一株产L‑酒石酸的基因工程菌及其构建方法与应用与流程

文档序号：12108537阅读：459来源：国知局

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株利用葡萄糖或木糖发酵产L-酒石酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

L-酒石酸广泛存在于自然界的多种植物果实中，其中成熟葡萄中L-酒石酸含量较多，其是一种用途非常广泛的天然有机酸，主要作为食品添加剂和医药拆分剂应用于食品、医药和化学工业等领域，据报道，L-酒石酸还可用于纳米材料的制备及作为燃料经济性改性剂和抗磨剂。据不完全统计，2000年L-酒石酸市场全世界年消费约2万吨，主要应用在食品行业。

目前，L-酒石酸的生产主要有4种方法，包括提取法、化学拆分法、酶法和发酵-催化法，目前提取法受原料限制产量有限，化学拆分法由于溶剂的大量使用，已基本淘汰。酶法是目前L-酒石酸最主要的生产方法，生产效率高，但该方法依赖化石原料顺式环氧琥珀酸，因此面临着依赖化石资源的问题。发酵-催化法很好地解决了原料的问题，以葡萄糖等糖质为原料，但其生产过程需先采用发酵的方式将葡萄糖发酵转化为5-酮基-D-葡萄糖酸，进一步采用金属催化剂催化合成L-酒石酸，导致该方法总体催化效率仍然偏低，有待技术突破。且采用两步催化的方式增加了放大生产过程的操作性难度，且生产成本大幅提高。

若能通过对菌株的代谢工程改造，使其能够以葡萄糖等糖质为原料通过一步发酵法生产L-酒石酸，不仅解决了原料的问题，且其相对简单的操作方式将有效提高其生产效率并降低成本，更具生产的可能性。

本发明以野生型大肠杆菌为出发菌株，重构了菌株的代谢网络，抑制碳流流向乳酸、甲酸等副产物，同时强化流向L-酒石酸的代谢流，并阻断L-酒石酸的分解代谢途径，通过系列基因操作，构建获得了能够一步发酵制备L-酒石酸的基因工程菌，该创新性工作未见任何报道，具有显著的创新性。

技术实现要素：

本发明的目的在于，克服现有技术的缺陷，提供提供一株利用单糖发酵产L-酒石酸的基因工程菌。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株利用单糖发酵产L-酒石酸的基因工程菌，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CM-MA-184，已于2016年9月5日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016455。

本发明的另一目的在于提供上述基因工程菌CM-MA-184的构建方法。

所述基因工程菌CM-MA-184的构建方法包括如下步骤：

(1)以野生型大肠埃希氏菌(Escherichia coli)K12为出发菌株，采用RED重组技术无痕敲除大肠埃希氏菌K12中的三段基因，分别为丙酮酸分解途径中的关键基因丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl(EcoGene登记号为EG10701)、乳酸脱氢酶基因ldh(EcoGene登记号为EG13186)以及草酰乙酸下游分解途径关键基因苹果酸脱氢酶编码基因mdh(EcoGene登记号为EG10576)。

(2)高活力单质粒共表达催化磷酸烯醇式丙酮酸至草酰乙酸的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(编码基因为pck)和催化草酰乙酸至L-酒石酸脱水酶(编码基因为ttd1、ttd2)；具体为，将前述三段基因合成一段目的基因序列pck-ttd1-ttd2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，将目的基因序列导入单质粒，获取重组质粒，将重组质粒导入步骤(1)中敲除了三段基因的K12菌株感受态，获取的阳性转化子即为本发明的基因工程菌。其中，pck核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，ttd1核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，ttd2核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

其中，所述的表达质粒为pTrc99a质粒。

本发明的又一目的在于上述基因工程菌在产L-酒石酸的应用。尤其是在电化学反应器中利用单糖发酵制备L-酒石酸的应用。

本发明中提供了一种具体在电化学反应器中利用单糖发酵制备L-酒石酸的应用方法，电化学反应器阳极装发酵培养基，其配方为烟酸0.1mM；柠檬酸3.0g/L；Na₂HPO₄·7H₂O 3.00g/L；KH₂PO₄8.00g/L；(NH₄)₂HPO₄20.00g/L；NH₄Cl 10g/L；(NH₄)₂SO₄5g/L；MgSO₄·7H₂O 1.00g/L；CaCl₂·2H₂O 10.0mg/L；ZnSO₄·7H₂O 0.5mg/L；CuCl₂·2H₂O 0.25mg/L；MnSO₄·H₂O 2.5mg/L；CoCl₂·6H₂O 1.75mg/L；H₃BO₃0.12mg/L；Al₂(SO₄)₃·xH₂O 1.77mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O 0.5mg/L；Fe(III)citrate 16.1mg/L，中性红0.1mM，溶剂为水，灭菌后用氨水调节pH为7.0，其中60g/L葡萄糖单独灭菌后加入；

阴极配方为：100mM，pH＝6.8的磷酸盐缓冲液，NaCl 6g/L。

其中，种子液培养过程如下：

(S1)将冻存管中保存的菌液按体积分数为1～2％从冻存管转接到LB培养基中，有氧培养10～12h；

(S2)将经S1处理后的培养液按体积分数为1～2％转接到种子发酵罐的LB培养基中；

(S3)待菌体OD₆₀₀至2.5～4时，将培养液按体积比5～10％接种至电化学反应器的阳极。

其中，种子液培养过程中，步骤(S1)和(S2)中，培养温度为35～37℃。

其中，步骤(S3)中采用厌氧发酵模式，过程中需通二氧化碳气体维持厌氧环境。

其中，阳极的厌氧发酵过程维持温度在30～32℃，培养过程pH用氨水调节为6.8～7.0。

有益效果：

本发明构建的基因工程菌能够实现一步发酵制备L-酒石酸，创新性地建立了L-酒石酸一步发酵的生产方法，彻底摆脱了依赖于石油基原料的问题，实现了完全采用可再生生物质资源(如葡萄糖、木糖等)为原料发酵制备L-酒石酸的路线，该路线绿色、环保。

附图说明

图1是敲除了pfl基因的E.coli K12(Δpfl)突变体的菌落PCR验证图；

图2是敲除了pfl基因和ldh基因的E.coli K12(Δpfl,Δldh)突变体的菌落PCR验证图；

图3是敲除了pfl基因、ldh基因和mdh基因的E.coli K12(Δpfl,Δldh,Δmdh)突变体的菌落PCR验证图；

图4是基于表达载体pTrc99a的重组质粒的构建过程示意图。

本发明所述生物材料，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CM-MA-184，已于2016年9月5日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016455，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例中所用出发菌株Escherichia coli K12购自ATCC(NO.53678)；所用pIJ773质粒和pKD46质粒由英国约翰恩尼斯中心(John Innes Centre,Norwich Research Park,Colney,Norwich NR47UH,UK)提供；所用pTrc99a质粒购自Addgene公司。

实施例1

本实施例说明利用RED重组技术敲除pfl，ldh和mdh三基因后，重组菌与出发菌株Escherichia coli K12在菌落PCR鉴定时，电泳图谱的区别，说明三基因的敲除成功，其大致过程如下：

(1)以pIJ773质粒为模板，pKD46为重组酶诱导表达质粒，采用RED重组技术，无痕敲除pfl，ldh和mdh三基因，pfl，ldh和mdh三基因的敲除顺序不影响技术效果；

基因敲除步骤及过程参考“Gust B,Kieser T,Chater K(2002)PCR targeting system in Streptomyces coelicolor A3(2).The John Innes Foundation,Norwich”。

(2)采用Escherichia coli K12为对照菌株，分别采用三对引物对基因敲除过程中的阳性菌进行菌落PCR鉴定，验证pfl，ldh和mdh三基因时采用的引物序列如下：

(I)验证pfl基因：上游引物5’-GAGGATGCGGAAAAAATTCAACTC-3’，

下游引物5’-TAGTAGTGCAAATGTCCTAATACGG-3’；

PCR体系(20uL体系)：H₂O 13.3uL，Buffer 2uL，dNTP 1.6uL，MgCl₂1.6uL，上下游引物各0.5uL，Ex-Taq 0.5uL，牙签点取单菌落；

PCR条件：95℃，10分钟；(94，45秒，54，45秒，72，100秒，30次循环)；72，10分钟。

(II)验证ldh基因：上游引物5’-CTTAAATGTGATTCAACATCACTG-3’，

下游引物5’-CGTAACAGCAATTTTGTCATTAC-3’；

PCR体系(20uL体系)：H₂O 13.3uL，Buffer 2uL，dNTP 1.6uL，MgCl₂1.6uL，上下游引物各0.5uL，Ex-Taq 0.5uL，牙签点取单菌落；

PCR条件：95℃，10分钟；(94，45秒，52，45秒，72，100秒，30次循环)；72，10分钟。

(III)验证mdh基因：上游引物5’-CTTGCGTGACTACACATTCTTGAG-3’，

下游引物5’-AAGGGATCGTGGTTAATGAAGTGT-3’；

PCR体系(20uL体系)：H₂O 13.3uL，Buffer 2uL，dNTP 1.6uL，MgCl₂1.6uL，上下游引物各0.5uL，Ex-Taq 0.5uL，牙签点取单菌落；

PCR条件：95℃，10分钟；(94，45秒，55，45秒，72，100秒，30次循环)；72，10分钟。

菌落PCR的电泳鉴定图依次如图1，图2，图3所示，图1E.coli K12(Δpfl)突变体的菌落PCR验证，图2E.coli(Δpfl,Δldh)突变体的菌落PCR验证，图3E.coli(Δpfl,Δldh,Δmdh)突变体的菌落PCR验证。

实施例2

本实施例说明构建具有高活性磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和L-酒石酸脱水酶重组菌株的过程，其大致过程如图4，包括：

(1)采用化学合成的方式人工合成一段如SEQ ID NO：1所示的序列，合成的序列上下游分别带有EcoR I和Xba I酶切位点，并依次含有来源于枯草芽孢杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因(pck基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)和来源于大肠杆菌的L-酒石酸脱水酶基因的序列(ttd1、ttd2基因，ttd1、ttd2基因分别为L-酒石酸脱水酶基因的两个亚基，敲除了两个亚基中原有的一段序列后获取ttd1、ttd2基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示)。序列的化学合成由金斯瑞公司完成。

(2)合成的基因序列和表达质粒pTrc99a分别用EcoR I和Xba I双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pck-ttd1-ttd2。

2、将质粒pTrc99a-pck-ttd1-ttd2导入实施例1中E.coli(Δpfl,Δldh,Δmdh)感受态，获得的阳性转化子即为本发明的新构建菌株。

其中，感受态的构建方法、具体导入步骤、阳性转化子获取步骤包括：

(a)接种E.coli(Δpfl,Δldh,Δmdh)单菌落于5mL LB培养液，37℃，200r/min培养8h或过夜。

(b)将2.5mL培养液加到装有500mL LB培养液的2L三角瓶中，37℃，200r/min培养，每隔20min测量一次OD₆₀₀值。

(c)当OD₆₀₀为0.3～0.4时，迅速将细菌培养液放在冰水浴中冷却10～15min，然后转移到预冷的1L离心瓶中，于4℃，5,000r/min离心20min，沉淀用5mL预冷的水溶解。

(d)加入500mL冰冷的水，重悬并混匀，按步骤(c)重复离心1次，立即将上清倒掉，用残余的液体重新悬浮细胞。

(e)取50μL感受态细胞，质粒pTrc99a-pck-ttd1-ttd2约50～100ng，电击条件：200Ω，25μF，电击电压1.25kV，电击时间4～5ms，电击后迅速加入预冷的1mL SOC，37℃，200r/min培养1h，之后涂于带氨苄青霉素抗性的平板筛选阳性转化子。

3、用甘油保存的方式保存阳性转化子，其过程包括：

(a)用牙签取能在氨苄青霉素抗性的平板上生长的阳性转化子单菌落，5mL LB培养液，37℃，200r/min培养8h或过夜。

(b)将2.5mL培养液加到装有500mL LB培养液的2L三角瓶中，37℃，200r/min培养，每隔20min测量一次OD₆₀₀值。

(c)当OD₆₀₀为0.8～1.2时，与500mL甘油含量为30％的无菌水混合，1.5mL分装后于-80℃冻存管保存。

实施例3

本实施例说明新构建的重组大肠杆菌在电化学反应器中发酵制备L-酒石酸的应用，发酵过程包括：

(S1)取实施例2中保存的冻存管，按体积分数为1～2％从冻存管取菌液转接到LB培养基中，有氧培养10～12h；

(S2)将S1获取的培养液按体积分数为1～2％转接到种子发酵罐的LB培养基中；

(S3)待菌体OD₆₀₀至2.5～4时，将培养液按体积比5～10％接种至电化学反应器的阳极，阳极装发酵培养基，所述发酵培养基的配方为：烟酸0.1mM；柠檬酸3.0g/L；Na₂HPO₄·7H₂O 3.00g/L；KH₂PO₄ 8.00g/L；(NH₄)₂HPO₄ 20.00g/L；NH₄Cl 10g/L；(NH₄)₂SO₄ 5g/L；MgSO₄·7H₂O 1.00g/L；CaCl₂·2H₂O 10.0mg/L；ZnSO₄·7H₂O 0.5mg/L；CuCl₂·2H₂O 0.25mg/L；MnSO₄·H₂O 2.5mg/L；CoCl₂·6H₂O 1.75mg/L；H₃BO₃ 0.12mg/L；Al₂(SO₄)₃·xH₂O 1.77mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O 0.5mg/L；Fe(III)citrate 16.1mg/L；中性红0.1mM，溶剂为水，灭菌后用氨水调节pH为7.0，其中60g/L葡萄糖单独灭菌后加入。

其中，种子液培养过程中，步骤(S1)和(S2)中，培养温度为35～37℃。步骤(S3)中采用厌氧发酵模式，过程中需通二氧化碳气体维持厌氧环境。阳极的厌氧发酵过程维持温度在30～32℃，培养过程pH用氨水调节为6.8～7.0。电化学反应装置阴极的配方为：磷酸盐缓冲液(100mM，pH 6.8)，NaCl 6g/L。

重组菌株CM-MA-184在普通发酵罐和电化学反应器中厌氧发酵48h后的结果见表1。

表1重组菌株不同发酵条件下发酵产酸情况

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一株产L-酒石酸的基因工程菌及其构建方法与应用

<130> xb16121201

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3968

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1

<400> 1

ttgacgtttt gttgcctatt gtccgaatgt taagtgttaa tggtgggaaa tctgggaaag 60

ttgccccctg gaatgtgtga taattgccca aatctgaacc caatggccat ggacggggaa 120

tgaactgtcg ggggacggtt gaggttaatt cttgaaacca cccccaaaat aggctattaa 180

aacgggtgct ctcatattaa agaaagtgtg tagatgcgtg tgggcagggg gtaggtccac 240

tggtaatgac aaatgtgtcc gttgtctcac ctaaagtttt aactagttct gtatctgaaa 300

gctacgctag ggggcgagaa ctctgtcgaa tgacacaaaa tctggagaag taatgactac 360

tgctgcaatc aggggccttc agggtgaggc gccgaccaag aataaggaac tgctgaactg 420

gatcgcagac gccgtcgagc tcttccagcc tgaggctgtt gtgttcgttg atggatccca 480

ggctgagtgg gatcgcatgg cggaggatct tgttgaagcc ggtaccctca tcaagctcaa 540

cgaggaaaag cgtccgaaca gctacctagc tcgttccaac ccatctgacg ttgcgcgcgt 600

tgagtcccgc accttcatct gctccgagaa ggaagaagat gctggcccaa ccaacaactg 660

ggctccacca caggcaatga aggacgaaat gtccaagcat tacgctggtt ccatgaaggg 720

gcgcaccatg tacgtcgtgc ctttctgcat gggtccaatc agcgatccgg accctaagct 780

tggtgtgcag ctcactgact ccgagtacgt tgtcatgtcc atgcgcatca tgacccgcat 840

gggtattgaa gcgctggaca agatcggcgc gaacggtagc ttcgttaagt gcctccactc 900

cgttggtgct cctttggagc caggccagga agacgttgca tggccttgca acgacaccaa 960

gtacatcacc cagttcccag agaccaagga aatttggtcc tacggttccg gctacggcgg 1020

aaacgcaatt ctggcaaaga agtgctacgc actgcgtatc gcatctgtca tggctcgcga 1080

agaaggctgg atggctgagc acatgctcat cctgaagctg atcaacccag agggcaaggc 1140

gtaccacatc gcagcagcat tcccatctgc ttgtggcaag accaacctcg ccatgatcac 1200

tccaaccatc ccaggctgga ccgctcaggt tgttggcgac gacattgctt ggctgaagct 1260

gcgcgaggac ggcctctacg cagttaaccc agaaaacggt ttcttcggtg ttgctccagg 1320

caccaactac gcatctaacc caatcgcgat gaagaccatg gaaccaggca acaccctgtt 1380

caccaacgtg gcactcaccg acgacggcga catctggtgg gagggcatgg atggcgacgc 1440

ccccgctcac ctcattgact ggaagggtaa cgactggacc ccagagtccg acgaaaacgc 1500

tgctcaccct aactcccgtt actgcgtagc aatcgaccag tccccagcag cagcacctga 1560

gttcaacgac tgggaaggcg tcaagatcga cgcaatcctc ttcggtggac gtcgcgcaga 1620

caccgtccca ctggttactc agacctacga ctgggagcac ggcaccatgg ttggtgcact 1680

gctcgcatcc ggtcagaccg cagcttccgc agaagcaaag gtcggcacac tccgccacga 1740

cccaatggca atgctcccat tcattggcta caacgctggt gaatacctgc agaactggat 1800

tgacatgggc aacaagggtg gcgacaagat gccatccatc ttcctggtca actggttccg 1860

ccgtggcgaa gatggacgct tcctgtggcc tggcttcggc gacaactccc gcgttctgaa 1920

gtgggtcatc gaccgcatcg aaggccgcgt tggcgcagac gagaccgttg ttggacacac 1980

cgctaaggct gaagacctcg acctcgacgg cctcgacacc ccaattgagg atgtcaagga 2040

agcactgacc gctcctgcag agcagtgggc gaacgacgtt caagacaacg ccgagtacct 2100

cactttcctc ggaccacgtg ttcctgcaga ggttcacagc cagttcgatg ctctgaaggc 2160

ccgcatttca gcagctcacg cttaaagttc acgcttaaga actgctaaat aacaagaaag 2220

gctcccgaaa gggagccttt cttgtcgtta agcgatgaat tcctcaaaac ctcagtgctt 2280

tttaaacacc aacaccaagt tacttaccgc gaattctcgg agcactggga ctttaaccat 2340

ccaccaggcc caatacgggt ggtagcgggg aaaagcggca accaattccg cattgcccac 2400

ggaggctccc cattccagcc cctcccggca ggacacatta aacagtgaca tgatgagcga 2460

aagtaataag caacaggcag tgaataagtt gacagagatt gtcgctaact ttaccgccat 2520

gatttctacc cgaatgcctg atgacgtggt ggataaacta aaacagctaa aggatgccga 2580

aacgtcgtcg atggggaaaa ttatctacca tacgatgttc gacaacatgc aaaaagcgat 2640

tgacctgaat cgtcctgcct gtcaggacac cggggagatt atgttcttcg ttaaagtcgg 2700

ttcccgcttc ccactgcttg gcgagctgca aagcatactc aaacaagccg tggaagaggc 2760

aaccgtcaaa gcgccactac gtcacaatgc ggtagaaatt tttgacgaag taaacaccgg 2820

caaaaatacc ggtagcggcg taccgtgggt cacctgggac atcatccccg acaatgacga 2880

tgcggaaatc gaagtttaca tggcaggcgg cggctgcacg ctacctggcc gctcgaaagt 2940

gttaatgccg tcagaaggct acgaaggcgt ggtgaaattc gtcttcgaaa atatctccac 3000

cctcgccgta aacgcctgtc caccggtact ggtgggcgtg ggcatcgcca cctcggtgga 3060

aaccgccgcc gtactctcgc gtaaagccat tttgcgcccg attggcagcc gccatcccaa 3120

tccaaaagcg gcagaactgg agctacgcct ggaagaagga ctcaaccgtc tggggattgg 3180

tccacaaggg ctgaccggca acagttcagt gatgggcgta catatcgaat ctgccgcccg 3240

ccatccgtca accatcggcg ttgctgtctc taccggctgc tgggcgcatc gtcgcggcac 3300

gctgctggtt catgccgatc tcacctttga aaatctgtct cacacccgga gcgcgttaat 3360

gaaaaagatc ctgacaaccc cgatcaaagc tgaagatctg caagatattc gcgtcggcga 3420

tgtgatctac ctgaccggta cgctggtgac ctgccgcgac gtttgtcacc gccgtttgat 3480

cgaactgaaa cgtccgatcc cttacgatct caacggcaaa gcgattttcc acgctggccc 3540

catcgtgcgc aaaaacggcg acaaatggga gatggtctcc gtcggcccga caaccagtat 3600

gcgtatggaa agttttgaac gtgaatttat tgagcagacc ggcgtgaaac tggtggttgg 3660

caaaggtggt atggggccgc tgaccgaaga aggctgccag aaattcaagg cgctacatgt 3720

gattttcccg gcaggctgcg cggtgctggc ggcaacccag gtggaagaga ttgaagaagt 3780

gcactggaca gagctcggaa tgccggagtc actgtgggtc tgccgggtca aagagttcgg 3840

cccgctgatt gtctctattg atacccacgg caacaacctg atagccgaaa acaaaaagct 3900

gttcgccgaa cgccgcgatc ccatcgtgga agagatctgc gagcacgtcc attacatcaa 3960

atagatct 3968

<210> 2

<211> 2449

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1

<400> 2