一种分枝杆菌重组基因工程菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)的制备，特别涉及一种分枝杆菌重组基因工程菌及其制备9α-OH-AD的应用。

(二)

背景技术：

甾体类药物具有重要的生理活性，临床上应用广泛。目前，研究者在科学研究和工业生产中，微生物降解植物甾醇大多用来生产雄甾-4-烯-3,17-二酮，雄甾-1,4-烯-3,17-二酮和9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)，且都是生产甾体激素药物的中间体。已发现有2条途径制备9α-OH-AD：其一为两步发酵法，即先由分枝杆菌对甾醇断侧链生产羟基雄甾烯酮(AD)，再以AD为底物借助其他微生物(例如诺卡氏菌、红球菌属或工程大肠杆菌)转化引入9α-羟基，得到9α-OH-AD，如魏东芝等人重组的大肠杆菌具有将AD转化得到9α-OH-AD的活性；杨亚力等人报告了第2条技术途径，即应用筛选出来的分枝杆菌突变株直接发酵催化断裂甾醇侧链，积累得到9α-OH-AD产物。

但是，因为大多数植物甾醇侧链降解后无法积累单一产物，而是同时积累以上三个结构相近和难于分离纯化的甾体化合物，所以大多数生物转化植物甾醇侧链降解菌不能直接在工业上得到应用。为了能够获得高积累量9α-OH-AD产物的植物甾醇侧链降解菌，需要用基因工程的方法对原始的生物转化植物甾醇侧链降解菌进行改造。

植物甾醇生物转化为9α-OH-AD之间涉及到的关键反应之一就是雄甾-4-烯-3,17-二酮在9α位加羟基。9α-OH-AD化学结构上9α-羟基的存在，可借助常规甾体化学合成手段形成C9,11-双键体系，从而很方便地在C₉位引入一个卤素原子形成糖皮质激素必不可缺少的功能羟基。为了获 得高产量的9α-OH-AD，则需要强化KshA和KshB活性。根据NCBI上报道3-甾酮-9α-羟基化酶的基因序列，通过构建3-甾酮-9α-羟基化酶的重组表达质粒，电转化入具有9α-OH-AD转化能力的分枝杆菌中，强化3-甾酮-9α-羟基化酶的活性，以期提高最终9α-OH-AD产物的积累量。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是针对分枝杆菌中的3-甾酮-9α-羟基化酶进行研究，希望通过对其活性的强化来实现转化植物甾醇高纯度积累9α-OH-AD的基因工程菌的构建，提供一种分枝杆菌重组基因工程菌及其制备9α-OH-AD的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种分枝杆菌重组基因工程菌，所述重组基因工程菌是将KshA基因和KshB基因转入分枝杆菌(Mycobacterium.sp)获得的。3-甾酮-9α-羟基化酶基因包括3-甾酮-9α-羟基酶基因(kshA)和3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因(kshB)两部分亚基，用来表达3-甾酮-9α-羟基化，分枝杆菌本身有3-甾酮-9α-羟基化酶基因，但其所表达的3-甾酮-9α-羟基化酶的酶活性偏低，原始分枝杆菌在发酵培养5d积累9α-OH-AD量达到最大，且最大产量为0.957g/L，则植物甾醇的转化率为9.57％，随着发酵催化的时间的延长，9α-OH-AD的积累量会有所降低。所述工程菌是依据GenbanK中KshA与KshB的相似基因设计引物，以分枝杆菌的基因组为模板通过PCR技术手段获取KshA与KshB基因，以共表达的方式插入pNIT表达质粒中，用来提高3-甾酮-9α-羟基化酶的酶活，加强甾体母核上C_9α位的羟基化作用，提高提高9α-OH-AD的生物转化率。获取转化子pNIT-kshA-kshB后将其电转化至分枝杆菌得到分枝杆菌重组基因工程菌；所述KshA基因核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，所述KshB基因核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供一种所述分枝杆菌重组基因工程菌在制备9α-OH-AD中的应用，具体所述应用以分枝杆菌重组基因工程菌为酶源，以发酵培养基为反应基质，在30～32℃、180～200r/min条件下培养至对数生长初期时，加入终浓度为5～15g/L的诱导剂己内酰胺，继续培养1～2d，加入植物甾醇，在30～32℃、180～200r/min条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得9α-OH-AD；所述植物甾醇以10g/L乳化植物甾醇溶液的形式加入，所述10g/L乳化植物甾醇溶液制备方法为：将植物甾醇加入到吐温80，再加水至植物甾醇终浓度10g/L，搅拌10min后，超声(350W)溶解30min，121℃，灭菌1h，获得10g/L乳化植物甾醇溶液，所述植物甾醇与吐温80质量比为5:1；所述发酵培养基终浓度组成：MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，NH₄NO₃ 1.0g/L，K₂HPO₄ 0.25g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖1g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0。

进一步，所述10g/L乳化植物甾醇溶液体积加入量以发酵培养基体积计为5％。

进一步，所述酶源以体积浓度1％接种量的种子液形式接种至发酵培养基，所述种子液按如下方法制备：

(1)斜面培养：将分枝杆菌重组基因工程菌接种至斜面培养基，在30℃培养2～3d，获得斜面菌体；斜面培养基质量终浓度组成：甘油20g/L，柠檬酸2g/L，NH₄NO₃ 2g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.5g/L，2％琼脂，溶剂为去离子水，pH 7.0；

(2)种子培养：挑取斜面菌体接种至种子培养基，在30℃、180r/min振荡培养2至3d，获得种子液；种子培养基终浓度组成为：甘油20g/L，柠檬酸2g/L，NH₄NO₃ 2g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.5g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0。

本发明构建的分枝杆菌重组基因工程菌产3-甾酮-9α-羟基化酶，为提 高甾体类药物9α-OH-AD生产效率提供一定的基础。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明构建的分枝杆菌重组基因工程菌转化植物甾醇制备9α-OH-AD的转化能力比原始菌株提高了50.78％，9α-OH-AD产量在最大值处提高了0.486g/L，最大产量达到1.443g/L。

(四)附图说明

图1为PCR产物及重组质粒电泳图，M为10000bp DNA Marker，1为重组质粒pNIT-KshA；2为重组质粒pNIT-KshA-KshB；3为KshA PCR产物；4为KshB PCR产物。

图2为重组质粒pNIT-KshA-KshB单双酶切验证图，M：10000DNAMarKer；1：质粒pNIT-KshA-KshB单酶切；2、3：重组质粒pNIT-KshA-KshB双酶切。

图3为植物甾醇底物及工程菌M-KsH生物转化的产物的薄层层析检测(TLC)图；条带1是样品9α-OH-AD；条带2是底物植物甾醇；条带3是工程菌M-ksH生物转化的产物。

图4为9α-OH-AD样品标准曲线。

图5工程菌M-KsH生物转化的产物的高效液相色谱(HPLC)图谱，图谱1为9α-OH-AD标准样品的峰谱图。图谱2是工程菌M-KsH生物催化植物甾醇的产物，图谱3是原始分枝杆菌生物转化植物甾醇的产物。

图6产物9α-OH-AD的核磁共振氢谱。

图7产物9α-OH-AD质谱分析图。

图8转化产物9α-OH-AD的产量图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例中所用的每升种子培养基组成为：甘油20g，柠檬酸2g，NH₄NO₃ 2g，柠檬酸铁铵0.05g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄ 0.5g，加1L去离子水，pH调至7.0，121℃，灭菌20min。

斜面或平板培养基：种子培养基添加质量终浓度2％琼脂。

发酵培养基组成：MgSO₄·7H₂O 0.25g，NH₄NO₃ 1.0g，K₂HPO₄ 0.25g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，酵母粉5g，葡萄糖1g，加去离子水至1L，pH调为7.0。

实施例1分枝杆菌pNIT-kshA-kshB(M-ksH)工程菌的构建方法

以CTAB法获得从中国微生物菌种库购买的编号CICC21097分枝杆菌(Mycobacterium.sp)的基因组DNA，扩增得到KshA与KshB目的基因，再将KshA与KshB目的基因导入pNIT质粒中，具体方法如下：

1.分枝杆菌基因组的小量提取

从分枝杆菌甘油管中挑取菌液涂平板，32℃培养2～3d，取单菌落接种于种子培养基，30℃培养24h后，从摇瓶中取2mL的菌液置于管中12000rpm离心1min，去上清液，沉淀用1.5mL质量浓度40％的NaOH水溶液悬浮，置于37℃水浴振荡30min；12000rpm离心5min，去上清液，收集菌体；加600μL TE缓冲液，吹打混匀，沸水浴中加热10min，并立即将离心管放入-20℃冰箱当中，放置30min；加入40μL(终浓度20mg/mL，溶剂为双蒸水)溶菌酶，置于37℃水浴振荡120min，加入蛋白酶K(终浓度250μg/mL)和SDS(终浓度1％)，水浴65℃震荡30min；水浴完毕后，加入80μL质量浓度10％的CETAB水溶液(十六烷基三甲基溴化铵，溶剂为双蒸水)和80μL质量浓度10％的NaCl水溶液，CETAB和NaCl二者终浓度均为1％，水浴中20min；水浴结束之后立即用1～3ml酚:氯仿:异戊醇(25:24:l，v/v/v)混合溶液沉淀蛋白质，并用相对于酚:氯仿:异戊醇(25:24:l，v/v/v)混合溶液两倍体积的乙醇沉淀，12000rpm离心10 min，取沉淀得到基因组DNA，吹干乙醇，加入5μL RNA酶和45μL ddH₂O，37℃水浴30min。

2.kshA和kshB目的基因的扩增

根据分枝杆菌的基因组DNA序列设计引物：

KshA F:5’-CCGGAATTCGATGACTACCGAGACAG-3’，

KshAR:5’-AGGAAAAAAGCGGCCGCTCAGCTCGGCTGCGCGGACT-3’。

KshB F：5’-GGAAGATCTCATGACGGAGGAACCGCTCG-3’

KshB R：5’-CCGCTCGAGCTAATCGTCATAGGTGACTTCCACCGAAT-3’

以分枝杆菌基因组DNA为扩增模板，KshA F/KshA R、KshB F/KshB R为引物进行PCR扩增KshA与KshB基因。PCR体系：分枝杆菌基因组DNA 5μL，2×KOD Fx buffer 25μL，dNTPs 10μL，上、下游引物各2.5μL，KOD Fx酶1μL，ddH₂O 4μL，总体积50μL。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性45s，67℃退火45s，68℃延伸2min，循环30次，68℃延伸10min，16℃保温。反应结束取样10μL，用质量分数为0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定，以2000bp的DNA Marker为对照。

3.工程菌分枝杆菌pNIT-kshA-kshB(M-ksH)的构建

步骤2得到目的片段KshA(大小1157bp，SEQ ID NO.1所示)和KshB(大小1056bp，SEQ ID NO.2所示)，用EcoR I和Nde I进行双酶切KshA，将其插入经过同样酶切处理的表达载体pNIT质粒中，获得的中间质粒pNIT-KshA，DNA条带大小为7400bp，大小相符。再经EcoR I和Hind III双酶切，与经过同样酶切的KshB连接，即为3-甾酮-9α-羟基化酶基因的表达质粒，命名为pNIT-KshA-KshB，大小为9000bp左右。如图1所示，经上海生工生物有限公司测序的结果表明与GenBanK中KshA及KshB的序列达到99％的一致性。

通过对载体pNIT-KshA-KshB进行单双酶切鉴定，结果如图2所示， 对pNIT-KshA-KshB进行的EcoR I单双酶切，在9000bp与1000bp左右出现亮条带，与理论基因线状条带大小相似。对pNIT-KshA-KshB进行EcoR I和Nde I双酶切基因KshA，分别在1200bp与7500bp左右出现亮条带，与理论KshA基因条带大小(1157bp)相似。对pNIT-KshA-KshB进行的EcoR I、Nde I和Hind III双酶切，分别在1200bp、1100bp与6200bp左右出现亮条带，与理论KshA基因、KshB基因条带大小相似。

采用细菌电转化的方法，将上述重组表达质粒pNIT-KshA-KshB转化入分枝杆菌感受态细胞中，涂布于含0.15mg/L卡那霉素平板中，37℃培养2～3d，挑取单菌落进行菌落PCR扩增，阳性菌落即为构建的重组基因工程菌，记为工程菌M-KsH。

实施例2工程菌M-ksH培养

(1)斜面培养：将工程菌M-KsH接种至斜面培养基，在37℃培养2～3d，获得斜面菌体；

(2)种子培养：挑取斜面菌体接种至种子培养基，在30℃、180r/min振荡培养1～2d，获得种子液；

(3)发酵培养：取种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基，30℃、180r/min振荡培养2～3d至出现白色浑浊的现象。

实施例3工程菌M-ksH对植物甾醇的生物转化分析检测

1.实验目的：比较工程菌M-ksH对植物甾醇的生物转化能力。

2.实验方法：

10g/L乳化植物甾醇溶液：将5g植物甾醇加入到1g吐温80中，水定容至50mL，搅拌10min后，使用超声(350W)溶解30min，121℃，灭菌1h，获得10g/L乳化植物甾醇溶液。

取种子液以体积浓度1％的接种量接种至100mL发酵培养基，30℃、180r/min振荡培养至对数生长初期时，加入350μL终浓度为10g/L的诱 导剂己内酰胺，继续培养，诱导表达约1～2d。加入5ml、10g/L乳化植物甾醇溶液，于相同条件继续振荡发酵培养，1d取一次样，每次取1mL样品，用相对于样品两倍体积的乙酸乙酯萃取，漩涡振荡10min后，10000rmp离心5min，取上清溶液采用薄层层析(TLC)检测工程菌M-KsH是否有转化底物产生9α-OH-AD的能力；随后用高效液相色谱(HPLC)比较原始菌株与工程菌M-KsH的产物产量，以9α-OH-AD标准品为对照，根据9α-OH-AD标准曲线获取待测样品中9α-OH-AD含量，同样条件下以原始菌分枝杆菌(Mycobacterium.Sp)作对照。

薄层层析检测以石油醚：乙酸乙酯＝3：1，v/v为展开剂，以植物甾醇和9α-OH-AD标准品为对照。

高效液相色谱检测条件为：色谱柱为岛津C₁₈色谱柱，柱温35℃，检测波长254nm，流速：1mL/min，进样量：10μL。流动相为：甲醇(HPLC级100％)：水＝70：30(V：V)，流速1.0mL/min，检测波长254nm。3.实验结果：

检测结果如图3、图5。图3是植物甾醇标准品及生物转化产物的薄层层析(TCL)检测结果，条带1是标准品9α-OH-AD；条带2是标准品植物甾醇，没有明显的条带，说明植物甾醇在紫外254nm处不显色；条带3是工程菌M-KsH生物转化的产物，与9α-OH-AD标准品的位置对应一致，说明转化产物有9α-OH-AD积累。

9α-OH-AD标准曲线的测定：分别用乙酸乙酯配制9α-OH-AD浓度为0.1g/L、0.3g/L、0.5g/L、0.7g/L、0.9g/L的标准液，采用高效液相色谱法检测标准液，以峰面积为纵坐标，以9α-OH-AD浓度为横坐标，利用最小二乘法作回归曲线，得到标准品9α-OH-AD的标准曲线方程为：y＝20,752,466.000x+505,902.400，R²＝0.997，如图4。

图5中曲线2和3是同一条件下发酵催化得到的产物。曲线1为 9α-OH-AD标准品的峰谱图，可以看见保留时间为5.565min，作为一个参考对照。曲线3是原始分枝杆菌生物转化植物甾醇的产物，产物保留时间与标样保留时间一致，可以初步确认产物为9α-OH-AD，根据保留峰面积和样品9α-OH-AD标准曲线可以计算出产物的产量为0.756g/L。曲线2是工程菌M-KsH生物催化植物甾醇的产物，与标样和原始菌催化产物保留时间一致，初步确定了工程菌M-KsH能够生物催化植物甾醇为9α-OH-AD，根据保留峰面积和9α-OH-AD标准曲线可以计算出产物的最高产量为0.966g/L，相比较，重组分枝杆菌M-ksH的转化率比原始分枝杆菌转化率提高了50.78％，9α-OH-AD产量在最高点提高了0.486g/L。

4.实验结论：结果表明，本发明的工程菌M-ksH催化植物甾醇为9α-OH-AD的能力提高。

经过TLC和HPLC检测，初步确定了工程菌M-KsH能将植物甾醇生物转化为9α-OH-AD。为了进一步证实，采用制备的TLC，刮取疑似产物色谱带硅胶粉末，乙酸乙酯复溶萃取，30℃旋转蒸发干燥，获得纯化的产物样品，进行光谱学分析以鉴定其化学结构。鉴定结果如图6、图7所示。

1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ5.67(s，1H),4.25(s，1H)，2.44–2.36(m，2H)，2.27–2.14(m，2H)，2.09–1.98(m，2H)，1.83–1.74(m，2H)，1.73–1.64(m，1H)，1.62–1.40(m，8H)，1.27(s，3H)，0.83(s，3H)。

TOF-MS谱显示其[M+H]+处于m/z303.2，说明该产物分子量为302，与9α-OH-AD的分子质量302.4相符合。因此，工程菌M-KsH能够将植物甾醇生物转化为9α-OH-AD，且转化能力有一定的提高，相比较，重组分枝杆菌M-ksH的转化率比原始分枝杆菌转化率提高了50.78％，其最大产量最高值为1.443g/L，说明3-甾酮-9α-羟基化酶有一定的表达。

实施例4工程菌M-ksH与原始分枝杆菌对植物甾醇的生物转化分析 检测

1.实验目的：比较工程菌M-ksH和原始菌催化植物甾醇的能力及产物含量。

实验方法：分别在实施例3同一温度、转速条件下，各自加入5ml、10g/L乳化植物甾醇溶液作为底物(该底物与实施例3中的底物相同)，其它操作同实施例3，在发酵催化的过程中，每1d取一次样。采用HPLC检测，根据样品9α-OH-AD标准曲线计算出9α-OH-AD产量，同样条件下，以原始分枝杆菌为对照，绘制如图8所示。

3.实验结论：图8显示，2d后发酵转化液中开始积累9α-OH-AD。原始分枝杆菌在第5d积累9α-OH-AD量达到最大，且最大产量为0.957g/L，则植物甾醇的转化率为9.57％，随着发酵催化的时间的延长，9α-OH-AD的积累量会有所降低。工程菌M-KsH差不多在第6d时9α-OH-AD积累量达到最大，产物9α-OH-AD最大产量为1.443g/L，因此植物甾醇的转化率为14.43％。同样，随着发酵催化的时间的延长，9α-OH-AD的积累量会有所降低。相比较而言，工程菌M-KsH的转化率比原始分枝杆菌转化率提高了50.78％，9α-OH-AD产量在最大值处提高了0.486g/L，最高产量为1.443g/L。