一株抑制变异链球菌增殖的发酵乳杆菌的制作方法

本发明涉及一株抑制变异链球菌增殖的发酵乳杆菌，属于微生物技术领域。

背景技术：

变异链球菌(Streptococcus mutans)是口腔主要的致龋齿菌之一，常见于牙菌斑中，可通过代谢产生的酸性物质导致龋齿的发生。空腔来源的发酵乳杆菌可以抑制变异链球菌的增殖。因此降低口腔中变异链球菌的量是我们减少龋齿的有效措施之一。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株抑制变异链球菌增殖的发酵乳杆菌，已于2016年8月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2016424，保藏地址为中国武汉，武汉大学，分类为发酵乳杆菌Y29。

本发明的第二个目的是提供所述发酵乳杆菌Y29的培养方法，所述方法是将发酵乳杆菌Y29接种至MRS培养基中，于37℃培养18h。

本发明的第三个目的是提供所述发酵乳杆菌生产的胞外多糖，所述胞外多糖是将发酵乳杆菌Y29接至含80～100g/L葡萄糖的MRS培养基中，37℃培养20～48h，收集多糖。

本发明的第四个目的是提供一种生产胞外多糖的方法，是将所述发酵乳杆菌接至含80～100g/L葡萄糖的MRS培养基中，37℃培养20～48h。

本发明的第五个目的是提供所述发酵乳杆菌Y29的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括：制备抑菌菌剂，制备发酵食品、发酵饮品口香糖、压片糖等。

本发明的第六个目的是提供一种具有口腔抑菌作用的牙膏，含有所述发酵乳杆菌Y29活性成分。

有益效果：本发明提供的发酵乳杆菌Y29，具有产胞外多糖的特性，胞外多糖的产量为3.34g/L，能够有效抑制变异链球菌的增殖，并能够耐受1.2mg/mL溶菌酶。

生物材料保藏

发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)Y29，已于2016年8月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2016424，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

附图说明

图1为发酵乳杆菌菌落PCR后凝胶电泳图；M，Maker DL1000^MT；1～12，分别为编号1～12的待测菌株；

图2为不同物质对变异链球菌的抑制圈；1，发酵乳杆菌；2，无菌水；3，乳酸。

具体实施方式

胞外多糖的检测：(1)标准曲线的绘制：以水为空白对照，分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL浓度为4g/L的葡萄糖，蒸馏水补至2mL。加入1.0mL浓度为6％(w/v)的苯酚、浓硫酸5.0mL静止10min，摇匀室温放置20min，490nm测吸光值。(2)发酵液检测：取1mL胞外多糖发酵液加1mL蒸馏水,加入1.0mL浓度为6％(w/v)的苯酚混匀再加到5.0mL浓硫酸中，静止10min，摇匀，室温放置20min，490nm测吸光值。

实施例1发酵乳杆菌Y29的筛选

(1)筛选

从7名成人口腔牙菌斑取样，无菌生理盐水稀释涂平板，挑单菌进行菌落PCR，特异性引物序列：Lactobacillusfermentum

F\R:TGAAGGAATCGTGGTCGGTG\AAACTGGGTCAAGAAGCGGA，目的片段长度224bp由图1知菌株1-10片段大小在200-300bp之间，而菌株1-5大小更接近目的片段长度(224bp)，因此初筛选择编号1-5的菌株进行进一步鉴定分析。

(2)鉴定

将初筛菌株划线得单菌，在MRS液体培养基中于37℃静置培养24h，收集菌体，提取基因组，采用通用引物进行16s rDNA扩增，其序列如SEQ ID NO.1所示，在NCBI数据库中进行序列比对，将菌株命名为发酵乳杆菌Y29。

实施例2发酵乳杆菌Y29的抑菌作用

将发酵乳杆菌划线培养18h,挑单菌接种于MRS培养基中，37℃，培养16h。然后按4％的接种量接种于产抑菌物质的液体发酵培养基中(培养基成分MRS 52.7g、葡萄糖1g、吐温201g、MgSO40.75g，蒸馏水1L)，37℃培养20h后，12000r/min，4℃离心5min取上清，经0.22μm滤膜过滤后置于4℃冰箱保存。

将培养好的指示菌变异链球菌(Streptococcus mutans)CGMCC 1.2499(菌浓为10⁷CFU/mL)与软琼脂BHI培养基按1:100(菌液：软琼脂培养基)的体积比混匀后倾倒在放有牛津杯的底层素琼脂培养基上。待凝固后取出牛津杯，在相应的孔中分别加入100μL发酵乳杆菌Y29发酵上清液、无菌水和乳酸，再将平板置于37℃培养18-24h，观察抑菌圈。结果显示，发酵乳杆菌Y29抑菌圈直径16.2±0.3mm，对变异链球菌(Streptococcus mutans)CGMCC1.2499有显著的抑制作用。

实施例3发酵乳杆菌Y29产抑菌胞外多糖

将菌株接种到产胞外多糖液体培养基(成分为含终浓度为10％(w/v)葡萄糖的MRS培养基)中，30℃培养48h。取10mL培养液，加入2mL 80％(w/v)三氯乙酸，冰浴搅拌30min。4℃，4100r/min离心20min去菌体和蛋白，往上清液中加入3倍体积冰冻无水乙醇，4℃冷藏过夜，多糖呈絮状沉淀析出。4℃，4000r/min离心20min，用10mL蒸馏水溶解多糖沉淀，4℃备用。经检测，发酵乳杆菌胞外多糖的产量为3.34g/L。

实施例4发酵乳杆菌Y29对溶菌酶的耐受性

采用牛津杯法考察乳杆菌对溶菌酶的耐受情况。下层培养基为15g/L的琼脂，上层为7g/L的MRS培养基与发酵乳杆菌Y29(10⁷CFU/mL)的混合物。利用牛津杯在上层培养基中打孔，然后在每个孔中加入100μL的不同浓度的溶菌酶溶液(0.2－3.0mg/mL)。将上述平板在37℃，5％CO₂培养过夜，根据抑菌圈的情况分析乳酸杆菌对溶菌酶的耐受性。结果显示，发酵乳杆菌Y29能耐受1.2mg/mL溶菌酶。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株抑制变异链球菌增殖的发酵乳杆菌

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 1497

<212> DNA

<213> Lactobacillus fermentum Y29

<400> 1

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