本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种增加γ-聚谷氨酸发酵液溶氧的方法。
背景技术：
：γ-聚谷氨酸是由l-谷氨酸或者d-谷氨酸通过γ-酰胺基结合形成的一种水溶性的生物高分子聚合物。具有很强的吸水性，可降解性，水解性等众多特性，因此被广泛用于食品、农业、医药、绿化以及水处理等多个领域，具有极大的开发价值和应用前景。γ-聚谷氨酸的制备方法有化学合成、生物提取和微生物发酵三种方法。微生物发酵法比前两种方法的生产成本低，生产过程对环境的污染小，所以现在主要采用微生物发酵法生产γ-聚谷氨酸，主要生产菌是芽孢杆菌属的菌株，包括各种(纳豆)枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等。微生物发酵生产γ-聚谷氨酸分为固态发酵和液态发酵，目前γ-聚谷氨酸发酵以液体发酵为主。液体发酵过程中随着发酵时间的延长，发酵液粘度逐渐增加，氧气的传质系数及氧气的利用率逐渐降低，溶氧不足进而影响发酵的进行，氧限制已成为影响γ-聚谷氨酸液体发酵的一个重要因素，严重制约了γ-聚谷氨酸发酵产量的提高。邹水洋等(公开号cn102533885a)采用向发酵培养基中补加nacl，通过降低发酵液粘度进而增加发酵液中的溶氧，在添加3％～6％的nacl后γ-聚谷氨酸产量较对照提高10％～40％，最高产量达到29.76g/l。但该专利方法只适用于高盐耐受菌株，对绝大部分盐度耐受度不高的菌株不具有适用性。李海军等(公开号cn103881954a)在枯草芽孢菌株frd518染色体上重组整合了透明颤菌的血红蛋白基因(vgb)，并成功高效表达透明颤菌血红蛋白vhb，显著提高了重组枯草芽孢杆菌低溶氧条件下对氧的利用率，重组后菌株γ-聚谷氨酸产量达到65g/l较原始菌株提高了147％，但基因工程菌株的遗传不稳定性以及基因工程菌株安全问题等因素也限制了基因工程菌株在发酵制备γ-聚谷氨酸上的应用。因此，亟需开发一种能针对所有γ-聚谷氨酸发酵增加发酵液溶解氧的普适方法。技术实现要素：本发明的目的是提供一株生产γ-聚谷氨酸的菌株。为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)jx-6，保藏编号为：cgmccno.13715；该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101；保藏日期为：2017年03月01日。本发明从大酱样品中筛选得到，该菌性状特征如下：1)、形态特征：该菌在lb培养基中的营养细胞为杆状，革兰氏阳性，长2～3μm、宽0.7～0.9μm；在37℃培养3～5天形成芽孢，芽孢大小0.4～0.6×0.8～1.5μm，为长圆形或圆柱形。2)、培养性质：该菌在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板培养：30～40℃培养1天可大量生长，菌落表面凸起，光滑无褶皱，菌落透明，边缘呈规则圆形，菌落粘性大，挑起有丝状。该菌在e型发酵培养基琼脂平板培养：30～40℃培养1d可大量生长，菌落表面凸起、中心凹陷，表面不光滑有褶皱，菌落白色半透明，边缘不规则，菌落表面有液滴，菌落粘性大，挑起有拉丝状。3)、分子生物学鉴定：提取菌株全基因组dna，pcr扩增16srdna片段，测序，测序结果在ncbi中进行比对，比对结果显示该菌株为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)。4)、生理生化性质：如下表所示：表一.jx-6菌部分生理生化特性注：“+”表示反应为阳性；“-”表示反应为阴性。本发明的另一个目的是提供一种具有普适性的增加γ-聚谷氨酸发酵液溶氧的方法。一种增加γ-聚谷氨酸发酵液溶氧的方法，包括如下步骤：将解淀粉芽孢杆菌jx-6接种于已灭菌的斜面活化培养基，经活化培养得到活化菌种；将所述活化菌种接种于已灭菌冷却的种子培养基中，经种子液培养得到种子液；将所述种子液接种在发酵培养基中，发酵过程中添加固态氧，发酵完成后得到发酵液；对所述发酵液进行提取、纯化、透析除盐、冷冻干燥制得含γ-聚谷氨酸的成品。优选的：所述的斜面活化培养基由蛋白胨10g/l，牛肉膏5g/l，nacl5g/l和水组成，ph7.0～7.4；所述的活化培养为30～37℃培养24～48h。优选的：所述的种子培养基由蛋白胨10g/l，牛肉膏5g/l，nacl5g/l和水组成，ph7.0～7.4；所述的种子液培养为30～37℃摇瓶培养24～48h。优选的：所述的发酵培养基为e型培养基：由柠檬酸10g/l，谷氨酸20g/l，硫酸铵10g/l，甘油80g/l，k2hpo41g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，fecl3·6h2o0.02g/l，mnso4·h2o0.1g/l，cacl20.2g/l和水组成，ph7.0。优选的：所述的发酵培养中，将所述种子液按体积分数2％～10％接种量接种于发酵培养基中，在30～37℃摇瓶培养24～48h；然后将固态氧以溶液状态加入培养基中，添加至固态氧在发酵液中的浓度为50～500μmol/l，继续摇瓶培养至96h，终止发酵。优选的：所述的发酵培养中添加的固态氧为na2co4和cao2中的一种或两者的混合物。优选的：所述的固态氧在发酵液中的浓度为200～400μmol/l。优选的：所述的提取是用硫酸调节发酵液ph至3.0，于4800r/min下离心30min去除菌体；所述的纯化是向提取的上清液中加入3倍体积的预冷无水乙醇，4℃静置过夜，离心得γ-聚谷氨酸粗品沉淀；所述的透析除盐是用适量的去离子水溶解粗品，调节ph值为3～4，用透析袋进行脱盐；所述的冷冻干燥是对透析液进行真空冷冻干燥。本发明具有以下有益效果：普适性强，操作简单、成本低廉、无二次污染、对菌株无耐受性要求、便于大规模应用于生产，具有良好的应用前景。具体来说，本发明通过在发酵液中菌体生长进入稳定期后加入固态氧，增加了发酵液的溶氧量，这样在发酵液变粘后加入既保证了发酵液中有足够量的菌体，又通过固态氧分解释放出氧气解除了氧限制，为后续γ-聚谷氨酸的合成提供了有利环境，使γ-聚谷氨酸产量提高。相较于未添加固态氧的方法，本发明可以将γ-聚谷氨酸产量提高近60％。本发明采用的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)jx-6于2017年03月01日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为：cgmccno.13715。具体实施方式下面具体提供优选的实施例，以使本领域技术人员更加清楚本发明的技术方案和效果，但本发明的实施方式不限于此。实施例一1.制备培养基：a.活化培养基组分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，琼脂20g，补水至1000ml，ph7.0～7.4，121℃灭菌30min。b.种子培养基组分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，补水至1000ml，ph7.0～7.4，121℃灭菌30min。c.发酵培养基组分：柠檬酸10g，谷氨酸20g，硫酸铵10g，甘油80g，k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，fecl3·6h2o0.02g，mnso4·h2o0.1g，cacl20.2g，ph7.0，补水至1000ml，121℃灭菌30min。2.活化菌株、制备种子液：将低温冻存的解淀粉芽孢杆菌jx-6接种于斜面活化培养基进行活化，37℃培养24h。将活化好的解淀粉芽孢杆菌jx-6接种于种子培养基中，于37℃转速150r/min摇床培养24h，即得解淀粉芽孢杆菌jx-6的种子培养液。3.发酵：将上步获得的种子液分别接入七个摇瓶发酵培养基中，接种量8％(v/v)，摇瓶装液量100ml/500ml，摇床转速200r/min，在30℃下培养。培养24h后分别向七个摇瓶中加入已灭菌的10mmol/l的过碳酸钠(na2co4)溶液0ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，使发酵液中na2co4浓度分别为0、50、100、200、300、400、500umol/l，继续培养至96h，结束发酵。4.制备成品：a.提取：分别用硫酸调节七组发酵液ph至3.0，于4800r/min下离心30min去除菌体。b.纯化：在提取得到的七组上清液中分别加入3倍体积的预冷无水乙醇，4℃静置过夜，离心得七组γ-聚谷氨酸粗品沉淀。c.透析除盐：分别用适量的去离子水溶解七组粗品，调节ph值为3～4，用透析袋进行脱盐。d.冷冻干燥：对七组透析液分别进行真空冷冻干燥，得七组γ-聚谷氨酸成品。5.产品检测：检测方法：高效液相色谱法色谱条件：岛津lc-20a高效液相色谱，ods-c18柱，紫外检测器(200nm)，流动相a为乙腈-水1:1(v/v)；流动相b为浓度0.02mol/l的乙酸钠水溶液,流动相泵比例：30％a，70％b；流速1.0ml/min、柱温30℃；进样量：10μl。供试品制备：分别将七组γ-聚谷氨酸成品溶于等量去离子水中，各取2.0ml溶解液放入水解管，再加入3.0ml6mol/l的hcl，110℃真空水解24h，获得七组γ-pga水解产物作为供试品。用谷氨酸标准品作为对照，对上述供试品进行衍生化hplc分析，检测γ-聚谷氨酸产量，检测结果如下表所示：表二不同na2co4添加量下γ-聚谷氨酸产量na2co4添加浓度umol/lγ-聚谷氨酸产量g/l提高率％018.91/5020.9610.8410022.6319.6720024.9531.9430028.6051.2440025.7536.1750024.6230.19由表二可知，添加na2co4后，可有效提高γ-聚谷氨酸的产量，其中在添加至浓度为300umol/l时，γ-聚谷氨酸的最高产量达到28.60g/l，与未添加cao2相比，γ-聚谷氨酸产量提高51.24％。实施例二1.制备培养基：a.活化培养基组分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，琼脂20g，补水至1000ml，ph7.0～7.4，121℃灭菌30min。b.种子培养基组分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，补水至1000ml，ph7.0～7.4，121℃灭菌30min。c.发酵培养基组分：柠檬酸10g，谷氨酸20g，硫酸铵10g，甘油80g，k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，fecl3·6h2o0.02g，mnso4·h2o0.1g，cacl20.2g，ph7.0，补水至1000ml，121℃灭菌30min。2.活化菌株、制备种子液：将低温冻存的解淀粉芽孢杆菌jx-6接种于斜面活化培养基进行活化，35℃培养36h。将活化好的解淀粉芽孢杆菌jx-6接种于种子培养基中，于35℃转速200r/min摇床培养36h，即得解淀粉芽孢杆菌jx-6的种子培养液。3.发酵：将上步获得的种子液分别接入六个摇瓶发酵培养基中，接种量5％(v/v)，摇瓶装液量50ml/250ml，摇床转速200r/min，在35℃下培养。培养36h后分别向六个摇瓶中加入已灭菌的10mmol/l的过氧化钙(cao2)悬浊液0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，使发酵液中cao2浓度分别为0、100、200、300、400、500umol/l，继续培养至96h，结束发酵。4.制备成品：a.提取：分别用硫酸调节六组发酵液ph至3.0，于4800r/min下离心30min去除菌体。b.纯化：在提取得到的六组上清液中分别加入3倍体积的预冷无水乙醇，4℃静置过夜，离心得六组γ-聚谷氨酸粗品沉淀。c.透析除盐：分别用适量的去离子水溶解六组粗品，调节ph值为3～4，用透析袋进行脱盐。d.冷冻干燥：对六组透析液分别进行真空冷冻干燥，得六组γ-聚谷氨酸成品。5.产品检测：检测方法、色谱条件和供试品制备均与实施例一相同，用谷氨酸标准品作为对照，对上述供试品进行衍生化hplc分析，检测γ-聚谷氨酸产量，检测结果如下表所示：表三不同cao2添加量下γ-聚谷氨酸产量cao2添加浓度umol/lγ-聚谷氨酸产量g/l提高率％020.69/10023.0511.4120025.9425.3730029.6543.3140027.6333.5450025.4322.91由表三可知，添加cao2后，可有效提高γ-聚谷氨酸的产量，其中在添加至浓度为300umol/l时，γ-聚谷氨酸的最高产量达到30.14g/l，与未添加cao2相比，γ-聚谷氨酸产量提高43.31％。实施例三1.制备培养基：a.活化培养基组分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，琼脂20g，补水至1000ml，ph7.0～7.4，121℃灭菌30min。b.种子培养基组分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，补水至1000ml，ph7.0～7.4，121℃灭菌30min。c.发酵培养基组分：柠檬酸50g，谷氨酸100g，硫酸铵50g，甘油400g，k2hpo45g，mgso4·7h2o2.5g，fecl3·6h2o0.1g，mnso4·h2o0.5g，cacl21g，ph7.0，补水至5l，121℃灭菌30min。2.活化菌株、制备种子液：将低温冻存的解淀粉芽孢杆菌jx-6接种于斜面活化培养基进行活化，37℃培养24h。将活化好的解淀粉芽孢杆菌jx-6接种于种子培养基中，于37℃转速150r/min摇床培养24h，即得解淀粉芽孢杆菌jx-6的种子培养液。3.发酵：在10l微生物发酵罐中加入5l发酵培养基，将上步获得的种子液按5％(v/v)的接种量接入发酵培养基中，在37℃下培养，通气量为1(vvm)，搅拌速率400r/min。培养48h后加入na2co4浓缩液，使发酵液中na2co4浓度为300umol/l，继续培养至96h，结束发酵。4.制备成品：a.提取：用硫酸调节发酵液ph至3.0，于4800r/min下离心30min去除菌体。b.纯化：在提取得到的上清液中加入3倍体积的预冷无水乙醇，4℃静置过夜，离心得γ-聚谷氨酸粗品沉淀。c.透析除盐：用适量的去离子水溶解粗品，调节ph值为3～4，用透析袋进行脱盐。d.冷冻干燥：对透析液进行真空冷冻干燥，得六组γ-聚谷氨酸成品。5.产品检测：检测方法、色谱条件和供试品制备均与实施例一相同，用谷氨酸标准品作为对照，对上述供试品进行衍生化hplc分析，检测γ-聚谷氨酸产量。γ-聚谷氨酸的产量达到38.14g/l，与未添加na2co4相比，γ-聚谷氨酸产量提高56.28％。实施例四1.制备培养基：a.活化培养基组分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，琼脂18～20g，补水至1000ml，ph7.0～7.4，121℃灭菌30min。b.种子培养基组分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，补水至1000ml，ph7.0～7.4，121℃灭菌30min。c.发酵培养基组分：柠檬酸300g，谷氨酸600g，硫酸铵300g，甘油2400g，k2hpo430g，mgso4·7h2o15g，fecl3·6h2o0.6g，mnso4·h2o3g，cacl26g，ph7.0，补水至30l，121℃灭菌30min。2.活化菌株、制备种子液：将低温冻存的解淀粉芽孢杆菌jx-6接种于斜面活化培养基进行活化，37℃培养24h。将活化好的解淀粉芽孢杆菌jx-6接种于种子培养基中，于37℃转速150r/min摇床培养24h，即得解淀粉芽孢杆菌jx-6的种子培养液。3.发酵：在50l微生物发酵罐中加入30l发酵培养基，将上步获得的种子液按10％(v/v)的接种量接入发酵培养基中，在35℃下培养，通气量为0.8(vvm)，搅拌速率400r/min。培养36h后加入na2co4和cao2的浓缩液，使发酵液中na2co4浓度为200umol/l、cao2浓度为100umol/l，继续培养至96h，结束发酵。4.制备成品：a.提取：用硫酸调节发酵液ph至3.0，于4800r/min下离心30min去除菌体。b.纯化：在提取得到的上清液中加入3倍体积的预冷无水乙醇，4℃静置过夜，离心得γ-聚谷氨酸粗品沉淀。c.透析除盐：用适量的去离子水溶解粗品，调节ph值为3～4，用透析袋进行脱盐。d.冷冻干燥：对透析液进行真空冷冻干燥，得六组γ-聚谷氨酸成品。5.产品检测：检测方法、色谱条件和供试品制备均与实施例一相同，用谷氨酸标准品作为对照，对上述供试品进行衍生化hplc分析，检测γ-聚谷氨酸产量。γ-聚谷氨酸的产量达到46.62g/l，与未添加cao2和na2co4相比，γ-聚谷氨酸产量提高58.21％。核苷酸或氨基酸序列表sequencelisting<110>中国科学院成都生物研究所<120>一种增加γ-聚谷氨酸发酵液溶氧的方法<160>1<210>1<211>1491<212>dna<213>解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)<400>1tggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatggga60gcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaag120actgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttc180agacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagtt240ggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggcca300cactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgca360atggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaag420ctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaa480ccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgtt540gtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcc600cccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagt660ggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggc720gactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattaga780taccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgcccctt840agtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaact900caaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacg960cgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttc1020gggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggtt1080aagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaa1140ggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgcccctt1200atgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggt1260taagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtga1320agctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttg1380tacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttt1440taggagccagccgccgaaggtgggacagatgattggggtgaagtcgtaaca1491当前第1页12