本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种干酪乳杆菌的高密度发酵及冷风干燥方法。
背景技术：
干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)作为乳酸菌的一员，是2001年卫生部公布的益生菌之一(张达荣2002)，经常用于乳制品的发酵，尤其是在干酪中应用较多，并且干酪乳杆菌能通过某些特殊氨基酸的代谢能增强干酪的风味，加快干酪的成熟。除此之外，由于干酪乳杆菌能耐受机体的防御机制，通过口服进入人或动物体内，大部分菌体能逃脱胃部的消化进入肠道，并可在肠道大量存活，与肠道黏膜接触，起到促进机体消化、调节肠道菌群的作用，同时某些干酪乳杆菌还被证实有降低胆固醇、抗过敏、增强机体免疫、降血压等益生功能(singhetal2013)。因而，干酪乳杆菌作为活菌疫苗呈递载体的功能越来越受到科研人员的重视(moeinietal2011；stoekeretal2011)。
高密度发酵是指通过适当的培养技术或培养装置，使得其相较常规培养方式显著提高了菌体密度，最终达到提高目标产物比生长率的目的(刘子宇等2005)。对于乳酸菌而言，作为具有功能性健康益处的微生物，由于其益生功效有赖于菌体数量，因此实现乳酸菌的高密度发酵是保证其生产应用的首要条件(李秋琴等2011)。
补料分批发酵是指根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段以某种方式间歇地或连续地补加新鲜培养基，使菌体及其代谢产物的生产时间延长的培养方式(胡榴榴2014)。zhangy等通过恒ph反馈调节产乳酸，乳酸和菌体干重均有一定的升高，且方法操作简单，可用于工业大规模生产(zhangetal2010)。通过尝试不同的补料方法和补料成分，是使用相当广泛的一种高密度发酵方法。
冷风干燥技术是在低温、低湿和高风速的环境下，以干燥低温空气与湿物料接触，利用两相之间的蒸汽压差为动力进行干燥，该技术干燥温度为中低温(5-50℃)，运行费用低，干燥速度快，物料的营养损失少，对物料的干燥厚度有一定要求，可大规模生产，主要用于食品果蔬、谷物、中草药材等热敏性物质(唐官鹏和赵纯清2016)，适合热敏性微生物的干燥，但是利用冷风干燥制备益生菌的研究相对较少。刘丽菲利用冷风干燥技术制备恶臭假单胞菌菌粉，加入合适的载体和保护剂后，干燥存活率74.63％，干燥菌粉活菌数达1.03×1011cfu/g，室温保藏150d活菌数为2.13×109cfu/g，保藏稳定性显著提高(刘丽菲2015)。
对干酪乳杆菌的补料高密度发酵工艺研究较少，大多都在实验室试验，有效活菌数在109～1010cfu/ml,张文齐等利用优化后的mrs培养基培养lactobacilluscaseilc-1，较优化前提高了1个数量级，活菌数达5.8×109cfu/ml(张文齐等2015)；马宏慧等利用优化后的麦芽汁培养基37℃培养lactobacilluscaseiklds1.038112h(马宏慧等2012)，活菌数为1.37×1010cfu/ml；鲍志宁对lactobacilluscaseigbhm-21进行200l中试高密度发酵，获得发酵液活菌数在(1.44-6.42)×1010cfu/ml(鲍志宁2015)。
本技术通过培养基优化，结合控ph补料发酵工艺，获得干酪乳杆菌高密度发酵工艺，同时研究了冷风干燥保护剂以及保存活性，为食品、饲料行业提供高活性干酪乳杆菌制剂。
技术实现要素：
本发明的目的在于根据现有技术的不足，提供了一种干酪乳杆菌的高密度发酵及冷风干燥方法，获得高活性干酪乳杆菌制剂。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种干酪乳杆菌的高密度发酵及冷风干燥方法，包括下述步骤：
将干酪乳杆菌种子液以1-5％接种量接种于发酵培养基，并添加10-30％(v/v)的灭菌新鲜麸皮、枸杞浸提液，34-38℃，80-120r/min控温培养24h，培养过程中流加20％氨水维持ph值5.2-5.4，培养至12h时，补料一次，补料培养基为二倍浓度的发酵培养基，补料体积为发酵培养基起始体积的30-50％；发酵结束后，在发酵液中添加终浓度为10％(w/v)的海藻糖、5％(w/v)的甘露醇和1％(w/v)的吐温80，得发酵后混合物；将发酵后混合物与载体按1.5-2.0:1(v/w)混匀，25-35℃冷风干燥4h即为干酪乳杆菌活菌制剂。
所述的发酵培养基的配方包括：牛肉浸粉30g/l，葡萄糖16.25g/l，乳糖16.25g/l，碳酸钙10g/l，七水硫酸镁0.58g/l，mnso4·h2o0.056g/l，吐温801ml/l，115℃灭菌15min。
所述的灭菌新鲜麸皮、枸杞浸提液，其制备方法包括：100g新鲜麸皮和枸杞的混合物，加水1l，煮沸10min，用4层纱布过滤并挤压至干，留滤液，定容至1l，灭菌后即为浸提液；麸皮和枸杞的质量比为1:1，干重。
所述的载体为：玉米芯粉：脱脂奶粉＝1:1(w/w)的混合物。
以上所述的方案中，优选的，所述的干酪乳杆菌种子液的制备方法包括下述步骤：
将-80℃冷冻保存的干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)在固态mrs平板上划线活化两次，挑取单菌落接种于mrs液态培养基中，37℃培养12h后，以1％接种量转接于种子培养基，培养12h作为种子液。
所述的种子培养基的配方包括：牛肉浸粉10g/l，蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，葡萄糖10g/l，磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸铵2g/l，无水乙酸钠2g/l，七水硫酸镁0.58g/l，mnso4·h2o0.056g/l，吐温801ml/l，115℃灭菌20min。
以上所述的方案中，优选的，所述的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌lactobacilluscaseimcj。
本发明的有益效果是：
1、本发明首次在干酪乳杆菌培养基中添加了麸皮、枸杞浸提液，制备简单、成本低、营养丰富、对提高发酵活菌数直接效果显著，对提高干燥存活率有较好的效果；
2、本发明发酵周期短，放大到2m3发酵罐中发酵24h干酪乳杆菌活菌数达到1011cfu/ml，高于目前干酪乳杆菌实验室试验水平，显著高于目前生产发酵水平；
3、本发明采用冷风干燥制备干酪乳杆菌制剂，使用的保护剂效果显著，干燥存活率大于80％，制剂活菌数大于1011cfu/g，制剂保存效果好，4℃条件下保存60d，活菌率大于80％。
具体实施方式
下面对本发明作进一步详细说明。本发明实施例所述技术方案，如未特备说明，均为本领域的常规技术，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
一种干酪乳杆菌的高密度发酵及冷风干燥方法，包括下述步骤：
1)将-80℃冷冻保存的干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)在固态mrs平板上划线活化两次，挑取单菌落接种于mrs液态培养基中，37℃培养12h后，以1％接种量转接于种子培养基，培养12h作为种子液；
2)2m3发酵罐，发酵培养基的装液量为1m3，添加20％(v/v)的灭菌新鲜麸皮、枸杞浸提液，以3％(v/v，较之于1m3发酵培养基)的接种量接种于发酵培养基，37℃，100r/min控温培养24h，培养过程中流加20％氨水维持ph值5.2-5.4，培养12h时，补料一次，补料培养基为二倍浓度的发酵培养基，补料体积为0.5m3；发酵结束后，在发酵液中添加终浓度为10％(w/v)的海藻糖、5％(w/v)的甘露醇和1％(w/v)的吐温80，得发酵后混合物；将发酵后混合物与载体按1.5:1(v/w)混匀，28℃冷风干燥4h即为干酪乳杆菌活菌制剂。
所述的种子培养基的配方为：牛肉浸粉10g/l，蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，葡萄糖10g/l，磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸铵2g/l，无水乙酸钠2g/l，七水硫酸镁0.58g/l，mnso4·h2o0.056g/l，吐温801ml/l，115℃灭菌20min。
所述的发酵培养基的配方为：牛肉浸粉30g/l，葡萄糖16.25g/l，乳糖16.25g/l，碳酸钙10g/l，七水硫酸镁0.58g/l，mnso4·h2o0.056g/l，吐温801ml/l，115℃灭菌15min。
所述的灭菌新鲜麸皮、枸杞浸提液，其制备方法包括：100g新鲜麸皮和枸杞的混合物，加水1l，煮沸10min，用4层纱布过滤并挤压至干，留滤液，定容至1l，灭菌后即为浸提液；所述的新鲜麸皮和枸杞的混合物中麸皮(干重)和枸杞(干重)的质量比为1:1。
所述的载体为：玉米芯粉：脱脂奶粉＝1:1(w/w)的混合物。
所述的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌lactobacilluscaseimcj；
活菌数检测：
采用mrs固体培养基，并用稀释平板涂布法检测干酪乳杆菌活菌数。
结果如下：
利用上述方法，发酵罐放罐时，发酵液中的有效菌浓度活菌数达到1011cfu/ml，较普通mrs培养基培养的活菌数提高了100倍，实现了干酪乳杆菌的高密度发酵；冷风干燥过程采用载体和保护剂，活菌得率高达80％，制剂活菌数大于1011cfu/g，4℃条件下保存60d，干酪乳杆菌存活率为92％。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，以及部分运用的实施例，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。