植物抗病相关基因LLG1及其应用的制作方法

本发明涉及植物抗病相关基因LLG1及其应用。LLG1基因的突变可以抑制拟南芥突变体edr1对白粉病、假单胞细菌以及卵菌的抗性，并参与调控对病原菌的抗性应答。本发明属于基因工程领域。

背景技术：

白粉菌是一种重要的植物病害，属子囊菌纲的寄生型真菌，在世界各地分布广泛，可侵染近万种植物，包括重要农作物如小麦和大麦，对农业生产造成巨大危害。白粉菌侵染植物后，产生的孢子可覆盖在植物的茎、叶、花序以及果实的表面，成白色蛛网状或形成白粉状的一层，故称为白粉病。在环境条件适宜的情况下，白粉菌可大量繁殖，影响植物的生长和发育，严重发病时甚至造成叶片枯落及死亡。与白粉菌相似，假单胞杆菌细菌及卵菌也能侵染多种植物，对农业生产造成很大危害。

为了抵抗各种病原微生物的侵染，植物进化出多种策略来进行防卫。通常植物防卫反应分为两个层次，即基础抗性和抗病基因介导的抗性。基础抗性通过位于细胞膜上的模式受体（Pattern Recognition Receptor, PRR）识别病原菌相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns ,PAMPs)，从而触发PAMP引起的免疫反应，也称为PTI，是防卫反应的第一层次。而病原菌在长期的进化过程中产生了新的机制来抑制PTI，如细菌通过三型分泌系统，真菌通过吸器向植物体内释放效应因子(effector)。有些效应因子又被称为无毒蛋白(Avr protein)，能够被抗性（Resistance, R）基因编码的蛋白所识别。这一层次的防卫反应也被称为效应因子触发的免疫反应(effector-triggered immunity, ETI)。

前期的研究发现拟南芥edr1突变体表现出增强的白粉菌抗性及白粉菌诱导的细胞死亡表型。EDR1基因编码一个Raf-like蛋白激酶，具有激酶活性。遗传学分析实验显示edr1突变体的表型能够被pad4，sid2，npr1等突变体抑制，表明edr1的表型需要水杨酸信号途径的作用。但是，目前我们对于EDR1介导细胞死亡和植物抗病反应的分子机制依然知之甚少。为了寻找调控植物抗性相关基因，我们进行了edr1抑制子突变体的筛选。我们得到了其中一个突变体，通过图位克隆，我们获得了相应的基因LORELEI-LIKE-GPI-ANCHORED PROTEIN 1，即LLG1。通过对该基因的功能分析，我们首次发现LLG1对植物抗病反应具有重要的作用。我们的结果表明LLG1是创建抗病性增强的转基因作物和作物分子设计的优良候选基因，具有重要的理论价值和广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供植物抗病相关基因LLG1及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一个拟南芥抗病相关基因LLG1的序列， CDS全长507bp。其CDS全长序列如SEQ ID NO.1所示。

LLG1基因编码的蛋白序列，编码168个氨基酸，大小18.46Kd。其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示.

LLG1突变之后能够抑制edr1对白粉菌的抗性。

LLG1在抗白粉病、假单胞细菌以及卵菌中的应用。LLG1可以应用到基因工程技术领域，提高作物的抗病反应。

本发明的优点在于：为了寻找调控植物抗性相关基因，我们进行了edr1抑制子突变体的筛选。我们得到了其中一个突变体，通过图位克隆，我们获得了相应的基因LLG1。通过对该基因的功能分析，我们首次发现LLG1对植物抗病反应具有重要的作用。我们的结果表明LLG1是创建抗病性增强的转基因作物和作物分子设计的优良候选基因，具有重要的理论价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1. 拟南芥野生型、edr1突变体及edr1 llg1在生长4-5周后接种白粉病菌Golovinomyces cichoracearum UCSC1, 在侵染第8天后的表型（A），对侵染叶片进行台盼蓝（Trypan blue）的染色结果（B）以及单孢子分生孢子梗定量的计数结果（C）。

图2. 拟南芥野生型和edr1突变体及edr1 llg1在生长2周后接种卵菌（H.aNoco2）7天后对孢子定量的结果（A），以及生长4周后接种丁香假单胞杆菌（Pto DC3000）3天之后菌落单克隆的数量统计的结果（B）。

图3. 通过图位克隆的方法克隆LLG1基因的略图（a），以及LLG1基因结构、蛋白序列和突变位点（b）, LLG1基因均可互补llg1对edr1突变体的抑制（(图3c，d)。其中图3c显示白粉菌生长表型，图3d显示图3c植株中白粉菌定量分析结果。

具体实施方式

实施例1 llg1突变抑制edr1突变体抗白粉病表型分析

（1）材料与方法

对拟南芥edr1突变体进行EMS诱变，并对其M2代进行抑制子突变体筛选，鉴定到了一个能够抑制edr1对白粉病菌抗性的突变体，随后对突变基因进行了图位克隆，我们根据其编码蛋白将该基因命名为LLG1。

将拟南芥野生型植株Col-0,及突变体种植在22℃，9小时光照的温室中，生长5周后，接种白粉病菌。在接菌8天后进行抗病表型鉴定，对典型的叶片照相，并对具代表性的叶片进行台盼蓝染色(Trypan Blue Staining)，以观察白粉菌的生长情况。

为了定量分析植物的抗性，将上述植物在相同的条件下生长5周后，少量接种白粉病菌，在接菌5天之后，对叶片进行台盼蓝染色，在显微镜下进行单孢子分生孢子梗计数。对20-30单孢子的计数结果进行统计分析。

（2）结果与分析

在白粉菌接菌8天之后，在野生型Col-0的叶片表面产生大量的白粉菌，而edr1突变体的叶片上只支持少量白粉菌的生长，并且出现明显的细胞死亡。而edr1 llg1突变体在白粉菌接菌8天之后，在其叶表面并不产生类似edr1的细胞死亡，而是与Col-0类似，有大量的孢子附着（附图1 A）。为了更好的观察白粉菌接菌后的表型，对其进行了台盼蓝染色（附图1 B），由图可见，edr1染色后可见明显的细胞死亡，并且只产生少量的孢子，而Col-0和edr1 llg1均不出现细胞死亡，而是产生大量的菌丝和孢子。对各种基因型叶片上的单孢子上产生的分生孢子数量进行了定量分析，结果显示edr1分生孢子数明显低于野生型Col-0，而llg1抑制了edr1的抗病表型（附图1C），这些结果表明edr1对白粉菌的抗性及白粉菌诱导的细胞死亡需要LLG1。

实施例2llg1突变体抑制edr1突变体其它病原菌的表型分析

（1）材料与方法

将拟南芥野生型植株Col-0，edr1突变体，edr1 llg1种植在22℃，9小时光照的温室中，生长2周。将pad4突变体上生长7天的卵菌 (H. a. Noco2) 作为菌源，用水涡旋震荡将卵菌孢子稀释至5×10⁴/ml。用喷壶将孢子均匀喷洒到2周大小的植物叶片表面。苗盘覆盖上透明盖子，用胶带密封四周保湿，放置在培养箱里(温度16℃，相对湿度90%)中，7天后观察抗病表型，并用血细胞计数板进行孢子计数。

将丁香假单胞菌（Pto DC3000）在含有相应抗性的KB固体培养基上划线培养12 h，用10 mM的MgCl₂收集在培养基上生长的细菌，通过梯度稀释至浓度为OD₆₀₀=5x10^-4。将细菌注射到4周大小的拟南芥叶片背面，在注射3 h后取样，作为0天的对照。用打孔器取叶片。加入600 μl的10 mM MgCl₂，充分研磨叶片，所得的叶片匀浆液稀释至10^-1和10^-2两个浓度，涂于KB平板，28℃培养2-3天后，对培养基上的菌落计数。对侵染3天后的叶片再一次用打孔器取样，计数的步骤同上。

（2）结果与分析

对于丁香假单胞杆菌，定量结果显示edr1对PtoDC3000表现出增强的抗病性，支持细菌生长的数量显著低于野生型。而在edr1 llg1则比野生型更感病。表明llg1完全恢复edr1对丁香假单胞杆菌Pto DC3000的抗病性。

对卵菌统计结果显示，拟南芥野生型植株Col-0支持大量的卵菌的孢子生长，而在edr1中这一数量显著降低。表明edr1对卵菌具有抗病性。而在edr1 llg11中，孢子的数量甚至高于野生型，表明llg1能够完全抑制edr1对卵菌的抗病性。

在对丁香假单胞杆菌及卵菌的抗性反应中，LLG1基因均可互补llg1对edr1突变体的抑制。

实施例3 LLG1基因的图位克隆

（1）材料与方法

为了克隆抑制子基因，我们将edr1 llg1突变体与拟南芥野生型Landsberg生态型植株进行杂交，获得的F1代植株自交产生F2代群体。从F2代植株中选择含有edr1突变但与edr1 llg1突变体表型相似的40个单株，用均匀分布在拟南芥染色体组上的粗定位标记(http://signal.salk.edu/genome/SSLP_info/SSLPsordered.html)进行基因型鉴定。粗定位的结果表明LLG1定位在5号染色体。随后，我们设计了精细定位的标记，对2000株左右的F2植株进行基因型鉴定，把LLG1定位到MDA7这个BAC克隆中。对该区域内所有基因进行测序，找到突变基因（附图3）。

（2）结果与分析

我们对测序结果进行分析，发现在LLG1 (AT5G56170)这个基因的有一个G--A的碱基变化，导致蛋白序列第114位氨基酸的变化(G114R) (图3a，b)，而LLG1基因可互补llg1对edr1突变体的抑制（(图3c，d)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 植物抗病相关基因LLG1的克隆及其应用

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<400> 1

000

<210> 2

<211> 168

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 2

Met Glu Leu Leu Ser Arg Ala Leu Phe Phe Phe Leu Leu Leu Ser Val

1 5 10 15

Leu Ser Ser Phe Ser Ser Ser Ser Phe Ile Ser Asp Gly Val Phe Glu

20 25 30

Ser Gln Ser Leu Val Leu Gly Arg Asn Leu Leu Gln Thr Lys Lys Thr

35 40 45

Cys Pro Val Asn Phe Glu Phe Met Asn Tyr Thr Ile Ile Thr Ser Lys

50 55 60

Cys Lys Gly Pro Lys Tyr Pro Pro Lys Glu Cys Cys Gly Ala Phe Lys

65 70 75 80

Asp Phe Ala Cys Pro Tyr Thr Asp Gln Leu Asn Asp Leu Ser Ser Asp

85 90 95

Cys Ala Thr Thr Met Phe Ser Tyr Ile Asn Leu Tyr Gly Lys Tyr Pro

100 105 110

Pro Gly Leu Phe Ala Asn Gln Cys Lys Glu Gly Lys Glu Gly Leu Glu

115 120 125

Cys Pro Ala Gly Ser Gln Leu Pro Pro Glu Thr Ser Ala Glu Val Asn

130 135 140

Ala Ala Thr Thr Ser Ser Ser Arg Leu Trp Leu Thr Val Ser Ala Ala

145 150 155 160

Leu Leu Val Phe Val Lys Leu Phe

165