一种植物抗病必需基因ShORR‑1及其应用的制作方法

本发明涉及一种植物抗病必需基因及其应用，属于生物技术领域。

背景技术：

番茄是一种很好的用于遗传研究的茄科模式植物，具有丰富标记的多个遗传连锁图和物理图谱，其全基因组测序也已经完成和公布(http：//solgenomics.net/)。番茄具有很大的经济价值，是一种栽培最广泛的蔬菜作物之一。根据FAO的统计，2013年世界番茄总产量已达1.639亿吨，约占世界蔬菜(含瓜类)总产量的14.43％。我国番茄总产量达到了0.506亿吨，约占世界番茄生产总量的30.8％。可见番茄在中国乃至世界蔬菜生产和供应中具有举足轻重的地位。但是病虫害严重影响番茄生产，不仅导致减产也因农药的施用而增加了番茄生产成本和环境污染，据估计，病虫害可以造成番茄减产达30％-80％，因喷施农药增加成本达10％-15％。

番茄白粉病是一种非常严重的世界性植物病害，特别是在温室生产番茄上尤为严重(Jones et al.，2001)，番茄白粉病不仅影响番茄产量还影响番茄质量。由于抗病番茄品种较少，目前防治这种真菌病害的方法主要靠施用杀菌剂，造成了蔬菜农药残留和环境污染，因此是无公害番茄生产的一个障碍。该病害的致病菌是番茄白粉菌(Oidium neolycopersici)，番茄白粉菌是一种活体寄生真菌，只侵染番茄表皮细胞。近年来，番茄白粉病在中国也被发现并在各地频频爆发，我们也对番茄白粉病致病菌进行了形态学和核糖体转录单元间隔区(ITS)序列的分析，明确了该致病菌为番茄白粉菌中国菌系，并在国际上进行了报道(Li et al.，2008)。

番茄晚疫病是由半活体寄生类型病原物-致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的真菌病害，一直是世界范围内番茄生产的重大病害之一。在我国晚疫病不仅危害南方番茄生产，对北方保护地番茄生产也造成了很大的危害，一般年份减产可达30％，发病严重年份可以达到80％以上(薛敏菊等，2002；冯兰香等，2004；赵同敏等，2006)。近年来，由于番茄周年生产、保护地生产环境利于晚疫病发生、长期施用农药导致病菌抗药性提高、我国生态环境多样等因素，致病疫霉引起的晚疫病频繁爆发成为周年病害(薛敏菊等，2002；赵同敏等，2006)。

番茄黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的一种土传腐生真菌病害，是影响番茄生产特别是保护地番茄生产的重要病害，近年来该病害在我国已经由次要病害变为主要病害(雷娜等，2011)。虽然2个番茄抗黄萎病基因Ve1和Ve2被克隆(Kawchuk et al.，2001)，Ve1基因介导的抗病反应信号途径及其与Cf基因介导的信号途径的重叠也被诠释(Fradin et al.，2009)，但是，对该病菌与番茄的互作机理仍不清楚。

番茄Rcr1和Rcr2是Cf-9介导对携带Avr9叶霉病菌抗性反应的必需基因(Hammond-Kosack et al.，1994)；Rcr3是Cf-2介导对携带Avr叶霉菌抗性反应的必需基因(Dixon et al.，2000；Rooney et al.，2005)。Rar1和Rar2被发现是大麦白粉病(Bgh)抗病基因Mla、Mih和Mlk介导抗性反应的必需基因；Ror1和Ror2是mlo介导抗性反应必需基因(Freialdenhoven et al，1994and 1996)(图1，引自Li，2005)。虽然这类必需基因最初往往在特定的植病体系被发现，但是越来越多研究表明这些必需基因参与了不同R基因介导的抗性反应，例如RAR、SGT1和HSP90是参与不同R基因介导的抗性反应的必需基因(Azevedo et al.，2002；Takahashi et al.，2003；Austin et al.，2002)。因此，研究必需基因可以为持久和广谱抗性机理提供依据。

病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)是一种快速高效的功能基因组学研究方法(van Kammen，1997；Senthil-Kumar and Mysore，2014)，克服了传统功能基因组学研究技术的局限性，具有快速、不需要植物转化和可以对基因家族进行基因沉默的优点。除此之外，VIGS还可以在物种间和物种内不同遗传背景的植物间进行基因功能的比较(Burch-Simith et al.，2004)。VIGS已经被成功地用来理解多种植物抗病反应，例如，烟草NPR1基因介导的烟草花叶病毒抗性反应必需基因的鉴定和功能分析(Liu et al.，2002a&b)；NPR1和TGA转录因子在Pto介导的番茄细菌性斑点病抗性反应中的功能鉴定(Ekengren et al.，2003)；叶霉病诱导番茄快速表达基因的功能分析(Rowland et al.，2005)。TRV病毒载体介导的VIGS具有其他病毒载体不具有的快速、易操作等优点(Senthil-Kumar and Mysore，2014)，另外，TRV介导的VIGS能够在生长点分生组织中起作用和能够达到持久基因沉默的效果(Ratcliffet al.，2001)。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种植物抗病必需基因，名称为ShORR-1，来源于番茄属番茄(Solanum lycopersicum)，其特征在于其核苷酸序列如以下1)或2)所示：

1)其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；

2)在1)限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有植物抗病活性的核苷酸序列。

所述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

所述核苷酸序列的重组载体。

所述载体为用于克隆的pMD18-T载体、用于表达的pSAT6-GFP-N1、pCAMBIA1300、pCAMBIA2300载体和用于VIGS的pYY13载体。

所述核苷酸序列的转基因细胞系或重组菌。

所述核苷酸序列在植物组织表达中的应用。

所述植物组织为根、茎、叶、花或种子。

所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

所述单子叶植物为水稻、小麦、高粱及玉米，所述双子叶植物为番茄、烟草、大豆及土豆。

所述基因或权利要求2所述蛋白在培育抗病植物中的应用，所述抗病为白粉病、晚疫病及黄萎病。

本发明的技术效果：首先将ShORR1基因构建到TRV介导VIGS的载体pYY13中，获得重组载体pYY13-ShORR1，将重组载体和空载转入农杆菌用于进一步的转化，利用农杆菌浸润法对抗白粉病野生番茄(S.habrochiates G1.1560)叶片进行转化；然后对ShORR1基因沉默和空载对照植株的叶片接种白粉菌进行了感病性和显微分析。感病性和显微分析显示，接种白粉菌7d后，未进行ShORR1基因沉默的对照抗病植株G1.1560表现为抗病，其叶片上接种的白粉菌分生孢子大部分没有萌芽，而萌发孢子形成的吸器则引起其侵染叶片表皮细胞的过敏反应(细胞坏死)，无法从叶片细胞获取充足的营养，进而菌丝生长受到抑制，无法形成新的分生孢子和完成整个无性繁殖周期(图1)。ShORR1基因沉默的抗病植株G1.1560叶片表现为感病，其叶片上接种的白粉菌分生孢子能够正常萌芽，形成的吸器没有引起侵染叶片细胞的过敏反应，菌丝正常生长并形成了分生孢子梗和新的分生孢子，能够完成整个无性繁殖周期(图1)，进行新一轮的侵染。结果表明，ShORR1基因是番茄白粉病抗性反应的关键基因。

利用TRV介导的VIGS分析ShORR1在番茄黄萎病抗性反应中的作用显示，接种黄萎病致病菌大丽轮枝菌的高抗枯、黄萎病的番茄(S.lycopersicum LA1221)一周后，携带pYY13空载农杆菌转化和清水接种对照植株离体叶片未表现出感病症状(图2)；携带pYY13-ShORR1重组载体农杆菌转化的ShORR1基因沉默植株离体叶片表现出明显感病症状(图2)。结果表明，ShORR1基因是番茄黄萎病抗性反应的关键基因。

将携带ShORR1基因重组载体pYY13-ShORR1、空载以及番茄八氢番茄红素脱氢酶(PDS)重组TRV-VIGS载体(pYL252)分别转入农杆菌，通过农杆菌浸润法将携带pYY13-ShORR1农杆菌和携带pYL252农杆菌共同浸润八周龄本生烟草(Nicotiana benthamiana)叶片中，同时以清水和携带pYL252农杆菌浸润本生烟草叶片作为对照。接种10～15d后观察表型变化，待烟草叶片白化后，分别在处理和对照植株的叶片上接种晚疫病菌致病菌(注：本研究发现，本生烟对致病疫霉菌表现极强抗病性)。经DAB和台盼蓝染色，在显微镜下对接种叶片进行观察，实验表明，ShORR1基因沉默本生烟草叶片对致病疫霉菌表现为感病(图3A-B，箭头所指为致病疫霉菌丝)，产生了游走孢子与菌丝，而对照植株叶片表现出过敏反应(细胞坏死)，无游走孢子和菌丝和菌丝产生。结果表明，ShORR1基因是本生烟晚疫病抗性反应的关键基因。

附图说明

图1表示VIGS沉默ShORR-1基因的白粉病抗性番茄S.lycopersicum G1.1560接种白粉菌的表型和显微观察；A示ShORR-1基因沉默叶片接种白粉菌后表现为感病，红色箭头示白粉菌菌落；B示ShORR-1基因沉默后叶片接种白粉菌后形成的新生分子孢子梗；C示对照植株接种白粉菌表现为抗病；D对照植株叶片接种白粉菌后引起被侵染叶片的过敏反应(细胞坏死)。

图2表示VIGS沉默ShORR-1基因的黄萎病抗性番茄(S.lycopersicum LA1221)接种大丽轮枝菌孢子悬液的表型观察；A示ShORR-1基因沉默植株在大丽轮枝菌孢子悬液中表现为感病，对照植株表现为抗病，B示ShORR-1基因沉默植株和对照植株在清水中均表现为抗病，红色箭头所指为沉默植株叶片，黑色箭头所指为对照植株叶片。

图3表示VIGS沉默ShORR-1基因的本生烟草接种致病疫霉菌的表型和显微观察；A示ShORR-1基因沉默植株叶片接种致病疫霉菌后，表现为感病表型，红色箭头示新生菌丝；B示ShORR-1基因沉默植株叶片接种致病疫霉菌后，叶片气孔中穿出的新生菌丝；C示对照植株叶片接种致病疫霉菌表现为抗病表型；D示对照植株叶片接种致病疫霉菌后，表现出过敏反应(坏死细胞)。

图4表示番茄ShORR-1和PDS基因沉默的半定量RT-PCR结果；左：对照番茄植株；右：沉默番茄植株；20、25、30、35表示不同的PCR循环数；Actin转录本为内参对照。

图5表示ShORR-1在番茄不同组织中的表达量。

图6表示ShORR-1在番茄白粉菌侵染番茄不同时期的表达量变化。

图7表示ShORR-1在致病疫霉菌侵染番茄不同时期的表达量变化。

图8表示ShORR-1在大丽轮枝菌侵染番茄不同时期的表达量变化。

具体实施方式

下面通过实例对本发明作进一步阐述，其目的在于更好理解本发明内容而非限制本发明的保护范围。

本发明拟进一步对ShORR-1基因互作的基因及其参与的相关信号通路进行分析，并分析ShORR-1基因是否具有更广谱的抗性作用。通过分析该基因在不同病原微生物诱导的番茄效应蛋白激活的免疫反应(ETI)及病原相关分子模式激活的免疫反应(PTI)中的作用，以期丰富植物与病原微生物互作理论，并为番茄广谱抗病品种培育提供依据和基因来源。

实施例

实施例一 VIGS实验

1材料与方法

1.1 植物材料、病原菌及其培养方法

供试的番茄品种包括番茄栽培种(S.lycopersicum)：Moneymaker(MM)、Microtom(MT)、LA1221；番茄野生种：S.habrochaites G1.1560；本生烟草：N.benthamiana。白粉菌来自河南省周口师范学院保存的感病番茄植株MM叶片，保存于气候箱的MM植株上，温度：20±2℃，相对湿度(RH)：75％，光/暗周期：16h/8h。致病疫霉菌T124生理小种由中国农业科学院生物技术研究所李君明研究员馈赠，在黑麦培养基上扩繁生长，温度：20±2℃。大丽轮枝菌由中国农业科学院棉花研究所植物保护研究室朱荷琴研究员惠赠，在察氏培养基上扩繁生长，温度：25±2℃。所有的植株生长在条件适宜的气候室中，温度：20±2℃，光/暗周期：16h/8h，光强度：150μmol/m²·s。

1.2 所用载体

VIGS实验所用沉默载体为烟草脆裂病毒(TRV)的RNA1和RNA2cDNA的双元表达载体，分别为TRV1(pYL192)和TRV2(pYY13)。TRV1载体包括编码RNA依赖的RNA聚合酶、运动蛋白和16K蛋白的基因，是VIGS体系的辅助病毒载体。TRV2-LIC载体包括衣壳蛋白(Cp)基因、多克隆位点(MCS)等，用于目的基因的构建。pYY13衍生于载体pYL170(Burch-Smith et al.，2006)。为了高通量地克隆目的片段于TRV2-VIGS载体中，采用了一个改良的不依赖连接的克隆(ligation independent cloning，LIC)方法，将两个LIC接头加到pYL170上，形成载体pYY12，接头包含15bp的序列和中间的Pst I限制性酶切位点。接着通过Pst I酶切，在两个LIC位点间插入了一个ccdB基因，形成载体pYY13(图1)。ccdB是一个致死基因，可以快速、准确地筛选出重组载体。

1.3 RNA的提取、cDNA合成和RT-PCR扩增目的基因

番茄总RNA的提取方法按照总RNA提取试剂盒操作说明书进行(TaKaRa)。以1μg的RNA做模板，按照cDNA合成试剂盒(TaKaRa)操作说明合成第一链cDNA。八氢番茄红素脱氢酶基因(Phytoene desaturase，PDS)是检验VIGS载体系统是否有效的报告基因。根据番茄PDS基因序列(Gene Bank登录号M88683)，选取位于PDS基因中部的序列为目标片段设计上游和下游引物。采用电子克隆的方法，对番茄白粉菌抗病基因候选序列进行cDNA步移，根据步移后的序列，设计带有TRV2-LIC载体接头的引物。上游引物：5’-CGACGACAAGACCCT-基因特异序列-3’，下游引物：5’-GAGGAGAAGAGCCCT-基因特异序列-3’，下划线为LIC接头序列，基因特异性引物序列见表1-1。RT-PCR反应体系(20μL)：10×PCR反应缓冲液2μL，dNTP混合物(各2.5mmol/L)1.6μL，Mg²⁺(25mmol/L)1.6μL，引物(10pm/μL)各1μL，Taq聚合酶(5U/μL)0.2μL，模板cDNA 2μL，ddH₂O10.6μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

表1 RT-PCR扩增目的基因的引物序列

Table1 The sequences of primers used in RT-PCR of objective genes

1.4 TRV2-LIC重组载体的构建

目的基因的PCR产物，按照宝生物(Takara)Agarose Gel DNA Purification Kit试剂盒操作进行纯化。限制性内切酶Pst I单酶切TRV2-LIC质粒后，再用T₄ DNA聚合酶酶切目的基因和TRV-LIC载体。T₄ DNA聚合酶酶切目的基因反应体系：目的基因6μL，T₄ DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，dATP(2.5mmol/L)0.5μL，BSA(0.1％)1μL，10×buffer 1μL，ddH₂O 1μL。T₄DNA聚合酶酶切TRV2-LIC载体反应体系：质粒单酶切产物6μL，T₄ DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，dTTP(2.5mmol/L)0.5μL，BSA(0.1％)1μL，10×buffer 1μL，ddH₂O 1μL。最后将酶切后的质粒和目的基因进行LIC连接，反应体系：质粒1μL，目的基因6μL；反应条件：65℃，2min，然后22℃，10min。连接产物转化感受态E.coli DH5α，涂布LB平板(50mg/L Kana)培养，37℃过夜倒置培养形成单菌落。

1.5 TRV2-LIC重组载体的鉴定

TRV2-LIC空质粒携带一个ccdB基因，可编码一种干扰大肠杆菌DNA促旋酶的蛋白质，对大肠杆菌有致死效应，如果载体发生自连，转化这些载体的大肠杆菌宿主细胞就会死亡，只有当外源DNA片段与载体连接后，ccdB基因的表达受到阻断，重组质粒才能在大肠杆菌中存活，因此有利于高效获得阳性克隆。挑取TRV2-LIC重组质粒转化E.coli DH5α后形成的单克隆，提取质粒进行PCR鉴定。阳性质粒转化至感受态农杆菌GV3101，涂布LB平板(50mg/L Kana、50mg/L Rif)培养，28℃倒置培养2d，挑选阳性克隆转化农杆菌GV3101。

1.6 农杆菌侵染和植株生长

以四叶期番茄G1.1560、LA1221和六叶期N.benthamiana为实验材料。TRV1、TRV2-LIC(空载)、TRV2-LIC(重组质粒)通过冻融法转化农杆菌GV3101。分别挑取农杆菌(TRV1和TRV2-LIC)单克隆于28℃培养过夜，各取10mL培养液，3000rpm，20min，离心收集菌体沉淀，分别重悬于缓冲液(10μmol/L MES，10μmol/L MgCl₂，200μmol/L乙酰丁香酮)内，OD₆₀₀＝1.0，将含有TRV1的农杆菌GV3101与含有TRV2-LIC(重组质粒)农杆菌GV3101 1∶1比例混匀，室温100rpm低速振荡2h。用去掉针头的一次性2mL注射器吸取活化的菌液，采用压迫法注射接种于番茄真叶背面(Mandar et al.，2008)。以TRV2-LIC(空载)为阴性对照。侵染番茄于20℃黑暗条件下培养过夜，之后在温度为20±2℃，光/暗周期为16h/8h的气候室中培养。农杆菌菌液注射G1.1560 10d后，将新鲜白粉菌的分生孢子从严重感染的叶片上冲洗下来，用水稀释为2×10⁴孢子/mL的浓度后用于接种。一周后观察番茄G1.1560的抗病表型的变化。每种沉默载体接种10株番茄幼苗，实验重复3次。

农杆菌感染N.benthamiana 10d后，在超净工作台中用无菌竹签挑取生长状态良好的致病疫霉菌菌丝分别涂在叶主脉、叶尖和叶边缘等处，挑取菌丝量保持一致，一周后观察N.benthamiana的抗病表型的变化。每种沉默载体接种10株N.benthamiana幼苗，实验重复3次。

农杆菌感染番茄LA1221 10d后，将新长出的LA1221新枝条分别侵润在10⁵孢子/mL大丽轮枝菌的孢子悬液和清水中，一周后观察番茄G1.1560的抗病表型的变化。每种沉默载体接种10株番茄LA1221幼苗，实验重复3次。

1.7 组织显微形态学分析

叶片组织H₂O₂的检测采用联苯胺(3，3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride，DAB)染色检测法，白粉菌采用台盼兰染色法(Huang et al.，1998)。具体步骤如下：

(1)DAB染色：取带柄的新鲜叶片，将其叶柄剪成斜面，插入1mg/mL的DAB(pH 3.8)溶液中，溶液浸过叶柄的斜面即可。置于光照下静置8h，肉眼可观察到棕红色的DAB溶液顺着叶脉到达叶片的顶端。反应时间可根据叶片的大小及具体条件来调整。

(2)固定：将DAB染色后叶片沿着中间的主叶脉剪切后，再切成1.5cm×1.5cm的小块，直接浸没于固定液中(无水乙醇∶冰醋酸＝3∶1)，至脱去颜色为止，通常过夜处理。

(3)台盼兰染色：叶片组织转入含有0.3％的台盼兰溶液中，将试管盖子轻轻旋开，置于加热的水浴锅中(70℃-80℃)，使染液沸腾1min。叶片组织于染液中过夜。

(4)脱色：用2.5g/mL的水合三氯乙醛冲洗被染色的叶片组织3次，样品可以于水合三氯乙醛中放置数月。

1.8 半定量RT-PCR分析

提取对照植株和沉默植株的总RNA。以1μg的RNA做模板，按照cDNA合成试剂盒(TaKaRa)操作说明合成第一链cDNA。采用半定量RT-PCR方法检测沉默植株中基因转录本的沉默效果。番茄Actin基因(GenBank登录号U60480)为内参基因，半定量RT-PCR引物序列见表4-2。PCR反应体系(20μL)：10×PCR反应缓冲液2μL，dNTP混合物(各2.5mmol/L)1.6μL，Mg²⁺(25mmol/L)1.6μL，引物(10pm/μL)各1μL，Taq聚合酶(5U/μL)0.2μL，模板cDNA 2μL，ddH₂O 10.6μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。为了避免PCR产物量到达平台期对实验结果的影响，进行了20、25、30和35不同循环数的扩增，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

表2 半定量RT-PCR的引物序列

Table2 The sequences of primers used in semi-quantitative RT-PCR

1.9 基因全长扩增

依据番茄全基因组序列进行基因步移，设计包含完整读码框的引物，RT-PCR扩增G1.1560的ShORR-1序列的基因全长并测序。扩增ShORR-1对应基因上游引物5’-ATTACTCTCTTCATAAACTCATTTCCA-3’，下游引物5’-TCTGCTGCTATTTCTGCCACT-3’。PCR反应体系(20μL)：10×PCR反应缓冲液2μL，dNTP混合物(各2.5mmol/L)1.6μL，Mg²⁺(25mmol/L)1.6μL，引物(10pm/μL)各1μL，pfu高保真酶(5U/μL)0.2μL，模板cDNA 2μL，ddH₂O 10.6μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物纯化后克隆至pMD18-T载体上，转化至E.coli DH5α感受态细胞中，质粒PCR鉴定阳性菌落后，交由南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.10 ShORR-1基因空间表达及接种不同病原物表达量分析

为了分析ShORR-1基因在不同组织中表达量及病原菌侵染后表达量的变化，取MT番茄的根、茎、叶、花、绿色果实和红色果实，提取RNA，反转录后分析ShORR-1的表达量。同时取约4w龄MT番茄植株，分别采用对接法接种番茄白粉菌和致病疫霉菌于番茄叶片，灌根法接种大丽轮枝菌于MT番茄的根部，在不同的时间点取样分析ShORR-1基因的表达量变化。实时荧光定量PCR反应体系：10μL 2×SYBR Premix Ex Taq，0.4μL PCR Forward Primer，0.4μL PCR Reverse Primer，2.0μL DNA模板，7.2μL ddH₂O；反应条件为：预变性95℃，10sec；95℃，5sec；58℃，30sec，该反应体系共40个循环，在BIO-RAD CFX96^TM Real-time System中分析基因的表达量，用相对定量2^-ΔΔCt法对表达量进行相对定量分析，以番茄Actin为内参基因。

表3 实时定量qRT-PCR的引物序列

Table3 The sequences of primers used in real-time RT-PCR

实施例二 ShORR-1基因VIGS表型观察

2.1 ShORR-1基因的克隆

以野生抗病番茄G1.1560的cDNA为模板克隆了510bp的番茄抗白粉病候选ShORR-1基因序列，由于来源于测序的DE-TDF的序列较短，采用生物信息学的方法，根据番茄全基因组序列进行基因步移后，得到与其同源的序列，Primer5软件设计引物。

2.2 TRV2-LIC重组载体的构建与鉴定

RT-PCR扩增得到的番茄白粉病抗性反应候选基因采用本章方法1.4与TRV2-LIC载体连接，转化E.coli DH5α获得阳性克隆，阳性质粒转化至农杆菌GV3101，通过质粒PCR、测序成功筛选出含有TRV2-LIC重组载体的农杆菌菌株。

2.3 ShORR-1基因VIGS表型观察

2.3.1 白粉菌抗性分析

为了分析ShORR-1基因沉默是如何影响G1.1560植株对O.neolycopersici的抗病性，对ShORR-1基因沉默植株和对照植株进行组织显微分析，病菌染色采用台盼兰染色法。感病性和显微分析显示，接种白粉菌7d后，未进行ShORR-1基因沉默的对照抗病植株G1.1560表现为抗病，其叶片上接种的白粉菌分生孢子大部分没有萌芽，而萌发孢子形成的吸器则引起其侵染叶片表皮细胞的过敏反应(细胞坏死)，无法从叶片细胞获取充足的营养，进而菌丝生长受到抑制，无法形成新的分生孢子和完成整个无性繁殖周期(图1C，D)。ShORR1基因沉默的抗病植株G1.1560叶片表现为感病，其叶片上接种的白粉菌分生孢子能够正常萌芽，形成的吸器没有引起侵染叶片细胞的过敏反应，菌丝正常生长并形成了分生孢子梗和新的分生孢子，能够完成整个无性繁殖周期(图1A，B)，进行新一轮的侵染。结果表明，ShORR1基因是番茄白粉病抗性反应的关键基因。

2.3.2 大丽轮枝菌抗性分析

利用TRV介导的VIGS分析ShORR1在番茄黄萎病抗性反应中的作用显示，接种黄萎病致病菌大丽轮枝菌的高抗枯、黄萎病的番茄(S.lycopersicum LA1221)一周后，携带pYY13空载农杆菌转化和清水接种对照植株离体叶片未表现出感病症状(图2)；携带pYY13-ShORR1重组载体农杆菌转化的ShORR1基因沉默植株离体叶片表现出明显感病症状(图2)。结果表明，ShORR1基因是番茄黄萎病抗性反应的关键基因。

2.3.3 致病疫霉菌抗性分析

对ShORR-1基因沉默植株和对照植株进行感病性和显微观察分析，实验表明，ShORR1基因沉默的本生烟草叶片对致病疫霉菌表现为感病(图3A-B，箭头所指为致病疫霉菌丝)，产生了游走孢子与菌丝，而对照植株叶片表现出过敏反应(细胞坏死)，无游走孢子和菌丝和菌丝产生。结果表明，ShORR1基因是本生烟晚疫病抗性反应的关键基因。2.4 VIGS沉默后RT-PCR检测

采用半定量RT-PCR的方法在分子水平检测了TRV2-LIC-PDS、TRV2-LIC-ShORR1的沉默后的转录本水平，以合成的cDNA为模板对目的基因片段和Actin内参基因分别进行20、25、30和35个循环扩增。电泳检测发现，PDS、ShORR1基因沉默植株叶片中表达水平明显低于对照，约低于对照的60％(图4)。

2.4 ShORR-1序列对应基因的全长

T载体测序法测得ShORR-1序列对应基因的全长序列为974bp，其中包含完整读码框序列长度为807bp，序列如下SEQ ID NO.1；

采用NCBI ORF-finder预测其编码蛋白质为268个氨基酸，序列如下SEQ ID NO.2

2.5 ShORR-1基因的空间表达分析及接种不同病原物分析

取MT番茄的根、茎、叶、花、绿色果实和红色果实，对ShORR-1的表达量分析发现，其在叶中的表达量明显高于其它组织(图5)，推测ShORR-1主要的叶中表达。接种三种不同类型的真菌病原菌，在不同的时间点取样分析，结果表明ShORR-1表达量在白粉菌侵染12h后达到一个高峰，在72h后达到最高峰(图6)；与白粉菌表达模式类似，ShORR-1在致病疫霉菌侵染3d后出现第一个表达高峰，在侵染14d后表达量达到最高(图7)；而ShORR-1在大丽轮枝菌接种60h之后表达量达到最高，之后下降(图8)。由此推测，ShORR-1在不同病原菌与番茄的互作中均起着重要的作用。

根据序列分析，ShORR-1为一个功能未知的新基因，尚没有与其同源的任何功能已知的基因被发现。

以上实施例仅用以说明，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。