095ThrGlyPheIleLysLysThrAlaLysArgLeuLysThrLeuArgLys100105110ArgHisArgIleAlaAspArgMetGluGluLeuLysGlyLeuAlaLeu115120125GlnAlaAsnGluArgArgMetArgTyrLysIleAspAspCysAlaAsn130135140SerThrAsnArgValValProIleAspThrArgMetLeuAlaIleTyr145150155160LysGlnAlaThrGlyLeuValGlyIleAspGlyProLysLysGluLeu165170175ValSerTrpLeuThrAspThrGlnGluLysLeuLysValValAlaIle180185190ValGlyPheGlyGlyLeuGlyLysThrThrLeuAlaLysGlnValTyr195200205AspThrIleGlyGlyGlnPheSerCysLysIlePhePheSerValSer210215220GlnArgProAspMetSerSerLeuLeuArgGlyLeuGlnSerGluLeu225230235240AsnMetGluGluGluLeuThrGlnProHisGluValGlnHisIleIle245250255GlyArgLeuArgGluTyrLeuThrHisLysArgTyrLeuIleValVal260265270AspAspLeuTrpTyrGlnSerThrTrpAsnIleMetSerCysIlePhe275280285ProGluValGlyAsnGlySerArgValIleValThrThrArgValGlu290295300AspValAlaIleTrpAlaCysArgAspAspHisGluCysValTyrArg305310315320MetGluProLeuLysGluGlnAspSerArgMetLeuPheCysAsnArg325330335ValPheGlySerGlyTyrAlaCysProLeuProLeuLysLysValSer340345350AspGluIleLeuLysLysCysGlyGlyLeuProLeuAlaIleIleThr355360365IleAlaSerLeuLeuAlaSerArgGlnAlaArgSerAspGluTrpGlu370375380SerIleArgAsnCysLeuGlyAlaLysLeuAlaIleAsnSerThrLeu385390395400GluGluMetArgSerIleLeu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