橡胶树抗病相关蛋白GLPs及其编码基因与应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及一种橡胶树类萌发素蛋白基因的抗病关联性应用。

背景技术：

类萌发素蛋白(GLPs)是植物中广泛存在的一类蛋白家族，它们以糖蛋白的形式通过离子键结合存在于细胞外基质中，在植物的不同生长发育阶段以及不同的生物或非生物胁迫条件下表现出重要的生物学功能。(李莹，柳参奎.植物类萌发素蛋白研究进展[J].中国农学通报，2014，30(30)：246-254.)该基因含有β-折叠桶状结构域，属于cupin超级家族(Druka A,Kudrna D,Kannangara CG,von Wettstein D,Kleinhofs A.Physical and genetic mapping of barley(Hordeum vulgare)germin-like cDNAs[J].Proc Natl Acad Sci USA(2002)99(2):850～855.)。GLPs的功能多种多样，既与植物的正常生长发育有关，又能参与植物非生物和生物胁迫的防卫反应，在寄主基础抗性反应中发挥重要作用。该基因通常以酶、结构蛋白以及受体的形式参与多种生理生化过程，具有草酸盐氧化酶(Oxalate Oxidase,OXO)和超氧化物歧化酶(Super-Oxide Dismutase,SOD)的活性，能催化草酸氧化，产生二氧化碳和过氧化氢，而过氧化氢迅速积累导致植物细胞壁结构的增强，触发过氧化脂质反应和乙烯的合成，并激活程序性细胞死亡(Programmed Cell Death，PCD)，同时H₂O₂能够诱导防御基因的表达，从而提高植物的抗病性(李红丽，刘秋迪，何华，等.类萌发素蛋白在植物防卫反应中的作用[J].植物生理学报，2013，49(4)：331-336.)。研究发现，GLPs的N端具有一个不规则的信号肽，进一步证实该蛋白定位于细胞壁和细胞外基质中。Davidson等(2010)对OsGLPs定位进行研究证实所有的OsGLPs均定位于细胞壁上，当水稻叶片遭受病原菌侵染、昆虫咬食时，细胞壁将迅速发生交联，以此来保护水稻叶片免受伤害(Davidson R M,Manosalva P M,SnellingJ.Rice germin-like proteins:Allelic diversity and relationships to early stress responses[J].Rice(2010)3(1):43-55.)。Banerjee等，进一步对OsGLP1的定位进行研究，发现OsGLP1主要定位于细胞壁上，特别是在亚表皮细胞中的表达量较高。这个结果说明当水稻受到病原菌侵染时，GLP大量表达，产生的H₂O₂使初生细胞壁中的木聚糖交联，来维持结构稳定。因此，当植物受到非生物逆境胁迫处理时，植物体内的部分GLPs将发挥其结构蛋白的功能，保护植物渡过不利的环境条件，降低外界不利条件对植物的影响(Banerjee J,Maiti M K.Functional role of rice germin-like protein1in regulation of plant height and disease resistance[J].Biochemical and biophysical research communications(2010)394(1):178-183.)。

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是我国热带地区重要的经济作物和战略性工业原料作物，在国民经济建设和国家安全建设中占有重要的地位。而橡胶树棒孢霉落叶病(Corynespora leaf fall disease，CLFD)是近30年来影响橡胶树生产上最为严重的叶部病害。在世界范围内该病害仅次于南美叶疫病(South American Leaf Blight，SALB)成为威胁天然橡胶产业健康发展的第二大叶部病害。类萌发素蛋白能够响应多主棒孢病菌侵染的防御应答，同时还参与橡胶树的抗病过程，在橡胶树的基础抗性和防御反应发挥着重要作用。因此克隆类萌发素蛋白基因，分析受多主棒孢病菌诱导后在橡胶树抗、感品种中的表达特性，将有助于进一步了解橡胶树类萌发素蛋白基因的抗病调控机理。目前，橡胶树类萌发素蛋白GLPs的基因及其抗病分子机理善未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种橡胶树抗病相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的橡胶树抗病相关蛋白，来源于橡胶树，名称为HbGLP01，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列1所示蛋白具有相同活性的由1)衍生的蛋白质。

序列表中的序列1由327个氨基酸残基组成。

为了便于序列1编码的HbGLP01纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

上述HbGLP01可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述HbGLP01的编码基因可通过将序列表中序列2自5′末端第1-645位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述橡胶树抗病相关蛋白(HbGLP01)的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述橡胶树抗病相关蛋白(HbGLP01)的cDNA为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述橡胶树抗病相关蛋白的DNA分子；

3)与序列表中序列2的核苷酸序列具有90％以上的同源性的且编码蛋白对具有橡胶树抗病相关功能的核苷酸序列。

序列表中序列2全长为999个核苷酸，编码一个长度为327个氨基酸(序列表中序列1)，即为橡胶树抗病相关蛋白(HbGLP01)。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有所述橡胶树抗病相关蛋白(HbGLP01)的编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

上述橡胶树抗病相关蛋白(HbGLP01)及其编码基因在培育能抗病性提高的橡胶树中的应用也属于本发明的保护范围。

橡胶树抗病种质创制与抗病品种选育是橡胶树叶部病害防控最有效的途径，而抗病相关基因的克隆与功能分析是橡胶树抗病品种定性培育的关键。前期研究，证实了类萌发素蛋白(GLPs)家族成员与橡胶树棒孢霉落叶病的抗病性关系密切，克隆和鉴定了橡胶树抗病相关GLPs家族基因HbGLP01，明确其在橡胶树抗、感种质中的抗病性。因此，并利用抗病GLPs基因作为靶标基因在橡胶树种质资源抗病性早期分子诊断和抗病品种鉴选方面提供了新的途径，也为后续抗病品种的选育提供理论依据。

附图说明

图1为HbGLP01基因预测结果(橡胶树、拟南芥、烟草、苜蓿、杨树及葡萄等6种模式)

图2为HbGLP01基因的扩增结果M：Trans 2K PlusⅡDNA Ladder；1：以IAN873基因组为模板；2：以PR107基因组为模板；3：以IAN873第一链cDNA为模板；4：以PR107第一链cDNA为模板。

图3为HbGLP01蛋白序列的保守结构域预测

图4为HbGLP01蛋白信号肽预测

图5为HbGLP01在橡胶树受多主棒孢侵染后的差异表达分析；小写英文字母为差异显著性标记(P<0.05)

具体实施方式

我们克隆了橡胶树磷酸果糖激酶基因的全长cDNA，并进行了基因表达分析将该基因命名为HbGLP01。下述实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1.橡胶树类萌发素蛋白(GLPs)及其编码基因的获得

分析已在NCBI登陆的拟南芥、杨树和麻风树的类萌发素蛋白(GLPs)的核苷酸序列，通过搜索我们建立的橡胶树叶片受多主棒孢病菌侵染后的EST序列数据库，确定一条200bp左右的橡胶树类萌发素蛋白(GLPs)基因EST组装后序列(contig)，设计一对特异性引物扩增得到该cDNA片段，最终获得包含完整读码框的cDNA全长序列。

具体方法如下：

<1>cDNA片段克隆

特异性引物设计如下：

F(5’端)：5'-GATGAGTCCTGAGTAACGGTG-3'

R(3’端)：5'-TGACTGCGTACCAATTCCGTC-3'。

分别以巴西橡胶树热研7-33-97(中国热带农业科学院橡胶研究所培育，中国热带农业科学院橡胶研究所长期有种苗出售)叶片cDNA为模板(以随机引物反转录获得)，F和R为引物，其终浓度为0.4μmol/L，在25μl反应体系中进行PCR扩增。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸90s，34次循环；72℃延伸10min。获得一段1000bp左右的核苷酸片段，为类萌发素蛋白(GLPs)基因的cDNA片段。

<2>HbGLP01基因全长的克隆

差异表达片段DE-TDFs-FI7321长246nt，与热研7-33-97全基因组序列比对结果表明其同源性为100％。提取包括该片段在内的3kb基因组序列，用Softberry软件中的橡胶树、拟南芥、烟草、苜蓿、杨树及葡萄等模式进行目的基因预测，均获得一致的结果(图1)，将该基因命名为HbGLP01。预测该基因包含2个外显子和1个内含子，第1个外显子前约0.1kb处为转录起始位点，两外显子之间有一个长303nt的内含子，第2个外显子后约0.05kb处为Poly A位点,而且内含子和外显子交界处序列符合GT-AG规律。

根据预测结果设计引物GLP-F：5’-AGGTCAACCTCAACTAACAC-3’和GLP-R：5’-AAAGAGGCAATAGGCATATC-3’。分别以IAN873和PR107的基因组DNA和接种48h后的第一链cDNA作为模板进行PCR扩增，结果分别获得约1.2kb和0.7kb的扩增产物(图2)。测序结果比对表明，从两个样品基因组及cDNA中均获得完全相同的序列。进一步的分析结果表明获得了和预测结果一致的HbGLP01基因，该基因编码231aa，cDNA序列和氨基酸序列与“热研7-33-97”中同源基因的相似性分别为97％和100％。序列已提交NCBI数据库，登录号为KT355593。

实施例2.橡胶树类萌发素蛋白(GLPs)生物信息学分析

对HbGLP01基因氨基酸序列的Blastp结果表明，在第63-209位氨基酸残基间，序列与cupin-1家族典型的β-桶状保守结构序列高度相似(图3)。推测该基因为Cupin超蛋白家族的成员之一。SignalP 4.0预测其信号肽存在于靠近序列N端的6-25氨基酸序列区，第22及第23个氨基酸残基间为其可能的剪切位点(图4)，该信号肽能指导氨基酸序列进入胞外基质中。Wolf Psort亚细胞定位预测结果也表明，该蛋白可能定位于细胞外基质中。对该蛋白进行理化性质分析可知，编码的231个aa的蛋白分子量为24.8ku，等电点5.54，不稳定系数25.07，脂肪族氨基酸指数95.84，表明此蛋白可能是一个稳定的疏水性蛋白。

对HbGLP01基因进行Blastn数据库同源比对，该基因与麻风树JcGLP1-13(XP_012081131.1)的同源性最高，为81％。依据比对结果，选取麻风树JcGLP1-13，胡杨PeGLP1-13(XP_011045439.1)，三角叶杨PtGLP1(XP_002313686.1)，可可树TcMYB113(XP_007030289.1)，雷蒙德式棉GrGLP1-14(XP_012480997.1)等GLPs基因的蛋白质序列，利用DNAMAN软件对序列进行多序列比对(图5)。结果表明HbGLP01蛋白包含GLPs蛋白家族中高度保守的三个寡肽序列，分别是Box A(-QDFCVAD-),Box B(G--P-H-HPRATE------G)及Box C(GL-HFQ-N-G)。序列Box B及Box C处于Cupin Domain区域内，Box B及Box C中含有1个谷氨酸(Glu,E)和3个组氨酸(His,H)等保守氨基酸残基(图3)。

实施例3.HbGLP01基因表达模式分析

<1>HbGLP01基因在橡胶树抗、感种质中的特异性表达

选取基因的保守区域设计特异性荧光表达上下游引物GX-F：5’-TAATATTGCCAGCGAAACTTC-3’及GX-R：5’-CCATTTGCTTCATAATCGATA-3’，采用qRT-PCR方法分析橡胶树品种IAN873和PR107受多主棒孢侵染后HbGLP01基因的差异表达。结果表明IAN873(抗病)及PR107(感病)叶片受侵染后HbGLP01基因的表达均出现先显著上调随后下降的现象。IAN873在接菌6h后表达量开始上升，在24h时达到峰值随后下降，而PR107接菌6-24h上升缓慢，至48h时显著上调并达到峰值，且峰值表达量明显低于抗病品种。推测HbGLP01可能参与橡胶树与多主棒孢的互作过程并与抗性反应相关(图5)。

4.结论

我们首次克隆了橡胶树类萌发素蛋白GLPs基因的全长cDNA，经qRT-PCR分析表明，HbGLP01基因在橡胶树抗病(IAN873)品种中的表达量显著高于感病品种(PR107)，且在不同抗病性水平(高抗、中抗、轻感、高感)的杂交F1代种质中的表达量也存在明显的差异，说明该基因与橡胶树的抗病性相关，并且具有橡胶树抗病性早期分子诊断靶基因的潜力。利用抗病GLPs基因作为靶标基因在橡胶树种质资源抗病性早期分子诊断和抗病品种鉴选方面提供了新的途径。

以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围内。

序列表

<110>中国热带农业科学院环境与植物保护研究所

<120> 橡胶树抗病相关蛋白GLPs及其编码基因与应用

<130> WHOI160083

<160>2

<210> 1

<211> 327

<212> PRT

<213>橡胶树

<400> 1

Met Lys Val Ser Asn Phe Leu Val Ala Leu Ala Phe Leu Ala Leu Ala

1 5 10 15

Ser Ser Phe Ala Ile Ala Tyr Asp Pro Ser Pro Leu Gln Asp Phe Cys

20 25 30

Val Ala Thr Asp Asp Ala Ser Ser Gly Gly Met Gln Pro Leu Met Leu

35 40 45

Phe Pro Phe Ile Thr Ala Ile Asn Val Leu Phe Leu Ser Gly Ile Phe

50 55 60

Lys Phe Ile Phe Ile Phe Ser Lys Phe Cys Tyr Ser Asn Asp Tyr Asp

65 70 75 80

Lys Ser Tyr Val Ile Phe Ile Val Ile Met Trp Ile Ile Ile Tyr Asp

85 90 95

Asn Ser Arg Val Asn Ser Ile Ile Ile Lys Trp Ile Ser Ser Ser Met

100 105 110

Ile Lys Ile Tyr Leu Leu Tyr Ile Gly Leu His Ala Leu Met Ala Ile

115 120 125

Lys Leu Cys Leu His Phe Phe His Ala Val Leu Val Asn Gly Lys Phe

130 135 140

Cys Lys Asp Pro Asp His Val Thr Ala Asp Asp Phe Phe Tyr Ser Gly

145 150 155 160

Leu Asn Ile Ala Ser Glu Thr Ser Lys Gln Leu Gly Ala Arg Thr Asn

165 170 175

Leu Leu Thr Val Asp Ser Ile Pro Gly Leu Asn Thr Asn Gly Leu Ser

180 185 190

Ile Val Arg Ile Asp Tyr Glu Ala Asn Gly Gly Leu Asn Pro Pro His

195 200 205

His His Pro Arg Ala Ser Glu Ile Leu Thr Val Leu Glu Gly Thr Leu

210 215 220

Tyr Ala Gly Phe Ile Thr Ser Asn Pro Asp His Arg Val Phe Ala Lys

225 230 235 240

Val Leu Lys Ala Gly Asp Val Phe Val Phe Pro Phe Gly Leu Ile His

245 250 255

Phe Gln Leu Asn Ile Gly Lys Asn Pro Ala Val Ala Ile Ala Ala Leu

260 265 270

Asn Ser Gln Asn Pro Gly Val Val Thr Thr Ala Asn Thr Val Phe Gly

275 280 285

Ala Ser Pro Ser Ile Asn Pro Asp Val Leu Thr Arg Ala Phe His Leu

290 295 300

Asp Lys Asp Leu Val Thr Lys Leu Gln Arg Gln Glu Trp Val Asn Pro

305 310 315 320

Ser Asp Leu Asn Ser Tyr Ser

325

<210> 2

<211> 999

<212> DNA

<213> 橡胶树

<400> 2

atgaaagttt ctaatttcct cgtagctctt gctttcttgg ctttggcttc ctcatttgcc 60

attgcttatg accctagccc tctccaggac ttctgtgtgg caactgatga tgctagctct 120

ggtggtatgc aaccgcttat gctatttcct tttattactg ctattaattg agtacttttt 180

ttgagcggca ttttcaaatt tattttcatt ttttcaaaat tttgttatag taatgattat 240

gataagtctt atgtgatttt catagtaatc atgtggatta taatctatga taactctcgt 300

gtgaattcca tcataatcaa atggatttca tcataatcta tgattaaaat atatttgttg 360

tacatatgag ggttacacgc attaatggca ataaaattgt gctaatgatt acatttcttt 420

catgcagtgt tggtgaatgg aaaattttgc aaggacccag accatgtcac agcagatgat 480

ttcttctatt ctgggcttaa tattgccagc gaaacttcca aacaacttgg agcacgtacc 540

aaccttttga ctgtggattc gataccagga cttaatacta atggcctatc cattgttcgt 600

atcgattatg aagcaaatgg tggactaaac ccaccccacc atcaccctcg agcttcagag 660

atcttaactg tcttggaagg aaccttgtat gctggtttta tcacatccaa tcctgatcat 720

cgtgtttttg ctaaagttct caaggcagga gatgtttttg tatttccatt tggactcatt 780

cacttccagt tgaatattgg aaaaaatcct gcagttgcca tagcagcatt aaacagtcaa 840

aatccaggag ttgtgacgac agcaaataca gtttttggag ctagcccatc cattaatcct 900

gatgttctaa caagagcatt ccatcttgac aaggatttag ttaccaaact tcagagacaa 960

gaatgggtga atccatcaga tcttaacagc tattcttga 999