兔肉中己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚标准样品、制备方法及应用与流程

本发明属于分析化学领域，涉及一种兽药残留的自然基体标准样品的制备，具体地说，涉及一种兔肉中己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚残留基体冻干粉标准样品及其制备方法与应用。

背景技术：

己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)己烷雌酚(Hexoestrolum，HEX)和双烯雌酚(Dienestrol,DS)均属1,2-二苯乙烯类化合物，为非甾体类同化激素。三者均为无色结晶或白色结晶性粉末，在甲醇中易溶，在乙醇、乙醚或脂肪油中溶解，在三氯甲烷中微溶，在水中几乎不溶；在稀氢氧化钠溶液中溶解。具有增加蛋白质沉积和减少脂肪沉积的作用而被广泛应用于促进畜禽生长、增加瘦肉率等,并且双烯雌酚经实验确证为己烯雌酚的代谢物,己烯雌酚和双烯雌酚均具有化学结构简单、并且通过化学合成容易获得、合成成本较低的特点。在水产养殖中,己烯雌酚的主要用途是作为添加剂加入鱼类饲料中,刺激鱼类正常新陈代谢,增加鱼体内氮停留,提高鱼体内氨基酸合成蛋白的速度,最终达到促进鱼类生长的目的。其中残留在鱼体内的己烯雌酚和双烯雌酚通过食物链进入人体,破坏人体正常生理平衡,两种物质对人类的危害也被逐渐发现,己烯雌酚与雌激素受体结合后会干扰人的内分泌，诱发生殖器病变与肿瘤,在体内的长期蓄积必然严重危害人和动物的健康。20世纪70～90年代，毒理学研究表明这些化合物会干扰人体正常的激素平衡，导致机体代谢紊乱，肿瘤，儿童早熟，胎儿畸形等严重的问题，美国和欧盟已经明令禁止使用己烯雌酚，我国农业部也于1988年6月30日发布的《兽药管理条例实施细则》中规定“不得添加激素类药品”。2002年,我国农业部在第193号公告中宣布停止己烯雌酚在所有食用动物中使用；并在第235号公告中规定己烯雌酚在动物性食品中不得检出,但目前的相关法令和标准尚未制定双烯雌酚的测定标准。

在食品安全检测体系中，标准样品对整个检测质量控制体系起到核心作用。在国际上，一种兽药残留量的分析方法的建立需要经3种类型的样品测试：受控组织或液体、用药物强化至或接近最大容许水平(MRL)的样品和本身具有药物残留的组织 样品，从而保证分析方法能具有一定的样品基质适用范围和重复性。欧盟对兽药残留分析方法与结果表达的法规(2002/657/EC)中明确指出了需要采用实物标准样品进行检测过程控制，可见实物标准样品在兽药残留检测中的具有十分重要的意义。

目前用于非甾体类同化激素残留检测的主要是纯标准品，检测质量控制主要是通过向样品中添加纯的标准品后进行检测分析，这种分析方法无法代表目标分析物在活体内真正存在的状态，不能真实地重现药物经过自然代谢后在动物体内的提取效率，无法反映方法的准确性。由于目标物和基体结合情形与真实检测样品不完全一致而导致提取、净化等处理结果与日常分析样本存在较大差异，从而影响结果的可靠性和有效性。另外，一般标准样品前期制备过程中添加有维生素C等抗氧化剂，导致标准样品在后期的相关药物残留检测分析等的应用过程中对实验结果造成干扰和影响。

技术实现要素：

为了解决现有技术中非甾体类同化激素药物残留检测不能真实地重现药物经过自然代谢后在动物体内的提取效率，无法反映方法的准确性，影响结果的可靠性和有效性，且存在抗氧化剂影响使用结果的技术问题，本发明的一个目的是提供兔肉中己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚标准样品的制备方法与应用。本发明的另一个目的是提供本方法制备的兔肉中己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚标准样品。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：兔肉中己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚标准样品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)、选择实验用兔，人工饲喂添加己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚的饲料，使兔体内含有己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚；

B)、给药结束后，宰杀、取大块肌肉，搅碎，混匀制成肉糜，均质、真空冷冻干燥得到粗样；

C)、研磨步骤B所述粗样，过筛，得到兔肉冻干粉标准样品；

D)、封装所述标准样品，冷藏保存；

E)、检验所述标准样品的均匀性和稳定性；

F)、对所述标准样品中的己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚含量进行定值。

所述步骤A中实验动物的选择，操作为：在养兔场筛选个体健康，体重1.5-2.5kg左右的獭兔，雌雄随机，在20℃-25℃环境下隔离，每日上午8时喂食1次，驯养3日后备用，给药前一天禁食。

所述步骤A中药物添加，操作为：称取己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚三种药物各0.2～2.6g，同时加入到2.0kg饲料中，搅拌均匀，即配制出三种药物浓度为0.1～1.3g/kg的饲料A。

所述步骤A中采用人工饲喂方式进行实验，操作为：每只兔每日饲喂饲料A 87g，即投药剂量为3.5～75.4mg/kg体重；每日给药一次，连续给药3-6日。

所述步骤B中的宰杀时间为最后一次给药结束后6～12h。

所述步骤B中的真空冷冻干燥条件为：预冷冻阶段：-80℃--30℃，相应预冷时间0.5-10h；真空冷冻阶段：压力控制在0.01-1.0mbar，相应时间8-15h；干燥升华阶段：-10℃-30℃，相应时间2-10h。

所述步骤C过筛的目数为30～80目。

所述步骤D中所用瓶子为带有铝箔垫片的白色聚乙烯塑料瓶，每瓶装10g冻干粉，电磁感应封盖，2-8℃冷藏保存。

所述标准样品中己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚的含量为10～3000μg/kg。

本发明的显著优点是：

1)给兔饲喂添有己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚的饲料，选择适当时机，宰杀，取肌肉部分匀浆制成肉糜，冷冻干燥，过筛，分装密封包装；

2)均匀性检验、稳定性研究和协作定值检测，通过给药控制和采集时机的选择可获得预期含量的己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚阳性材料；

3)本发明的产品可以在常温下运输，保质期长，目标物和基体结合情形与真实检测样品一致，标准样品为实物标准样品，均匀稳定，无防腐剂及抗氧化剂，易保存，用于非甾体类同化激素类药物残留测试项目的能力验证、检测方法的验证、测试仪器的校准、测试结果的质量控制与考核。

附图说明

图1为己烯雌酚的化学结构式。

图2为己二烯雌酚的化学结构式。

图3为己烷雌酚的化学结构式。

图4为本发明的标准样品制备工艺流程图。

图5为本发明的标准样品的LC-MS谱图。

具体实施方式

如图4所示，本发明的兔肉中己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚标准样品的制备方法，包括以下步骤：A)药物喂养；B)取样、去杂质、匀浆；C)真空冷冻干燥；D)研磨、筛分、混样、封装；E)均匀性和稳定性检验；F)确定己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚含量。

下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一种兔肉中己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚标准样品的制备方法，其具体步骤如下：

(1)实验动物的选择：在养兔场筛选个体健康，体重2kg的獭兔，雌雄随机。在25℃环境下隔离，每日上午8时喂食1次，驯养3日后备用，给药前一天禁食；

药物饲养：称取三种药物(己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚)各1.93g，同时加入到2.0kg饲料中，搅拌均匀，即配制出三种药物浓度均为0.97g/kg的饲料A。每只兔每日饲喂上述饲料A 87g，即三种药物投药剂量均为42mg/kg体重；每日给药一次，连续给药5日；

(2)给药5日后，即最后一次给药结束8h后，宰杀后取肌肉，搅碎，混匀制成肉糜；

(3)真空冷冻干燥：采用真空冷冻干燥机(CHRiST Epsilon 2-6D)进行冷冻干燥，物料厚度2cm，-50℃预冷冻6h，0.1mbar真空冷冻10h，-10℃-30℃快速升温干 燥8h，直至完全干燥，得到己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚阳性冻干粗粉；

(4)研磨、过筛：冻干粉用中药粉碎机粉碎，组织研磨机细磨，过30目筛，取筛下部分；

(5)分装及保存：用带有铝箔垫片的白色聚乙烯塑料瓶分装，每瓶装10g冻干粉，电磁感应封盖，4℃冷藏保存。

采用LC-MS检测实施例1制备的样品，结果如图5所示，证实标准样品中含有己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚。

实施例2

本实施例中重复实施例1中的制备过程，不同的实验条件为：

1)实验动物选择体重为2.5kg；

2)称取己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚各0.2g；

3)三种药物投药剂量均为3.5mg/kg体重；

4)连续给药6日；

5)最后一次给药结束6h后宰杀；

6)-80℃预冷冻0.5h，0.01mbar真空冷冻8h，快速升温干燥2h；

7)过50目筛；

8)5℃冷藏保存。

实施例3

本实施例中重复实施例1中的制备过程，不同的实验条件为：

1)实验动物选择体重为1.5kg；

2)称取己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚各2.0g；

3)三种药物投药剂量均为58mg/kg体重；

4)连续给药3日；

5)最后一次给药结束12h后宰杀；

6)-30℃预冷冻10h，1.0mbar真空冷冻15h，快速升温干燥10h；

7)过80目筛；

8)8℃冷藏保存。

实施例4

对实施例1中样品进行均匀性与稳定性检验：

1.均匀性检验

采用单因素方差分析方法进行均匀性检验，随机抽取12瓶实例1制备的样品，每瓶样品平行测定2次。所有试料以随机次序在重复性条件下测试，即在同一实验室中由相同的人员使用相同的测试方法和仪器在较短时间内测试。

测试方法：称取0.5g样品，加4.5ml水还原15min，按SN/T 3235-2012出口动物源食品中多类禁用药物残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法进行检测。

采用以下单因素方差分析进行均匀性评价。

抽取i个样品(i＝1、2、3、…m)，每个样品在重复条件下测试j次(j＝1、2、3、…n)。

每个样品的测试平均值

全部样品测试的总平均值

测试总次数

样品间平方和均方

样品内平方和均方

自由度f₁＝m-1

f₂＝N-m

统计量

均匀性检测结果及评价见表1。

表1实例1制备的样品均匀性检测结果及统计分析

单位：μg/kg

以上结果可知：当α＝0.05，f₁＝11，f₂＝12,查F分布表，F临界值为2.72，因F统计值(2.11、1.91、2.38)<F临界值2.72，表明样品内及样品间无显著性差异，说明样品是均匀的，能够满足质控等实验要求。

采用相同方法，验证实施例2、3制得的标准样品的均匀性，验证实施例2制得的标准样品的均匀性，以己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚分别统计，F比为2.05、1.99、2.01。验证实施例3制得的标准样品的均匀性，以己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚分别统计，F比为2.02、2.18、1.94。F比均小于F临界值2.72，表明实施例2、3制得的标准样品样品内及样品间无显著性差异，说明样品是均匀的，能够满足质控等实验要求。

2.稳定性检验

2.1长期稳定性检验

按照时间间隔前密后疏的抽样原则，分别按下列时间随机抽取用于稳定性测试的包装好的实施例1制备的样品：第0、2、4、6、9、12、18月。每次抽取3个样品进行测试。在全部稳定性测试中，所用人员、仪器、测试方法和实验室均与均匀性测试相同。结果及统计分析如表2所示。

用线性拟合模型评估标准样品的稳定性，以X代表时间，Y代表标准样品中目标药物的含量，斜率b₁用下式计算：

斜率的估计值：

截距的估计值：

直线上每点的标准偏差公示：

与斜率相关的不确定度：

当|b₁|＜t_0.95,n-2·s(b₁)，表明斜率变化不显著，即标准样品是稳定的。

表2样品长期稳定性检查及统计分析

单位：μg/kg

自由度为n-2和p＝0.95(95％置信水平)的分布即t_0.95,(n-2)＝2.57,由于|b₁|＜t_0.95,n-2·s(b₁)，故斜率不显著的，即未观测到不稳定性，验证实施例1制得的标准样品的稳定性良好。

2.2短期稳定性检验

短期稳定性检验：即考察标准样品在运输条件下的稳定性，采用快递方式运输标准样品，大部分地区3-4天都能收到样品，极个别的地方9天之内也能送达。运输时，将样品放置于隔热泡沫塑料箱中然后置冰块一起运输。运输时，将样品放置于隔热泡沫箱中然后置冰块一起运输。随机抽取冷藏保存的样品6瓶，用特快专递于8月中旬寄到新疆乌鲁木齐，到达乌鲁木齐后原封再寄回大连，同样方式随机抽取冷藏保存的样品6瓶，用特快专递于12月中旬寄到黑龙江漠河，到达漠河后原封再寄回大连。样品寄出到寄回所有时间为10d。对寄回的样品(运输后样品)采用SN/T 3235-2012方法进行检测，并与未经运输的样品(运输前样品)作比对分析实验。

用t检验法对运输前后样品的测定值进行一致性检验，检验公式为：

统计量t计算：

计算出t实验，与比较，如果t实验小于临界值，则认为该标准样品的特性量值没有发生显著性变化，否则认为有显著性差异。结果见表3。

表3样品短期稳定性检验结果及统计分析

从表3可以得出，t实验值均小于查表值(2.228)，表明该标准样品的特性量值运输前后的测定值具有一致性。验证实施例1制得的标准样品的短期稳定性良好。

采用上述相同方法，验证实施例2、3制得的标准样品的稳定性，斜率均不显著，未观测到实施例2、3制得的标准样品不稳定性，结果表明实施例2、3制得的标准样品稳定性良好。

实施例5

标准样品中己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚含量的定值：

八家实验室采用LC-MS/MS方法对实施例1制备的标准样品进行协同定值。对经过均匀性和稳定性检验合格的样品，随机抽取40瓶，分别分发到8家参加定值的实验室进行检测，结果见表4。8个实验室的定值数据采用夏皮罗－威尔克(Shapiro－Wilk)检验法考察其正态性。在近似符合正态性的前提下，再经Grubb’s法检验确认每个实验室数据是否存在异常值，用科克伦(Cochran)检验各实验室定值数据是否等精度，结果表明所有的数据均通过检验，各实验室测试精度一致。

表4合作定值实验室测试结果

单位：μg/kg

定值结果由标准值和不确定组成。对于多家实验室协作定值方式，标准值是多家实验室的总平均值。标准值的总不确定主要来源于定值结果的不确定度、样品不均匀性引起的不确定度、稳定性引起的不确定度。

假定各变量是独立的，与CRM特性值有关的不确定度可表示为：

其中u_char是指定值过程引入的不确定度，u_bb是指样品不均匀性引入的不确定度，u_lts是指样品长期稳定性引入的不确定，u_sts是指样品短期稳定性引入的不确定度。

扩展不确定可由合成标准不确定度乘以包含因子，取k＝2(置信区间95％)，得扩展不确定：U＝k×u_{C R M}

通过统计分析，采用标准值±扩展不确定度的方式表示定值结果，最终确定实施 例1中制备的标准样品：己烯雌酚含量(2351±87)μg/kg，k＝2、己二烯雌酚含量(684±31)μg/kg，k＝2、己烷雌酚含量(135±10)μg/kg，k＝2。

采用上述相同方法，对实施例2、3的标准样品的己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚含量进行合作定值，采用标准值±扩展不确定度的方式表示实施例2制备的标准样品：己烯雌酚含量(196±8)μg/kg，k＝2、己二烯雌酚含量(59±3)μg/kg，k＝2、己烷雌酚含量(12±1)μg/kg，k＝2。实施例3制备的标准样品：己烯雌酚含量(2798±99)μg/kg，k＝2、己二烯雌酚含量(945±43)μg/kg，k＝2、己烷雌酚含量(186±14)μg/kg，k＝2。

实施例6

兔肉中己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚标准样品的应用：

首先将实施例1制备的标准样品分发给相应实验室1-3及其人员，提供标准操作指导，然后进行实验，报告检测结果(μg/kg表示)及测量不确定度，用En值对各实验结果进行评价，En数由下式计算：

式中，

LAB和REF分别表示参试实验室和标准样品的测试结果；

U_LAB和U_REF分别表示贵实验室和标准样品测试结果的测量不确定度。

判断标准：|En|≤1，满意结果；En数的绝对值大于1时，为不满意结果，实验室应调查原因，采取进一步的纠正措施并重新进行。

如表5所示，实验室2三个检测项目的|En|均小于1，为满意结果，说明实验室2具备相应的检测能力，实验室1的己二烯雌酚和己烷雌酚、实验室3己烯雌酚的|En|均大于1，为不满意或离群的结果，说明实验室1和3不具备相应的检测能力。对于报告不满意或离群结果的实验室，应查找原因，提出相应的整改措施，提高检测水平。结果显示制备的标准样品达到了试验要求，能够有效的保证该类兽药残留检测盲样比对测试质量控制活动。

表5样品用于质量控制活动结果

进一步还可以将采用本发明的制备方法制备的标准样品用于检测方法的验证、测试仪器的校准、测试结果的质量考核等。

上述实施方式仅用来解释本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。