一种检测旋毛虫、弓形虫和血吸虫的多重DPO‑PCR引物组合及方法与流程

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于多重DPO-PCR同时检测旋毛虫、弓形虫和血吸虫的引物组合及方法。

背景技术：

旋毛虫(Trichinella spiralis)是一种危害严重的食源性人兽共患寄生性线虫，能够感染包括人类在内的150多种哺乳动物，呈世界性分布。旋毛虫病感染来源于摄食了生的或未熟的含旋毛虫包囊的猪肉或其他动物肉，且人感染旋毛虫病可引起死亡，是一种严重危害公共卫生安全的人畜共患寄生虫病，所以在肉品卫生检验中为必检项目。

弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，能感染几乎所有温血动物的有核细胞，是引起世界范围广泛流行的人兽共患寄生虫病。食入未煮熟的肉等被污染的食物易引起弓形虫病。

血吸虫是人畜互通寄生虫。其储存宿主种类较多，主要有牛、猪、犬、羊、马、猫及鼠类等30多种动物。

多重PCR是指在一个反应管内加入多对引物同时对多个靶基因进行扩增，可以实现对样品的高通量检测，目前已经被广泛应用于转基因物种的检测。由于在PCR反应体系内加入了多对引物，体系复杂，稳定性不高，限制了其使用。双启动寡核苷酸(DPO，Dual priming oligonucleotide)引物的设计方法简化了建立常规PCR方法的操作步骤，该DPO引物技术的主要原理为其引物包含两个各自独立的特异性引物区域，5′端序列由18-25个碱基组成并与靶基因序列配对，3′端序列由6-12个碱基用来引导PCR反应的特异性延伸，这两段独立的特异性区域利用寡聚次黄嘌呤(Inosine,I)进行连接，由于次黄嘌呤比一般碱基的退火温度低，在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，从而使5′和3′区域形两个独立功能的双特异性引物结构，研究表明5′和3′引物区域中任何有3个及以上碱基的错配，PCR反应将不能进行，而且由于其特殊的结构，引物自身以及引物之间很少形成二级结构且对退火温度不敏感，实验过程中不需要对引物进行筛选以及对退火温度进行优化。该技术的优点主要在于它对退火温度等影响普通多重PCR的关键因素不敏感，适用范围广，而且该技术特异性强，扩增效率高，为多重PCR技术的应用提供了新的前景。

采用DPO引物建立多重DPO-PCR方法对致病性微生物实施精准检测，对保障公共卫生安全具有现实意义。本发明根据旋毛虫ATP6靶基因、弓形虫P22靶基因和血吸虫28S rRNA的保守区设计合成了三对DPO引物，通过反应体系与反应条件的优化，建立了同时检测旋毛虫、弓形虫和血吸虫的DPO-PCR精准检测方法。本发明可用于临床病例的快速诊断和流行病学调查，具有一定的实用性。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏、准确和快速的基于多重DPO-PCR技术的可同时旋毛虫、弓形虫和血吸虫的方法，本发明还提供了用于该方法的特异性好、灵敏度高、检测效率高和适用范围广的三组引物对。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

根据旋毛虫ATP6靶基因、弓形虫P22靶基因和血吸虫28S rRNA的保守区设计合成了三对DPO引物组合，所述引物组合如下：

Trichina-F：5’-TCTCCCTACTCAGATACAACTGAATIIIIIACAGCCAA-3’；

Trichina-R：5’-GGATTTATGTGTTTTTGTGTGTGTTIIIIITTCTGGTC-3’；

Toxo-F：5’-CGGCGCAACGAAGACTGTTGIIIIICCCTCCAGT-3’；

Toxo-R：5’-ACCTGCTTCGGCAACGCACTTIIIIIAGAGAACC-3’；

Schistosome-F：5’-TGAGATACCACAAAAGGTGTTGGIIIIICCAGACAGC-3’；

Schistosome-R：5’-GGGCTGCGATCTACAACTTTGIIIIITGATGCAG-3’；

其中，I为次黄嘌呤。

Trichina-F和Trichina-R为检测旋毛虫的引物，产物大小为419bp；Toxo-F和Toxo-R为弓形虫的引物，产物大小为271bp；Schistosome-F和Schistosome-R为检测血吸虫的引物，产物大小为494bp。

本发明还提供含有所述引物组合的用于多重DPO-PCR检测旋毛虫、弓形虫和血吸虫的试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液等中的至少一种。更优选地，所述试剂盒还包括阳性对照。

本发明还提供了一种检测旋毛虫、弓形虫和血吸虫的多重DPO-PCR方法，利用所述的引物组合进行多重DPO-PCR检测旋毛虫、弓形虫和血吸虫这三种动物源性人兽共患寄生虫病。具体的，所述方法包括以下步骤：1)提取待测患病动物肌肉组织或脏器样品中的DNA；2)以步骤1)中提取的DNA为模板，进行多重DPO-PCR扩增反应；和3)分析扩增产物。所述多重DPO-PCR反应体系以50μL计为：10×PCR Buffer(Mg²⁺free)5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.5μL，Mg²⁺(25mM)7.5μL，dNTP(2.5mM)5.5μL，每对DPO引物(10μM)各1μL，DNA模板各1μL，ddH₂O补至50μL。所述多重DPO-PCR反应条件为：95℃5分钟；94℃45s，48℃～68℃45s，72℃45s，共35个循环；72℃终延伸10分钟。

前述方法中，步骤3)中采用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，旋毛虫的扩增产物大小为419bp，弓形虫的扩增产物大小为271bp，血吸虫的扩增大小为494bp。

本发明的有益效果：

本发明根据旋毛虫ATP6靶基因、弓形虫P22靶基因和血吸虫28S rRNA的保守区分别设计特异性DPO-PCR引物，并基于这些引物建立了检测旋毛虫、弓形虫和血吸虫的多重DPO-PCR方法，可实现对患病动物肌肉组织或脏器样品的定性检测。实验表明，本发明的检测方法特异性好、通量高、快速，提高了检测效率，为旋毛虫、弓形虫和血吸虫的检测提供了更有效的方法。

附图说明：

图1是旋毛虫、弓形虫和血吸虫单重DPO-PCR检测结果示意图，其中，旋毛虫和弓形虫PCR检测示意图的M为DNA Marker 100 ladder，血吸虫的PCR检测示意图的M为DNA Marker DL2000，1-2为不同寄生虫DPO-PCR检测阳性结果。

图2是旋毛虫、弓形虫和血吸虫DPO-PCR检测方法退火温度不敏感性结果示意图，其中，M为DNA Marker DL2000，1为48.3℃，2为49.5℃，3为51.4℃，4为53.7℃，5为56.4℃，6为59.1℃，7为61.7℃，8为64.1℃，9为66.1℃，10为67.4℃，11为68℃；左侧的1-11为常规引物扩增获得结果，右侧的1-11为DPO引物扩增的结果。

具体实施方式

下面以具体实施方式对发明作进一步详细说明

本发明参照特定的实施例进行了描述，但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不违背本发明的精神和范围。因此，本发明的说明书和附图应该认为是说明性的而非限制性的。

实施例1.检测旋毛虫、弓形虫和血吸虫的多重DPO-PCR方法

一、多重DPO-PCR引物组合的设计

根据旋毛虫ATP6靶基因、弓形虫P22靶基因和血吸虫28S rRNA的保守区，分别设计了如下检测旋毛虫、弓形虫和血吸虫的保守区的多重DPO-PCR引物组合(引物序列中的I为次黄嘌呤)：

Trichina-F：5’-TCTCCCTACTCAGATACAACTGAATIIIIIACAGCCAA-3’(SEQ ID NO:1)

Trichina-R：5’-GGATTTATGTGTTTTTGTGTGTGTTIIIIITTCTGGTC-3’(SEQ ID NO:2)

Toxo-F：5’-CGGCGCAACGAAGACTGTTGIIIIICCCTCCAGT-3’(SEQ ID NO:3)

Toxo-R：5’-ACCTGCTTCGGCAACGCACTTIIIIIAGAGAACC-3’(SEQ ID NO:4)

Schistosome-F：5’-TGAGATACCACAAAAGGTGTTGGIIIIICCAGACAGC-3’(SEQ ID NO:5)

Schistosome-R：5’-GGGCTGCGATCTACAACTTTGIIIIITGATGCAG-3’(SEQ ID NO:6)

Trichina-F和Trichina-R为检测旋毛虫的引物，产物大小为419bp；Toxo-F和Toxo-R为弓形虫的引物，产物大小为271bp；Schistosome-F和Schistosome-R为检测血吸虫的引物，产物大小为494bp。

二、检测旋毛虫、弓形虫和血吸虫的多重DPO-PCR方法

1、DNA的提取

采用DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)提取旋毛虫、弓形虫和血吸虫的基因组DNA，参照试剂盒说明操作。

2、多重DPO-PCR扩增

采用Trichina-F、Trichina-R、Toxo-F、Toxo-R、Schistosome-F和Schistosome-R共6条多重DPO-PCR引物，分别以如下4组的基因组DNA为模板进行多重DPO-PCR扩增，分别得到多重DPO-PCR扩增产物：

组1以旋毛虫的基因组DNA为模板；

组2以弓形虫的基因组DNA为模板；

组3以血吸虫的基因组DNA为模板；

组4以旋毛虫、弓形虫和血吸虫的基因组DNA为模板。

多重DPO-PCR反应体系为：10×PCR Buffer(Mg²⁺free)5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.5μL，Mg²⁺(25mM)7.5μL，dNTP(2.5mM)5.5μL，每对DPO引物(10μM)各1μL，DNA模板各1μL，ddH₂O补至50μL。

多重DPO-PCR反应条件为：95℃5min；94℃45s，48℃～68℃45s，72℃45s，共35个循环；72℃终延伸10min。

3、多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测

多重DPO-PCR反应结束后，取5μL的多重DPO-PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察结果并对扩增产物进行测序。

结果如图1和图2所示，组1(旋毛虫)的PCR扩增产物含有1条带，大小为419bp；组2(弓形虫)的PCR扩增产物只含有1个条带，大小为271bp；组3(血吸虫)的PCR扩增产物含有1个条带，大小为494bp；组4(旋毛虫、弓形虫和血吸虫)的PCR扩增产物含有3条大小为419bp、271bp和494bp。说明本发明的多重DPO-PCR引物的可以快速有效地检测旋毛虫、弓形虫和血吸虫。

实施例2.多重DPO-PCR引物组合的灵敏度检测

1、DNA的提取

参照试剂盒说明操作提取旋毛虫、弓形虫和血吸虫的基因DNA。将得到的基因组DNA混合并进行10倍稀释，分别制备得到浓度为18ng/μL、1.8ng/μL、0.18ng/μL、0.018ng/μL和0.0018ng/μL的旋毛虫、弓形虫和血吸虫的基因组DNA。

2、多重DPO-PCR扩增

采用实施例1的步骤二中的检测旋毛虫、弓形虫和血吸虫的方法，分别以如下5组的基因组DNA为模板进行多重DPO-PCR扩增，分别得到多重DPO-PCR扩增产物：

组1：以18ng/μL的旋毛虫、弓形虫和血吸虫的基因组DNA(1μL)为模板；

组2：以1.8ng/μL的旋毛虫、弓形虫和血吸虫的基因组DNA(1μL)为模板；

组3：以0.18ng/μL的旋毛虫、弓形虫和血吸虫的基因组DNA(1μL)为模板；

组4：以0.018ng/μL的旋毛虫、弓形虫和血吸虫的基因组DNA(1μL)为模板；

组5：以0.0018ng/μL的旋毛虫、弓形虫和血吸虫的基因组DNA(1μL)为模板。

3、多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测

多重DPO-PCR反应结束后，分别取5μL的多重DPO-PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察结果。

结果表明，本发明多重DPO-PCR引物组合具有较高的灵敏度，可检测出样品中仅含有0.0018ng/μL的微量DNA。

实施例3.多重DPO-PCR引物组合的退火温度敏感性检测

1、DNA的提取

参照试剂盒说明提取旋毛虫、弓形虫和血吸虫的基因组DNA。

2、多重DPO-PCR扩增

以步骤1获得的旋毛虫、弓形虫和血吸虫基因组DNA为模板，采用常规引物(如表1所示)或者实施例1的步骤二中的同时检测旋毛虫、弓形虫和血吸虫的方法，用不同的退火温度(48.3℃、49.5℃、51.4℃、53.7℃、56.4℃、59.1℃、61.7℃、64.1℃、66.1℃、67.4℃、68℃)分别进行PCR扩增，其余反应条件不变，分别得到PCR扩增产物。

表1.扩增血吸虫28S rRNA、旋毛虫ATP6基因和弓形虫P22基因常规引物序列

3、多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测

多重DPO-PCR反应结束后，分别取5μL的多重DPO-PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察结果。

结果如图2所示：电泳检测结果显示用不同的退火温度(48.3℃、49.5℃、51.4℃、53.7℃、56.4℃、59.1℃、61.7℃、64.1℃、66.1℃、67.4℃、68℃)进行PCR扩增得到的PCR扩增产物均含有大小为419bp、271bp和494bp的片段，无非特异性扩增条带，说明本发明的多重DPO-PCR引物对退火温度不敏感。

序列表

<110> 申请人名称：海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 一种检测旋毛虫、弓形虫和血吸虫的多重DPO-PCR引物组合及方法

<130> reference number：11348

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 旋毛虫ATP6靶基因DPO引物上游引物

<400> 1

tctccctact cagatacaac tgaatiiiii acagccaa 38

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 旋毛虫ATP6靶基因DPO引物下游引物

<400> 2

ggatttatgt gtttttgtgt gtgttiiiii ttctggtc 38

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 弓形虫P22靶基因DPO引物上游引物

<400> 3

cggcgcaacg aagactgttg iiiiiccctc cagt 34

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 弓形虫P22靶基因DPO引物下游引物

<400> 4

acctgcttcg gcaacgcact tiiiiiagag aacc 34

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 血吸虫28S rRNA DPO引物上游引物

<400> 5

tgagatacca caaaaggtgt tggiiiiicc agacagc 37

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 血吸虫28S rRNA DPO引物下游引物

<400> 6

gggctgcgat ctacaacttt giiiiitgat gcag 34

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 旋毛虫ATP6靶基因常规引物上游引物

<400> 7

tctccctact cagatacaac tgaattatta acagccaa 38

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 旋毛虫ATP6靶基因常规引物下游引物

<400> 8

ggatttatgt gtttttgtgt gtgttattca ttctggtc 38

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 弓形虫P22靶基因常规引物上游引物

<400> 9

cggcgcaacg aagactgttg atgcaccctc cagt 34

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 弓形虫P22靶基因常规引物下游引物

<400> 10

acctgcttcg gcaacgcact tgtaacagag aacc 34

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 血吸虫28S rRNA常规引物上游引物

<400> 11

tgagatacca caaaaggtgt tggttggtcc agacagc 37

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 血吸虫28S rRNA常规引物下游引物

<400> 12

gggctgcgat ctacaacttt gtactttgat gcag 34