一种子宫内膜干细胞增殖方法及其应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种子宫内膜干细胞增殖方法及其应用。

背景技术：

干细胞(stemcell，sc)是一种未分化细胞，这些细胞保持着高度增殖、自我更新和分化潜能的特性。干细胞可以定向分化为血液、骨骼、大脑及皮肤等其他组织。可能作为修复系统修复受损细胞。干细胞又可分为胚胎干细胞，脐血干细胞，成体干细胞及生殖干细胞等类型。干细胞在成体组织中调控成体细胞增殖、分化、凋亡及保持细胞数目的平衡中起到十分重要的作用。

人的子宫内膜是一个高度再生组织，在育龄期妇女中要经历400多次的增殖、分化和脱落。人子宫内膜由腺上皮细胞、间质细胞和血管组成，近年越来越多的研究表明，子宫内膜组织中存在一小群具有强大增殖和多向分化潜能的干细胞，可不断分裂增殖，及时补充脱落的终末分化细胞，使子宫内膜始终保持自我更新和再生能力。现代妇产科学研究向细胞、亚细胞及分子水平发展，在体外成功的培养子宫内膜干细胞可为研究细胞的生长分化、代谢以及激素作用机制提供一个理想的实验模型。

目前已经可以在体外培养扩增子宫内膜干细胞，用于科学研究、药物筛选测试、临床应用等。为了方便的取用体外培养扩增的子宫内膜干细胞，一般需要对培养出的子宫内膜干细胞进行冻存和复苏。目前，一般的干细胞冻存使用的冻存液有含血清和无血清的两类，含血清冻存液成分复杂、价格昂贵且质量难以控制，因而无血清冻存的应用越来越多。用于干细胞无血清冻存的冻存液主要含有70％的无血清培养基、20％牛血清白蛋白(bsa)和10％二甲基亚砜(dmso)。冻存程序一般采用梯度降温的方法，降温速度大约是1℃/分钟。对冻存的细胞进行复苏时，一般将冻存细胞直接置于37℃下解冻，然后加入完全生长培养基重悬细胞，离心后搜集细胞继续培养。

子宫内膜干细胞冻存后复苏率直接影响着后续的使用。为获得来源方便的子宫内膜干细胞，改进子宫内膜干细胞冻存复苏技术、建立一种子宫内膜干细胞增殖方法对开发子宫内膜干细胞的应用具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种子宫内膜干细胞增殖方法及其应用。

本发明提供了一种子宫内膜干细胞增殖方法，所述方法包括步骤：

(1)细胞预处理

将子宫内膜干细胞与冻存液混合，调整细胞悬液的细胞浓度后，将细胞悬液在2-10℃放置6-8h；

(2)冻存

将步骤(1)预处理过的子宫内膜干细胞细胞悬液在-20℃放置30-40分钟，接着在-70℃放置10-18个小时，然后转入液氮中冻存；

(3)复苏

将液氮中冻存的子宫内膜干细胞取出，加入37℃预热的复苏液进行复苏。

优选地，所述步骤(1)中细胞浓度为3×10⁶-7×10⁶个/ml。

优选地，所述步骤(1)中细胞浓度为5×10⁶个/ml。

优选地，所述步骤(1)中将细胞悬液在4℃放置7h。

优选地，所述冻存液为：

在dmem培养液中含有：

维生素c，15-20mg/ml；

维生素e，0.1-0.3mg/ml；

亚硫酸氢钠，2-6mg/ml；

nisin素，3-9mg/ml；

bsa，0.05-0.08g/ml；

dmso，终浓度5-7％(v/v)。

根更优选地，所述冻存液位在dmem培养液中含有：

维生素c，18mg/ml；

维生素e，0.2mg/ml；

亚硫酸氢钠，4mg/ml；

nisin素，6mg/ml；

bsa，0.08g/ml；

dmso，终浓度6％(v/v)。

优选地，所述复苏液为：

在dmem培养液中含亚硫酸氢钠2-6mg/ml。

更优选地，所述复苏液为：

在dmem培养液中含亚硫酸氢钠4mg/ml。

优选地，所述方法还包括步骤：

(4)传代

对步骤(3)复苏的子宫内膜干细胞进行传代扩增培养。

优选地，步骤(3)中，将冻存的子宫内膜干细胞自液氮中取出后，在40℃水浴锅温育2-3分钟；加入10倍体积的37℃预热的复苏液重悬洗涤，离心去上清；重复洗涤步骤一次，即得复苏的子宫内膜干细胞。

本发明提供的子宫内膜干细胞增殖方法，能够使得子宫内膜干细胞在液氮环境下，保持极高的存活，并且复苏后具有极高的复苏率，经传代培养仍然保持干细胞特性，适于大量扩增培养子宫内膜干细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为p8子宫内膜干细胞的显微照片。

图2显示了nestin染色情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国sambrook.j等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1子宫内膜干细胞的获得

因子宫肌瘤行全子宫切除术的患者(手术前3个月未服用激素类药物)，组织学诊断未发现子宫内膜有病理性改变。与患者签署知情同意书，并本着对患者尊重、保密及公正的原则进行取材，并保证患者的隐私不受伤害。在无菌条件下取内膜全层+子宫肌层5mm，取材远离病变部位，缓冲液(pbs)冲洗干净后，移入无菌的培养皿中，剪至lmm³大小放入冰浴dmem/f12培养基(美国hyclone)中。

在培养皿中加入约2倍体积的的胶原酶i(150u/ml)，37℃消化50-60min，获得单细胞悬液。将消化好的单细胞悬液移入离心管，静置几分钟去除剩余的大块组织。1500rpm离心3min，基质细胞和上皮细胞存于上清液中。

将分离的细胞悬液用台盼兰染色计数活细胞。按照2×10⁵个/ml的细胞密度分别接种于75cm²的培养瓶中，dmem/f12培养基中包含10％胎牛血清、青链霉素溶液，37℃、5％c02培养箱孵育，72h后更换培养液，弃去未贴壁的细胞，以后每2-3天换液一次，并定时观察细胞生长情况，培养获得原代子宫内膜干细胞。原代细胞呈梭形，胞浆丰富透明，呈现中间稍宽两端尖的形态，细胞核呈卵圆形。

实施例2子宫内膜干细胞的增殖

经过大量的组分筛选和含量配比实验，本发明人最终确定的适用于子宫内膜干细胞冻存液和复苏液构成如下：

冻存液：

冻存液的成分是在dmem培养液(invitrogen)中含有：

维生素c，18mg/ml；

维生素e，0.2mg/ml；

亚硫酸氢钠，4mg/ml；

nisin素(sigma)，6mg/ml；

bsa(sigma)，0.08g/ml；

dmso(sigma)，终浓度6％(v/v)。

复苏液：

复苏液的成分是在dmem培养液(invitrogen)中含亚硫酸氢钠4mg/ml。

实验组1

将实施例1中制备的子宫内膜干细胞与冻存液混合，调整细胞悬液的浓度为5.0×10⁶个细胞/ml，将细胞悬液在4℃放置7h，然后在-20℃放置35分钟，接着在-70℃放置15个小时，然后转入液氮中冻存。经过4℃的预处理，子宫内膜干细胞复苏形态更为健康，而且在后续传代过程中，具有明显更强的增殖能力。

15天后将冻存的子宫内膜干细胞自液氮中取出，在40℃水浴锅温育2-3分钟；加入10倍体积的37℃预热的复苏液重悬洗涤，离心去上清；重复洗涤步骤；然后加入1倍体积的复苏液重悬，进行自动细胞计数仪计数，获得4.7×10⁶个细胞/ml，细胞复苏率为94％。复苏后细胞如图1所示。

对照组1

实验基本同实验组1，不同在于，冻存液中不含维生素c，冻存复苏后经检测细胞复苏率为62％。

对照组2

实验基本同实验组1，不同在于，冻存液中不含维生素e，冻存复苏后经检测细胞复苏率为59％。

对照组3

实验基本同实验组1，不同在于，冻存液中不含亚硫酸氢钠，冻存复苏后经检测细胞复苏率为54％。

对照组4

实验基本同实验组1，不同在于，冻存液中不含nisin素，冻存复苏后经检测细胞复苏率为71％。

对照组5

实验基本同实验组1，不同在于，冻存液中不含维生素c、维生素e、亚硫酸氢钠、nisin素，冻存复苏后经检测细胞复苏率为36％。

实施例3子宫内膜干细胞贴壁细胞的形态及传代

将复苏后的子宫内膜干细胞按照2×10⁵个/ml的细胞密度分别接种于75cm²的培养瓶中，dmem/f12培养基(invitrogen)中包含10％胎牛血清、1％青/链霉素溶液，37℃、5％c02培养箱孵育，72h后更换培养液，弃去未贴壁的细胞，以后每2-3天换液一次。将当细胞长至80％-90％进行传代：去除培养液，加消化液(0.25％胰蛋白酶+0.02％edta液)消化，用等量血清终止消化，1300r/min10min离心，去上清，加入传代培养基，吹打散细胞，按5×10³个/ml传代，37℃、5％c02培养箱孵育，72h后更换培养液，以后每2-3天换液一次。传代培养实验结果表明，复苏的子宫内膜干细胞传代十次后仍然保持了稳定的增殖能力。传代过程中不同代数依次标记为p1、p2至p10。

传代培养基为dmem/f12培养基含15％(v/v)的胎牛血清、亚硫酸氢钠3mg/ml、1％(w/v)两性霉素、1％(w/v)链/青霉素。

实施例4.流式细胞术和免疫细胞化学检测鉴定干细胞表面标记

选取生长状态良好的实验组各传代的细胞集落，离心收集细胞，弃上清洗涤细胞两次，制成浓度为1x10⁶/l细胞悬液，分别加入10微升cd29、cd45、cd90、cd34、cd73和cd133抗体(bd公司)，4℃避光孵育30分钟。孵育完成后液洗涤细胞两次以去除未结合的抗体，重悬细胞后，用流式细胞仪检测cd29、cd45、cd90、cd34、cd73和cdl33的表达率。

经流式细胞术鉴定，扩增传代的各代细胞均具有预期的干细胞特性。说明各传代细胞仍然保持了干细胞特性。

免疫细胞化学检测

将p8子宫内膜干细胞培养至对数生长期，待细胞长满瓶底后消化，调节细胞浓度为10⁸/l接种于12孔培养板，每孔1.5ml，贴壁48h后40g/l多聚甲醛固定，进行nestin免疫细胞化学染色，dab显色，检测nestin阳性细胞表达面积。图2显示了nestin染色情况。

实施例5.子宫内膜干细胞成脂、成骨诱导分化

1)成脂分化

取第8代细胞，2×10⁴细胞/孔接种于12孔板中。细胞达到70％-80％融合时，吸去培养基，加入成脂分化培养基，成脂分化培养基在imdm培养基中补充10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10mmol/ll-谷氨酰胺、10μmol/l胰岛素(sigma公司)、200μmol/l吲哚美辛(sigma公司)、1μmol/l地塞米松和0.5mmol/l3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(ibmx，sigma公司)。每隔2-3d更换新鲜的培养基。分化诱导21天后，进行油红o油滴染色。

成脂诱导分化21天，油红o染色后在倒置显微镜下观察，细胞质中充满红色的油滴，提示细胞已经分化呈脂肪细胞。

2)成骨分化

取第8代细胞，2×10⁴细胞/孔接种于12孔板中。细胞达到70％-80％融合时，吸去培养基，加入成骨分化培养基，成骨分化培养基在低糖imdm培养基中补充有10％胎牛血清、100μmol/l抗坏血酸、10mmol/lβ-甘油磷酸盐和100mmol/l地塞米松(sigma公司)。每隔2-3d换液新鲜的成脂分化培养基。分化诱导21天后，用茜素红进行油滴染色。

成骨诱导分化21天后，运用茜素红进行钙化结节染色，致密生长的细胞中散现大小不一的橘红色矿化结节。染色结果显示扩增的子宫内膜干细胞均有成骨分化能力。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。