本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及一种基因工程菌及其构建方法与生产香兰素的方法，尤其是一种生产香兰素的基因工程菌及其构建方法与利用该菌株以葡萄糖、甘油等廉价碳源生产香兰素的方法。
背景技术：
香兰素(vanillin)，又名香草醛，化学名为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，为白色或微黄色结晶，具有香荚兰香气及浓郁的奶香，是人们普遍喜爱的奶油香草香精的主要成分。香兰素是目前世界上产量最大的合成香料。香兰素的合成方法主要有化学合成法和微生物转化法。其中化学合成法产率高，成本低，但存在着原料愈创木酚等有毒、环境污染较严重，产品不具备天然性等问题。
近年来，随着生物学，尤其是合成生物学的迅速发展，微生物法制备香料因反应条件温和，能保持食品的天然性而越来越受关注。利用微生物转化法生产天然香兰素方面的研究已取得了很多重要的研究成果，但仍存在许多科学问题需要深入的探索研究，而且高效益的工业化生产也亟待进一步的优化。现有的研究中，多以阿魏酸、丁香酚、异丁香酚等原料为底物，通过生物催化或生物转化法生产香兰素。然而这些原料存在成本高、来源复杂及毒性等不足之处。使用如葡萄糖等廉价的天然原料，开发合成天然香兰素的新途径，达到工业化生产需要的高产量，是现阶段生物法制备香兰素研究领域的瓶颈，亟待突破性的创新研究。
1998年li等利用重组大肠杆菌以葡萄糖为底物经莽草酸途径生产香草酸，在体外由粗糙脉孢菌产生的芳香酸还原酶催化下，生产微量的香兰素，但该方法步骤繁琐。2009年hansen等通过代谢工程方法改造粟酒裂殖酵母及酿酒酵母，改造后的菌株分别可以以葡萄糖为底物，可产生65mg/l及45mg/l香兰素，然而该方法一方面产生了异香兰素这一难以分离的副产物，另一方面由于酵母对香兰素降解能力较强及香兰素对菌体的毒性，需要将香兰素进一步衍生为葡糖苷-香兰素，不利于后续的应用。2015年，许平等利用代谢工程方法改造大肠杆菌，构建的菌株以酪氨酸为底物生产97.2mg/l香兰素，以葡萄糖、木糖和甘油等底物分别产生19.3mg/l、13.3mg/l和24.7mg/l香兰素，但该路径引入的外源基因较多，路线较长，效率有待提高。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明针对现有技术的缺陷，提供一种基因工程菌，所述菌株能够以葡萄糖、甘油等廉价底物发酵生产香兰素，可以获得香兰素的有效积累。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种基因工程菌，其中一个或多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因被突变，并且/或者一个或多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因被敲除或失活，并且/或者一个或多个与香兰素代谢相关的基因被敲除或失活，并且/或者一个或多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因表达被增强，并且/或者一个或多个与香兰素生产途径相关的基因表达被增强。
优选地，所述被突变的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroffbr、arogfbr或trpefbr中至少一个。所述突变基因aroffbr、arogfbr、trpefbr具有代谢终产物抗反馈抑制的特性。
更优选地，所述aroffbr的突变为148位脯氨酸突变成亮氨酸。
优选地，所述被敲除或失活的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroe。
优选地，所述被敲除或失活的与香兰素代谢相关的基因为yqhc、yqhd、dkga、yahk或yjgb中至少一个。
优选地，所述被过表达的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroffbr和/或arob。
优选地，所述被过表达的与香兰素生产途径相关的基因为3-脱氢莽草酸脱水酶基因aroz，o-甲基转移酶基因comt或香草酸还原酶基因car中至少一个。
其中，优选地，所述3-脱氢莽草酸脱水酶来源于芽孢杆菌属(蜡状芽孢杆菌或苏云金杆菌)。更优选地，所述3-脱氢莽草酸脱水酶基因与seqidno.1的核酸序列杂交，并且编码具有3-脱氢莽草酸脱水酶活性的蛋白质，其中所述3-脱氢莽草酸脱水酶来源于蜡状芽孢杆菌。
优选地，所述o-甲基转移酶来源于番茄、人、中国对虾、黄色黏球菌、甜椒或罗勒。更优选地，所述o-甲基转移酶基因与seqidno.3的核酸序列杂交，并且编码具有o-甲基转移酶活性的蛋白质，其中所述o-甲基转移酶来源于番茄。
优选地，所述香草酸还原酶来源于艾阿华诺卡氏菌或粗糙脉孢菌。更优选地，所述香草酸还原酶基因与seqidno.9的核酸序列杂交，并且编码具有香草酸还原酶活性的蛋白质，其中所述香草酸还原酶来源于艾阿华诺卡氏菌。
在一个实施方案中，所述的基因工程菌中被突变、被敲除或灭活、被增强的基因是组合表达在合适拷贝的表达载体上或整合在基因组上。
在一个优选实施方案中，所述的基因工程菌中所述被突变的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroffbr的148位脯氨酸突变成亮氨酸；所述被敲除或失活的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroe；所述被敲除或失活的与香兰素代谢相关的基因为yqhc、yqhd、dkga、yahk和yjgb；所述被过表达的与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroffbr和arob；所述被过表达的与香兰素生产途径相关的基因为aroz、comt和car。
在某一具体实施例中，所述的基因工程菌命名为cffsh003，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2016770。
本发明提供了一种重组载体，在prsfduet-1载体的多克隆位点插入3-脱氢莽草酸脱水酶基因aroz和o-甲基转移酶基因comt，该载体命名为prsfduet-aroz-comt。优选的，所述3-脱氢莽草酸脱水酶基因来源于蜡状芽孢杆菌，所述o-甲基转移酶基因comt来源于番茄。
本发明还提供了一种重组载体，在petduet-1载体的多克隆位点插入香草酸还原酶基因car，该载体命名为petduet-car。优选的，所述香草酸还原酶基因car来源于艾阿华诺卡氏菌。
本发明还提供了一种重组载体，在pacycduet-1载体的多克隆位点插入arob和aroffbr基因，命名为pacycduet-arob-aorffbr。其中所述aroffbr是经突变的。
优选地，所述aroffbr基因中148位脯氨酸突变成亮氨酸。
本发明还提供了所述基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
a、敲除或失活菌株中一个或多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因，获得工程菌株ⅰ；并且/或者
b、敲除或失活菌株中一个或多个与香兰素代谢相关的基因，获得工程菌株ⅱ；并且/或者
c、突变菌株中一个或多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因，获得工程菌株ⅲ；
d、增强菌株中一个或多个与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因的表达，获得重组载体i；
e、增强菌株中一个或多个与香兰素生产相关的基因的表达，获得重组载体ii；
f、将含有步骤d的重组载体i和步骤e的重组载体ii转入步骤a工程菌株ⅰ、步骤b工程菌株ⅱ或步骤c工程菌株ⅲ。
优选地，所述步骤a中与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroe。
优选地，所述步骤b中与香兰素代谢相关的基因为yqhc、yqhd、dkga、yahk或yjgb中至少一个。更优选的，步骤b中与香兰素代谢相关的基因为yqhc、yqhd、dkga、yahk和yjgb。
优选地，所述步骤c中与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroffbr、arogfbr或trpefbr中至少一个。更优选的，步骤c中与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroffbr，其中所述aroffbr的突变为148位脯氨酸突变成亮氨酸。
优选地，所述步骤d中与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroffbr和/或arob。更优选地，所述步骤d中与3-脱氢莽草酸代谢途径相关的基因为aroffbr和arob，其中所述aroffbr为148位脯氨酸突变成亮氨酸。
优选地，所述步骤e中与香兰素生产途径相关的基因为3-脱氢莽草酸脱水酶基因aroz，o-甲基转移酶基因comt或香草酸还原酶基因car中至少一个。更优选地，为aroz、comt和car。
优选地，步骤d所述重组载体为pacycduet-arob-aorffbr，步骤e所述重组载体为prsfduet-aroz-comt和/或petduet-car。
本发明对大肠杆菌中3-脱氢莽草酸代谢途径进行改造，缺失了莽草酸脱氢酶编码基因aroe，同时缺失了香兰素降解相关基因，使菌株累积大量的3-脱氢莽草酸，并增强3-脱氢莽草酸脱水酶基因、o-甲基转移酶基因和香草酸还原酶基因以及3-脱氢莽草酸代谢途径的2个基因的表达，构建获得香兰素的生产菌株，可用于发酵法生产香兰素。本发明获得的基因工程菌能够以葡萄糖、甘油等廉价底物发酵生产香兰素，可以获得香兰素的有效积累。因此本发明提供了所述基因工程菌在生产香兰素中的应用。
本发明还提供了一种生产香兰素的方法，使用本发明所述基因工程菌作为发酵生产菌。
优选地，所述生产香兰素的方法，具体包括以下步骤：
(1)平板培养：将本发明所述基因工程菌接种至含有氨苄霉素、卡那霉素和氯霉素的lb培养基固体平板上，37℃培养过夜；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株接种至含有氨苄霉素、卡那霉素和氯霉素的lb液体培养基中，37℃培养过夜；
(3)发酵培养：将步骤(2)中得到的种子液接种到含有氨苄霉素、卡那霉素、氯霉素和iptg的发酵培养基中，25℃培养48小时，得到含香兰素的发酵液。
优选地，步骤(1)中所述氨苄霉素的浓度为100μg/ml；卡那霉素的浓度为50μg/ml；氯霉素的浓度为25μg/ml。
优选地，步骤(2)中所述氨苄霉素的浓度为100μg/ml；卡那霉素的浓度为50μg/ml；氯霉素的浓度为25μg/ml。
优选地，步骤(3)中所述氨苄霉素的浓度为100μg/ml；卡那霉素的浓度为50μg/ml；氯霉素的浓度为25μg/ml；iptg的浓度为0.2mm。
优选地，步骤(1)～(2)中所述的lb培养基配方为胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l。其中lb固体培养基另外添加2％琼脂。
优选地，步骤(3)中所述的发酵培养基为lb培养基、添加20g/l葡萄糖的lb培养基或wvp培养基。
其中，所述wvp培养基的配方为kh2po47.5g/l、(nh4)2so42.96g/l、mgso40.24g/l、柠檬酸铵0.3g/l、一水合柠檬酸2.1g/l、苯丙氨酸0.7g/l、酪氨酸0.7g/l、色氨酸0.7g/l、对氨基苯甲酸0.01g/l、2,3-二羟基苯甲酸0.01g/l、对羟基苯甲酸0.01g/l、(nh4)6(mo7o24)·4h2o0.0037g/l、znso4·7h2o0.0029g/l、h3bo30.0247g/l、cuso4·5h2o0.0025g/l、mncl2·4h2o0.0158g/l、葡萄糖或甘油20g/l。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种基因工程菌及其构建方法与生产香兰素的方法。本发明所述基因工程菌对大肠杆菌中3-脱氢莽草酸代谢途径进行改造，缺失了莽草酸脱氢酶基因，同时缺失了香兰素降解相关基因，使菌株累积大量的3-脱氢莽草酸，并增强了3-脱氢莽草酸脱水酶基因、o-甲基转移酶基因和香草酸还原酶基因以及3-脱氢莽草酸代谢途径的2个基因的表达，从而增加香兰素的产量，同时减少香兰素的降解，使发酵液中香兰素的量增多，进而提高菌株发酵产香兰素的能力。实验表明本发明所述基因工程菌可利用葡萄糖或甘油等廉价碳源为底物生产香兰素，经48小时发酵，以lb培养基、添加20g/l葡萄糖的lb培养基、添加20g/l葡萄糖的wvp培养基或添加20g/l甘油的wvp培养基，产生的香兰素最高产量分别为24.1mg/l，88.5mg/l，85.8mg/l，51.2mg/l。采用本发明的方法发酵产生的香兰素发酵液中无异香兰素杂质，便于后续分离，具有很好的应用前景。
生物保藏信息：
菌株大肠杆菌cffsh003：分类命名：大肠埃希氏菌，escherichiacoli.于2016年12月20日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏中心地址中国武汉，武汉大学，保藏编号为cctccno:m2016770。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为不同基因敲除菌株对香兰素的降解情况测试。
具体实施方式
本发明公开了一种生产香兰素的代谢工程菌及其构建方法与生产香兰素的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中lb培养基配方为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l；固体培养基添加2％琼脂；在使用前进行高压蒸汽灭菌，121℃，20min。
实施例1：大肠杆菌bl21(de3)中敲除莽草酸脱氢酶编码基因aroe
利用pcrtargeting技术，敲除大肠杆菌bl21(de3)中莽草酸脱氢酶编码基因aroe，获得的菌株命名为wyv5。具体操作如下：
以bl21(de3)菌株基因组为模板，分别利用引物对aroe_up_s、aroe_up_a和aroe_dw_s、aroe_dw_a扩增aroe基因上下游同源臂，同时以pkd3为模板，以引物对aroe-cm_s、aroe-cm_a扩增氯霉素抗性基因片段，将三个片段通过重叠pcr扩增获得aroe基因敲除片段aroe::cm，引物序列如下：
aroe_up_s：5′-aacggaagccgttttcggtg-3′；
aroe_up_a：5′-cattatgttacccctgtcga-3′；
aroe-cm_s：5′-aatccgcgatgccctgacgggtgaactgtttcgacaggggtaacataatggtgtaggctggagctgcttc-3′；
aroe-cm_a：5′-attctcgtcccactcttccctgtccggaaactggatggcctgattcacgccatatgaatatcctccttag-3′；
aroe_dw_s：5′-gcgtgaatcaggccatccag-3′；
aroe_dw_a：5′-tccacggctgcaccattggc-3′。
将pkd46质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)，挑取单克隆接种至lb液体培养基(含氨苄霉素100μg/ml)，30℃，220rpm过夜培养后，以1％转接量转接至50mllb液体培养基(含氨苄霉素100μg/ml，l-阿拉伯糖10mm)，30℃，220rpm培养至a6000.4左右，离心收集菌体，以10％甘油洗2遍后，重悬于200μl10％甘油，加入10μl上述获得的aroe基因敲除片段aroe::cm，混合均匀后置于1mm电转杯中，2.5kv电压下进行电击转化。电击后迅速加入1ml无菌lb液体培养基，37℃，220rpm复苏1h后，菌体涂布于lb固体平板(含氯霉素25μg/ml)。
长出的转化子以引物对aroe_up_s、cm_up_a进行菌落pcr鉴定。引物序列如下：
aroe_up_s：5′-aacggaagccgttttcggtg-3′；
cm_up_a：5′-ttatacgcaaggcgacaagg-3′。
能够扩增出约500bp大小条带的菌落表明成功以氯霉素抗性基因替换aroe基因，将其接种至lb培养基中，制备化转感受态，并转化质粒pcp20，涂布lb平板(含氨苄霉素100μg/ml)，30℃培养至长出单菌落。挑取长出的单菌落划线于无抗lb平板，43℃培养过夜。长出的单菌落分别接种至无抗lb平板、氨苄平板及氯霉素平板，以验证抗性基因及pcp20、pkd46质粒是否去除。在无抗平板能够生长，在氨苄平板和氯霉素平板不能生长的菌株，再以引物对aroe_up_s、aroe_dw_a进行pcr鉴定。引物序列如下：
aroe_up_s：5′-aacggaagccgttttcggtg-3′
aroe_dw_a：5′-tccacggctgcaccattggc-3′
鉴定正确(pcr产物大小约为1000bp)的菌落成功敲除了aroe基因，命名为wyv5。
实施例2：可能的香兰素降解基因簇yqhc-yqhd-dkga的敲除
利用pcrtargeting技术，对实施例1获得的菌株敲除可能的香兰素降解基因簇yqhc-yqhd-dkga，获得的菌株命名为wyv18。具体操作如下：
以bl21(de3)菌株基因组为模板，分别利用引物对yqhc-dkga_up_s、yqhc-dkga_up_a和yqhc-dkga_dw_s、yqhc-dkga_dw_a扩增yqhc-yqhd-dkga基因簇上下游同源臂，同时以pkd3为模板，以引物对yqhc-dkga-cm_s、yqhc-dkga-cm_a扩增氯霉素抗性基因片段，将三个片段通过重叠pcr扩增获得yqhc-yqhd-dkga基因簇敲除片段yqhc-yqhd-dkga::cm。引物序列如下：
yqhc-dkga_up_s：5′-ttttctgcctacgattgc-3′；
yqhc-dkga_up_a：5′-ggaaaatcgtcaggcgttac-3′；
yqhc-dkga-cm_s：5′-gtaacgcctgacgattttccccgttcccggttgctgtaccgggaacgtatgtgtaggctggagctgcttc-3′；
yqhc-dkga-cm_a：5′-tctgaaaagtccggtagcggaacattaccgccaccgggagaatttgcatgcatatgaatatcctccttag-3′；
yqhc-dkga_dw_s：5′-catgcaaattctcccggtgg-3′；
yqhc-dkga_dw_a：5′-tcagtgtctgcgtggtct-3′。
将pkd46质粒转化至实施例1得到的大肠杆菌wyv5，挑取单克隆接种至lb液体培养基(含氨苄霉素100μg/ml)，30℃，220rpm过夜培养后，以1％转接量转接至50mllb液体培养基(含氨苄霉素100μg/ml，l-阿拉伯糖10mm)，30℃，220rpm培养至a6000.4左右，离心收集菌体，以10％甘油洗2遍后，重悬于200μl10％甘油，加入10μl上述获得的yqhc-yqhd-dkga基因簇敲除片段yqhc-yqhd-dkga::cm，混合均匀后置于1mm电转杯中，2.5kv电压下进行电击转化。电击后迅速加入1ml无菌lb液体培养基，37℃，220rpm复苏1h后，菌体涂布于lb固体平板(含氯霉素25μg/ml)。长出的转化子以引物对yqhc-dkga_up_s、cm_up_a进行菌落pcr鉴定，引物序列如下：
yqhc-dkga_up_s：5′-ttttctgcctacgattgc-3′；
cm_up_a：5′-ttatacgcaaggcgacaagg-3′。
能够扩增出约500bp大小条带的菌落表明成功以氯霉素抗性基因替换yqhc-yqhd-dkga基因簇，将其接种至lb培养基中，制备化转感受态，并转化质粒pcp20，涂布lb平板(含氨苄霉素100μg/ml)，30℃培养至长出单菌落。挑取长出的单菌落划线于无抗lb平板，43℃培养过夜。长出的单菌落分别接种至无抗lb平板、氨苄平板及氯霉素平板，以验证抗性基因及pcp20、pkd46质粒是否去除。在无抗平板能够生长，在氨苄平板和氯霉素平板不能生长的菌株，再以引物对yqhc-dkga_up_s、yqhc-dkga_dw_a进行pcr鉴定，引物序列如下：
yqhc-dkga_up_s：5′-ttttctgcctacgattgc-3′；
yqhc-dkga_dw_a：5′-tcagtgtctgcgtggtct-3′。
鉴定正确(pcr产物大小约为1000bp)的菌落成功敲除了yqhc-yqhd-dkga基因簇，命名为wyv18。
实施例3：可能的香兰素降解基因yahk的敲除
利用pcrtargeting技术，对实施例2获得的菌株wyv18敲除可能的香兰素降解基因yahk，获得的菌株命名为wyv39。具体操作如下：
以bl21(de3)菌株基因组为模板，分别利用引物对yahk_up_s、yahk_up_a和yahk_dw_s、yahk_dw_a扩增yahk基因上下游同源臂，同时以pkd3为模板，以引物对yahk-cm_s、yahk-cm_a扩增氯霉素抗性基因片段，将三个片段通过重叠pcr扩增获得yahk基因敲除片段yahk::cm，引物序列如下：
yahk_up_s：5′-agatgaactggcgaaccgga-3′；
yahk_up_a：5′-gaacttcgaagcagctccagcctacaccattgtgtttactcctgattagc-3′；
yahk-cm_s：5′-gctaatcaggagtaaacacaatggtgtaggctggagctgcttcgaagttc-3′；
yahk-cm_a：5′-tgttaaaccacagggtatttattaattttttcacatatgaatatcctccttagttccta-3′；
yahk_dw_s：5′-taggaactaaggaggatattcatatgtgaaaaaattaataaataccctgtggtttaaca-3′；
yahk_dw_a：5′-atccatgcgcaagcgcctgc-3′；
将pkd46质粒转化至实施例2获得的菌株wyv18，挑取单克隆接种至lb液体培养基(含氨苄霉素100μg/ml)，30℃，220rpm过夜培养后，以1％转接量转接至50mllb液体培养基(含氨苄霉素100μg/ml，l-阿拉伯糖10mm)，30℃，220rpm培养至a6000.4左右，离心收集菌体，以10％甘油洗2遍后，重悬于200μl10％甘油，加入10μl上述获得的yahk基因敲除片段yahk::cm，混合均匀后置于1mm电转杯中，2.5kv电压下进行电击转化。电击后迅速加入1ml无菌lb液体培养基，37℃，220rpm复苏1h后，菌体涂布于lb固体平板(含氯霉素25μg/ml)。长出的转化子以引物对yahk_up_s、cm_up_a进行菌落pcr鉴定，引物序列如下：
yahk_up_s：5′-agatgaactggcgaaccgga-3′；
cm_up_a：5′-ttatacgcaaggcgacaagg-3′。
能够扩增出约500bp大小条带的菌落表明成功以氯霉素抗性基因替换yahk基因的菌落，将其接种至lb培养基中，制备化转感受态，并转化质粒pcp20，涂布lb平板(含氨苄霉素100μg/ml)，30℃培养至长出单菌落。挑取长出的单菌落划线于无抗lb平板，43℃培养过夜。长出的单菌落分别接种至无抗lb平板、氨苄平板及氯霉素平板，以验证抗性基因及pcp20、pkd46质粒是否去除。在无抗平板能够生长，在氨苄平板和氯霉素平板不能生长的菌株，再以引物对yahk_up_s、yahk_dw_a进行pcr鉴定，引物序列如下：
yahk_up_s：5′-agatgaactggcgaaccgga-3′；
yahk_dw_a：5′-atccatgcgcaagcgcctgc-3′。
鉴定正确(pcr产物大小约为1000bp)的菌落成功敲除了yahk基因，命名为wyv39。
实施例4：可能的香兰素降解基因yjgb的敲除
利用pcrtargeting技术，对实施例3获得的菌株wyv39敲除可能的香兰素降解基因yjgb，获得的菌株命名为wyv55。具体操作如下：
以bl21(de3)菌株基因组为模板，分别利用引物对yjgb_up_s、yjgb_up_a和yjgb_dw_s、yjgb_dw_a扩增yjgb基因上下游同源臂，同时以pkd3为模板，以引物对yjgb-cm_s、yjgb-cm_a扩增氯霉素抗性基因片段，将三个片段通过重叠pcr扩增获得yjgb基因敲除片段yjgb::cm，引物序列如下：
yjgb_up_s：5′-actggaccgaataaagatc-3′；
yjgb_up_a：5′-tgtttgggaagtgtagagc-3′；
yjgb-cm_s：5′-ctgccatgctctacacttcccaaacaacaccagagaaggaccaaaaaatggtgtaggctggagctgcttc-3′；
yjgb-cm_a：5′-tatgtgcgaaagagggcagcgcctcagatcagcgctgcgaatgattttcacatatgaatatcctccttag-3′；
yjgb_dw_s：5′-tgaaaatcattcgcagcgct-3′；
yjgb_dw_a：5′-ttctgatgagtcgctatga-3′。
将pkd46质粒转化至实施例3获得的菌株wyv39，挑取单克隆接种至lb液体培养基(含氨苄霉素100μg/ml)，30℃，220rpm过夜培养后，以1％转接量转接至50mllb液体培养基(含氨苄霉素100μg/ml，l-阿拉伯糖10mm)，30℃，220rpm培养至a6000.4左右，离心收集菌体，以10％甘油洗2遍后，重悬于200μl10％甘油，加入10μl上述获得的yjgb基因敲除片段yjgb::cm，混合均匀后置于1mm电转杯中，2.5kv电压下进行电击转化。电击后迅速加入1ml无菌lb液体培养基，37℃，220rpm复苏1h后，菌体涂布于lb固体平板(含氯霉素25μg/ml)。长出的转化子以引物对yjgb_up_s、cm_up_a进行菌落pcr鉴定，引物序列如下：
yjgb_up_s：5′-actggaccgaataaagatc-3′；
cm_up_a：5′-ttatacgcaaggcgacaagg-3′。
能够扩增出约500bp大小条带的菌落表明成功以氯霉素抗性基因替换yjgb基因的菌落，将其接种至lb培养基中，制备化转感受态，并转化质粒pcp20，涂布lb平板(含氨苄霉素100μg/ml)，30℃培养至长出单菌落。挑取长出的单菌落划线于无抗lb平板，43℃培养过夜。长出的单菌落分别接种至无抗lb平板、氨苄平板及氯霉素平板，以验证抗性基因及pcp20、pkd46质粒是否去除。在无抗平板能够生长，在氨苄平板和氯霉素平板不能生长的菌株，再以引物对yjgb_up_s、yjgb_dw_a进行pcr鉴定，引物序列如下：
yjgb_up_s：5′-actggaccgaataaagatc-3′；
yjgb_dw_a：5′-ttctgatgagtcgctatga-3′。
鉴定正确(pcr产物大小约为1000bp)的菌落成功敲除了yjgb基因，命名为wyv55。
实施例5：测试基因敲除菌株香兰素降解情况
分别将实施例1-4中获得的不同基因敲除菌株，与对照菌株bl21(de3)接种至lb培养基，37℃培养至a600～1.0左右后，加入终浓度0.5g/l香兰素，37℃继续培养，24h取培养液，通过hplc检测培养液中香兰素、香草酸、香草醇浓度。根据测定的浓度计算香兰素、香草酸、香草醇的相对百分百含量，见附图1。结果显示，组合敲除了aroe、yqhc、yqhd、dkga、yahk和yjgb等基因的工程菌中wyv55香兰素降解程度最低。
实施例6：重组质粒prsfduet-aroz-comt的构建
1.扩增或合成3-脱氢莽草酸脱水酶基因(aroz)片段
利用pcr技术，以蜡状芽孢杆菌(bacilluscereusatcc10876)基因组为模板，以引物对aroz_s(5′-cgcggatccgatgaaatattcgctatgtac-3′)、aroz_a(5′-cccaagcttttacgaagttactacttc-3′)，扩增得到片段为3-脱氢莽草酸脱水酶基因bc-aroz，基因序列如seqidno:1所示。
将得到的pcr产物用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收，获得3-脱氢莽草酸脱水酶编码基因片段bc-aroz。
根据大肠杆菌的密码子偏好性将苏云金杆菌(bacillusthuringiensisybt-1518)中编码3-脱氢莽草酸脱水酶的基因进行密码子优化，进行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上bamhi酶切位点，下游加上hindiii酶切位点，获得片段bt-aroz(基因序列如seqidno:2所示)。
2.重组质粒prsfduet-aroz的构建
利用内切酶分别对步骤1中得到的3-脱氢莽草酸脱水酶编码基因片段bc-aroz或bt-aroz和prsfduet-1质粒进行双酶切；双酶切使用的内切酶为bamhi和hindiii(thermoscientific)；酶切产物以dna琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收。
将双酶切后的aroz基因片段和prsfduet-1质粒片段用t4dna连接酶(takara)进行连接，22℃连接2h，构建重组质粒prsfduet-aroz。
3.合成o-甲基转移酶基因(sl-comt)片段
根据大肠杆菌的密码子偏好性将番茄solanumlycopersicum中命名为comt的o-甲基转移酶基因进行密码子优化，进行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上ndei酶切位点，下游加上xhoi酶切位点，获得片段sl-comt(基因序列如seqidno:3所示)。
根据大肠杆菌的密码子偏好性将人homosapiens中命名为comt的o-甲基转移酶的可溶部分编码基因进行密码子优化，进行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上ndei酶切位点，下游加上xhoi酶切位点，获得片段hs-comt(基因序列如seqidno:4所示)。
根据大肠杆菌的密码子偏好性将中国对虾fenneropenaeuschinensis中命名为comt的o-甲基转移酶基因进行密码子优化，进行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上ndei酶切位点，下游加上xhoi酶切位点，获得片段fc-comt(基因序列如seqidno:5所示)。
根据大肠杆菌的密码子偏好性将黄色黏球菌myxococcusxanthus中命名为comt的o-甲基转移酶基因进行密码子优化，进行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上ndei酶切位点，下游加上xhoi酶切位点，获得片段mx-comt(基因序列如seqidno:6所示)。
根据大肠杆菌的密码子偏好性将甜椒capsicumannuum中命名为comt的o-甲基转移酶的可溶部分编码基因进行密码子优化，进行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上ndei酶切位点，下游加上xhoi酶切位点，获得片段ca-comt(基因序列如seqidno:7所示)。
根据大肠杆菌的密码子偏好性将罗勒ocimumbasilicum中命名为comt的o-甲基转移酶的可溶部分编码基因进行密码子优化，进行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上ndei酶切位点，下游加上xhoi酶切位点，获得片段ob-comt(基因序列如seqidno:8所示)。
4.重组质粒prsfduet-aroz-comt的构建
利用内切酶分别对步骤2中得到的prsfduet-aroz质粒和步骤3中合成的sl-comt、hs-comt、fc-comt、mx-comt、ca-comt或ob-comt片段进行双酶切；双酶切使用的内切酶为ndei和xhoi(thermoscientific)；酶切产物以dna琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收。双酶切后的基因片段和质粒片段用t4dna连接酶(takara)进行连接，22℃连接2h，构建重组质粒prsfduet-aroz-comt。
实施例7：重组质粒petduet-car的构建
利用pcr技术，以艾阿华诺卡氏菌(nocardiaiowensisdsm45197)基因组为模板，以引物对car_s(5′-cgcggatccgatggcagtggattcaccgga-3′)、car_a(5′-cccaagctttcagagcagctgaagcagtt-3′)扩增得到香草酸还原酶基因ni-car的片段，(基因序列如seqidno:9所示)；将得到的pcr产物用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收，获得ni-car片段。
根据大肠杆菌的密码子偏好性将粗糙脉胞菌neurosporacrassa中可能的香草酸还原酶编码基因nc-car进行密码子优化后，进行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)，并在基因上游加上bamhi酶切位点，下游加上hindiii酶切位点，获得片段nc-car(基因序列如seqidno:10所示)。利用内切酶分别对获得的的ni-car或nc-car基因片段和petduet-1质粒进行双酶切；双酶切使用的内切酶为bamhi和hindiii(thermoscientific)；酶切产物以dna琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收。
双酶切后的ni-car或nc-car基因片段和petduet-1质粒片段用t4dna连接酶(takara)进行连接，构建重组质粒petduet-car。
实施例8：重组质粒pacycduet-arob-aroffbr的构建
1.扩增3-脱氢奎尼酸合成酶基因(arob)片段
利用pcr技术，以大肠杆菌bl21(de3)基因组为模板，以引物对arob_s(5′-cgcggatccgatggagaggattgtcgttac-3′)、arob_a(5′-acgcgtcgacttacgctgattgacaatcg-3′)扩增得到3-脱氢奎尼酸合成酶基因arob，将得到的pcr产物用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收。
2.重组质粒pacycduet-arob的构建
利用内切酶bamhi和sali(thermoscientific)分别对回收的arob基因片段和pacycduet-1质粒进行双酶切；双酶切后的基因片段和pacycduet-1质粒片段用t4dna连接酶(takara)进行连接，构建重组质粒pacycduet-arob；
3.3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因(arof)片段的扩增和突变
利用pcr技术，以大肠杆菌bl21(de3)基因组为模板，以引物对arof_s(5′-cggggtaccatgcaaaaagacgcgctgaa-3′)、arof_a(5′-ccgctcgagttaagccacgcgagccgtca-3′)扩增得到3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因arof。将arof片段连接至ptg19-t载体(上海捷瑞生物工程有限公司)，构建质粒t-arof。利用pcr技术，以质粒t-arof为模板，以引物对arof_m_s(5′-ctgaatagcccgcaatacctgggcgatctg-3′)、arof_m_a(5′-caggtattgcgggctattcagatctaacgc-3′)扩增得到携带p148l定点突变的arof基因片段aroffbr的质粒，以dpni消化去除未突变模板后，转化大肠杆菌dh5α感受态，获得携带aroffbr基因片段的质粒t-aroffbr；
4.重组质粒pacycduet-arob-aroffbr的构建
利用内切酶kpni和xhoi(thermoscientific)分别对步骤3中得到的t-aroffbr质粒和步骤2中得到的重组质粒pacycduet-arob进行双酶切；双酶切后的aroffbr基因片段和pacycduet-arob质粒片段用t4dna连接酶(takara)进行连接，构建重组质粒pacycduet-arob-aroffbr。
实施例9：香兰素生产菌的构建
将实施例6得到的重组质粒prsfduet-aroz-comt5μl，实施例7得到的重组质粒petduet-car5μl，以及实施例8得到的重组质粒pacycduet-arob-aroffbr5μl通过化学转化法转化至实施例4得到的工程菌wyv55感受态，涂布于lb平板(含氨苄霉素100μg/ml、卡那霉素50μg/ml、氯霉素25μg/ml)，经过筛选和验证后获得用于生产香兰素的代谢工程大肠杆菌，其中产量最高的菌种cffsh003，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2016770。
实施例10：工程菌cffsh003以lb培养基发酵生产香兰素
(1)平板培养：将实施例9得到的代谢工程大肠杆菌cffsh003接种至含有氨苄霉素、卡那霉素和氯霉素的lb培养基固体平板上，37℃培养过夜；氨苄霉素的浓度为100μg/ml；卡那霉素的浓度为50μg/ml；氯霉素的浓度为25μg/ml；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株接种至含有氨苄霉素、卡那霉素和氯霉素的lb液体培养基中，37℃培养过夜；氨苄霉素的浓度为100μg/ml；卡那霉素的浓度为50μg/ml；氯霉素的浓度为25μg/ml；
(3)发酵培养：将步骤(2)中得到的种子液接种到含有氨苄霉素、卡那霉素、氯霉素和iptg的lb培养基中，25℃培养48小时，得到含香兰素的发酵液；氨苄霉素的浓度为100μg/ml；卡那霉素的浓度为50μg/ml；氯霉素的浓度为25μg/ml；iptg的浓度为0.2mm；
其中，上述步骤(1)～(3)中所述的lb培养基配方是：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l；固体培养基添加2％琼脂；
(4)hplc检测发酵液中香兰素的浓度：取发酵液1ml，12000rpm离心10min后取上清，经0.22μm过滤膜过滤至液相样品瓶。使用高效液相色谱仪(agilenttechnologies1290infinity)进行香兰素浓度的测定。采用agilenteclipseplusc18rrhd(2.1*50mm)色谱柱进行液相分离，流动相a为0.1％乙酸水溶液，流动相b为甲醇。流速为0.5ml/min，梯度洗脱程序为，0min90％a+10％b，1.3min90％a+10％b，1.7min，60％a+40％b，2.5min60％a+40％b，2.8min90％a+10％b，3.5min90％a+10％b。紫外检测器波长为280nm，柱温为30℃，香兰素出峰时间为2.3min。经测定，发酵液中香兰素最高产量为24.1mg/l。
实施例11：工程菌cffsh003以添加20g/l葡萄糖的lb培养基发酵生产香兰素
(1)平板培养：将实施例9得到的代谢工程大肠杆菌cffsh003接种至含有氨苄霉素、卡那霉素和氯霉素的lb培养基固体平板上，37℃培养过夜；氨苄霉素的浓度为100μg/ml；卡那霉素的浓度为50μg/ml；氯霉素的浓度为25μg/ml；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株接种至含有氨苄霉素、卡那霉素和氯霉素的lb液体培养基中，37℃培养过夜；氨苄霉素的浓度为100μg/ml；卡那霉素的浓度为50μg/ml；氯霉素的浓度为25μg/ml；
(3)发酵培养：将步骤(2)中得到的种子液接种到含有氨苄霉素、卡那霉素、氯霉素和iptg的发酵培养基中，25℃培养48小时，得到含香兰素的发酵液；氨苄霉素的浓度为100μg/ml；卡那霉素的浓度为50μg/ml；氯霉素的浓度为25μg/ml；iptg的浓度为0.2mm；
其中，上述步骤(1)～(2)中所述的lb培养基配方是：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l；固体培养基添加2％琼脂；
上述步骤(3)中所述的发酵培养基配方为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，葡萄糖20g/l。
(4)hplc检测发酵液中香兰素的浓度：取发酵液1ml，12000rpm离心10min后取上清，经0.22μm过滤膜过滤至液相样品瓶。使用高效液相色谱仪(agilenttechnologies1290infinity)进行香兰素浓度的测定。采用agilenteclipseplusc18rrhd(2.1*50mm)色谱柱进行液相分离，流动相a为0.1％乙酸水溶液，流动相b为甲醇。流速为0.5ml/min，梯度洗脱程序为，0min90％a+10％b，1.3min90％a+10％b，1.7min，60％a+40％b，2.5min60％a+40％b，2.8min90％a+10％b，3.5min90％a+10％b。紫外检测器波长为280nm，柱温为30℃，香兰素出峰时间为2.3min。经测定，发酵液中香兰素最高产量为88.5mg/l。
实施例12：工程菌cffsh003以添加20g/l甘油的lb培养基发酵生产香兰素
(1)平板培养：将实施例9得到的代谢工程大肠杆菌cffsh003接种至含有氨苄霉素、卡那霉素和氯霉素的lb培养基固体平板上，37℃培养过夜；氨苄霉素的浓度为100μg/ml；卡那霉素的浓度为50μg/ml；氯霉素的浓度为25μg/ml；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株接种至含有氨苄霉素、卡那霉素和氯霉素的lb液体培养基中，37℃培养过夜；氨苄霉素的浓度为100μg/ml；卡那霉素的浓度为50μg/ml；氯霉素的浓度为25μg/ml；
(3)发酵培养：将步骤(2)中得到的种子液接种到含有氨苄霉素、卡那霉素、氯霉素和iptg的发酵培养基中，25℃培养48小时，得到含香兰素的发酵液；氨苄霉素的浓度为100μg/ml；卡那霉素的浓度为50μg/ml；氯霉素的浓度为25μg/ml；iptg的浓度为0.2mm；
其中，上述步骤(1)～(2)中所述的lb培养基配方是：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l；固体培养基添加2％琼脂；
上述步骤(3)中所述的发酵培养基配方为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，甘油20g/l。
(4)hplc检测发酵液中香兰素的浓度：取发酵液1ml，12000rpm离心10min后取上清，经0.22μm过滤膜过滤至液相样品瓶。使用高效液相色谱仪(agilenttechnologies1290infinity)进行香兰素浓度的测定。采用agilenteclipseplusc18rrhd(2.1*50mm)色谱柱进行液相分离，流动相a为0.1％乙酸水溶液，流动相b为甲醇。流速为0.5ml/min，梯度洗脱程序为，0min90％a+10％b，1.3min90％a+10％b，1.7min，60％a+40％b，2.5min60％a+40％b，2.8min90％a+10％b，3.5min90％a+10％b。紫外检测器波长为280nm，柱温为30℃，香兰素出峰时间为2.3min。经测定，发酵液中香兰素最高产量为61.7mg/l。
实施例13：工程菌cffsh003以葡萄糖为碳源发酵生产香兰素
(1)平板培养：将实施例9得到的代谢工程大肠杆菌cffsh003接种至含有氨苄霉素、卡那霉素和氯霉素的lb培养基固体平板上，37℃培养过夜；氨苄霉素的浓度为100μg/ml；卡那霉素的浓度为50μg/ml；氯霉素的浓度为25μg/ml；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株接种至含有氨苄霉素、卡那霉素和氯霉素的lb液体培养基中，37℃培养过夜；氨苄霉素的浓度为100μg/ml；卡那霉素的浓度为50μg/ml；氯霉素的浓度为25μg/ml；
(3)发酵培养：将步骤(2)中得到的种子液接种到含有氨苄霉素、卡那霉素、氯霉素和iptg的lb培养基中，25℃培养48小时，得到含香兰素的发酵液；氨苄霉素的浓度为100μg/ml；卡那霉素的浓度为50μg/ml；氯霉素的浓度为25μg/ml；iptg的浓度为0.2mm；
其中，上述步骤(1)～(2)中所述的lb培养基配方是：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l；固体培养基是在lb培养基配方中添加2％琼脂；
上述步骤(3)中所述的发酵培养基配方为：kh2po47.5g/l，(nh4)2so42.96g/l，mgso40.24g/l，柠檬酸铵0.3g/l，一水合柠檬酸2.1g/l，苯丙氨酸0.7g/l，酪氨酸0.7g/l，色氨酸0.7g/l，对氨基苯甲酸0.01g/l，2,3-二羟基苯甲酸0.01g/l，对羟基苯甲酸0.01g/l，(nh4)6(mo7o24)·4h2o0.0037g/l，znso4·7h2o0.0029g/l，h3bo30.0247g/l，cuso4·5h2o0.0025g/l，mncl2·4h2o0.0158g/l，葡萄糖20g/l。
(4)hplc检测发酵液中香兰素的浓度：取发酵液1ml，12000rpm离心10min后取上清，经0.22μm过滤膜过滤至液相样品瓶。使用高效液相色谱仪(agilenttechnologies1290infinity)进行香兰素浓度的测定。采用agilenteclipseplusc18rrhd(2.1*50mm)色谱柱进行液相分离，流动相a为0.1％乙酸水溶液，流动相b为甲醇。流速为0.5ml/min，梯度洗脱程序为，0min90％a+10％b，1.3min90％a+10％b，1.7min，60％a+40％b，2.5min60％a+40％b，2.8min90％a+10％b，3.5min90％a+10％b。紫外检测器波长为280nm，柱温为30℃，香兰素出峰时间为2.3min。经测定，发酵液中香兰素最高产量为85.8mg/l。
实施例14：工程菌cffsh003以甘油为碳源发酵生产香兰素
(1)平板培养：将实施例9得到的代谢工程大肠杆菌cffsh003接种至含有氨苄霉素、卡那霉素和氯霉素的lb培养基固体平板上，37℃培养过夜；氨苄霉素的浓度为100μg/ml；卡那霉素的浓度为50μg/ml；氯霉素的浓度为25μg/ml；
(2)种子培养：将步骤(1)培养的菌株接种至含有氨苄霉素、卡那霉素和氯霉素的lb液体培养基中，37℃培养过夜；氨苄霉素的浓度为100μg/ml；卡那霉素的浓度为50μg/ml；氯霉素的浓度为25μg/ml；
(3)发酵培养：将步骤(2)中得到的种子液接种到含有氨苄霉素、卡那霉素、氯霉素和iptg的发酵培养基中，25℃培养48小时，得到含香兰素的发酵液；氨苄霉素的浓度为100μg/ml；卡那霉素的浓度为50μg/ml；氯霉素的浓度为25μg/ml；iptg的浓度为0.2mm；
其中，上述步骤(1)～(2)中所述的lb培养基配方是：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l；固体培养基添加2％琼脂；
上述步骤(3)中所述的发酵培养基配方为：kh2po47.5g/l，(nh4)2so42.96g/l，mgso40.24g/l，柠檬酸铵0.3g/l，一水合柠檬酸2.1g/l，苯丙氨酸0.7g/l，酪氨酸0.7g/l，色氨酸0.7g/l，对氨基苯甲酸0.01g/l，2,3-二羟基苯甲酸0.01g/l，对羟基苯甲酸0.01g/l，(nh4)6(mo7o24)·4h2o0.0037g/l，znso4·7h2o0.0029g/l，h3bo30.0247g/l，cuso4·5h2o0.0025g/l，mncl2·4h2o0.0158g/l，甘油20g/l。
(4)hplc检测发酵液中香兰素的浓度：取发酵液1ml，12000rpm离心10min后取上清，经0.22μm过滤膜过滤至液相样品瓶。使用高效液相色谱仪(agilenttechnologies1290infinity)进行香兰素浓度的测定。采用agilenteclipseplusc18rrhd(2.1*50mm)色谱柱进行液相分离，流动相a为0.1％乙酸水溶液，流动相b为甲醇。流速为0.5ml/min，梯度洗脱程序为，0min90％a+10％b，1.3min90％a+10％b，1.7min，60％a+40％b，2.5min60％a+40％b，2.8min90％a+10％b，3.5min90％a+10％b。紫外检测器波长为280nm，柱温为30℃，香兰素出峰时间为2.3min。经测定，发酵液中香兰素最高产量为51.2mg/l。
sequencelisting
<110>波顿（上海）生物技术有限公司
<120>一种基因工程菌及其构建方法与生产香兰素的方法
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