绞股蓝糖基转移酶的工程菌及其构建方法与应用与流程

本发明属于生物制药技术领域，涉及一种利用大肠杆菌异源表达绞股蓝糖基转移酶在体外合成稀有人参皂苷的方法，同时还涉及该绞股蓝糖基转移酶在合成稀有人参皂苷CK中的应用。

背景技术：

绞股蓝为葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物，绞股蓝中含有多种药用成分，其中最主要的药效成分为绞股蓝皂苷。绞股蓝皂苷结构为四环三萜达玛烷型，与人参皂苷的结构相同。绞股蓝皂苷由两部分组成，是由苷基与配糖基相结合形成的生物大分子。至今已发现有八种绞股蓝皂苷在结构上与原人参二醇型人参皂苷是完全相同的，且这八种皂苷的总量达到总皂苷的25%左右，而且其中有六种成分其含量高于人参中所对应的相同成分，因此具有广泛的药理作用。绞股蓝皂苷具有多种特殊的药理作用，具有降低血脂、抗肿瘤、降血糖、抗衰老等药理作用，且无抗药性、无副作用。绞股蓝在保健食品和新型药品研发上都有巨大的应用前景，是一种新的药食两用植物资源。研究绞股蓝皂苷的代谢通路，进行皂苷的异源生物合成，从而提高绞股蓝皂苷的产率具有重要意义。目前关于绞股蓝皂苷的研究主要集中在总皂苷水平，对单一皂苷的研究相对较少，通过对底物进行糖基化修饰得到的皂苷具有单一性的特点，且还可得到稀有绞股蓝皂苷。因此，获得大量高纯度的绞股蓝皂苷是当前研究的热点。

目前，生产人参皂苷的方法主要是从栽培人参中提取。而人参的生长周期长，且提取人参皂苷的工艺流程复杂、产率低、容易造成环境污染。而糖苷酶法则具备立体选择性、得率高、副产物少且可以得到稀有人参皂苷等优点。被认为是生产稀有人参皂苷最有潜力的方法。

随着测序等技术的不断发展，基因库资源不断丰富，本发明人努力查明了具有从绞股蓝向人参皂苷转移糖活性的绞股蓝糖基转移酶。且确认所述绞股蓝糖基转移酶UGTGp4对通过糖苷键而与PPD的第20位的葡萄糖具有糖转移活性，从而完成了本发明。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于开发一种糖基转移酶，该糖基转移酶通过糖苷键而与原人参二醇PPD的第20位的葡萄糖具有糖转移活性，从而生成稀有人参皂苷CK。

本发明人借助于特征序列法，PSPG盒是植物次生代谢产物糖基转移酶的一个标志性的重要特性，可通过PSPG序列来筛选糖基转移酶基因。并结合NCBI等数据库资源，筛选出了可能催化原人参二醇20位羟基糖基化反应的糖基转移酶基因。将初步筛选到的基因在大肠杆菌表达系统中进行表达，纯化得到粗酶液。经实验证明该基因能够催化原人参二醇20位羟基糖基化反应，生成大量、单一的稀有人参皂苷CK。

另一方面，本发明提供了一种糖基化合成稀有人参皂苷CK的糖基转移酶及其编码的基因。所述糖基转移酶的基因序列为SEQ ID NO.4。

第三方面，本发明提供了一种绞股蓝糖基转移酶蛋白质，其对通过糖苷键而连接在所述PPD类人参皂苷的第20位的葡萄糖具有糖转移酶活性。

第四方面，本发明进一步提供了一种使用绞股蓝糖基转移酶体外合成人参皂苷CK的方法。该方法以原人参二醇和糖基供体UDP-葡萄糖为原料，在绞股蓝糖基转移酶的催化下，原人参二醇的第20位羟基发生糖基化，生成稀有人参皂苷CK。实验结果显示：采用本发明的合成方法所生成的人参皂苷CK，经处理后纯度可以达到98% 。

最后，本发明还提供了包含编码该绞股蓝糖基转移酶的重组载体，以及该重组载体的转化体。该重组载体为现代技术中的任意的基因的重组载体，例如本实验中用到的pET-28a质粒。该载体融合有六聚组氨酸标签，可利用Ni-NTA His-结合树脂柱而容易的回收所需的靶蛋白。

所述重组载体的转化体，即指的是重组载体的宿主细胞。例如本实验中用到的大肠杆菌E.coliBL21（DE3）（NEB公司）。但是不仅限于此。

为实现上述目的本发明公开了如下的技术内容：

一种表达绞股蓝糖基转移酶UGTGp4的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于可以异源表达绞股蓝糖基转移酶，基因工程菌名称为H2494。

本发明所述表达绞股蓝糖基转移酶UGTGp4的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于按照如下步骤进行：

1）运用生物信息学方法，通过与已知人参皂苷功能相关糖基转移酶序列进行BLAST对比，预测了能够形成绞股蓝皂苷的糖基转移酶基因，命名为comp20426。

2）提取绞股蓝总RNA,通过反转录得到绞股蓝cDNA文库；

3）设计特异引物，然后从绞股蓝cDNA 文库中扩增得到绞股蓝皂苷糖基转移酶基因comp20426；

4）制备含有绞股蓝皂苷糖基转移酶基因comp20426的重组质粒，获得构建代谢途径的质粒；

5）将宿主菌大肠杆菌E.coliBL21（DE3）（NEB公司）进行溶源化处理，将步骤4）所获得的重组质粒转化到溶源菌中，获得能够表达绞股蓝糖基转移酶UGTGp4的大肠杆菌基因工程菌。其中所述构建绞股蓝糖基转移酶UGTGp4的克隆引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2 所示。

本发明进一步公开了一种绞股蓝糖基转移酶UGTGp4蛋白质，其特征在于具有将糖苷键连接在第20位碳上的葡萄糖的PPD的具有糖转移酶活性的绞股蓝糖基转移酶蛋白质，为SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列。

本发明更进一步公开了绞股蓝糖基转移酶糖基化体外合成CK的方法，其特征在于，以原人参二醇PPD和糖基供体UDP-葡萄糖为底物，在绞股蓝糖基转移酶的催化下，原人参二醇的C20位发生糖基化反应，生成稀有人参皂苷CK。

本发明公开的SEQ ID NO1-4的序列如下：

CGGGATCCATGGAAAGAGATGAAAAAGGC （SEQ ID NO.1）

CCGCTCGAGTTATTTATTGCGGGTAAGTTTG（SEQ ID NO.2）

MERDEKGKEVHVIVVPFCIQGHINPLLQFSKHLAHKGLKVTLPTIFTHKFNNNTSSTHPSLLTIDQVPLLPYQEPEPEYVSAYWRRHHTSIRVHLTELMTRHQSAGNHVSCIVYDSIMTWVLDIVKQFGVLGASFFTQSCAVNAIYYNYHMGLLNVPLDHNFVLDGFPILHKSDLPLFLVESEKYSSILTLLSHQFSRLNEVDSIFVNTFDRLEQQEVDWMGSKYPFKNIGPMVPSMYLDGQLKDDTDYGLCLCDQNMDSTMNWIHSKPDNSLIYVSFGSMAELGKEQMEEIAWGLKMSNRFFLWVVRESEIQKLPNNFIEETSEKGTVVNWCPQLEVLGHKSIGCFISHCGWNSTLEALSLGVPMVAMPQTSDQPTNAKYVEDVWKVGRRVRVDEGQGIAKREEILLSINEVMEGEKSREIRDNLRKWKELAKQAMDEHGTSNNNINEFVDKLTRNK（SEQ ID NO.3）

（SEQ ID NO.4）

ATGGAAAGAGATGAAAAAGGCAAAGAAGTTCATGTAATAGTTGTTCCATTCTGTATCCAAGGTCACATTAACCCATTGCTCCAATTTTCAAAACATCTTGCCCACAAAGGGCTCAAAGTTACACTTCCCACCATTTTCACACACAAATTCAATAACAATACATCATCCACACATCCCTCACTACTCACCATTGATCAAGTTCCTCTTTTGCCATACCAAGAACCTGAGCCTGAGTACGTTTCTGCGTATTGGCGTCGACATCATACGTCGATCCGTGTGCATCTAACCGAGCTTATGACT

CGACATCAAAGCGCCGGCAATCATGTTTCTTGCATTGTTTATGACTCTATCATGACTTGG

GTTCTAGACATTGTCAAACAGTTTGGGGTTTTGGGTGCTTCTTTCTTCACCCAATCTTGT

GCTGTCAATGCTATTTATTACAACTATCACATGGGGTTGTTAAATGTTCCATTGGATCAC

AACTTTGTTCTTGATGGGTTCCCTATTCTCCACAAATCCGATCTCCCACTTTTCCTTGTT

GAATCAGAGAAGTACTCATCAATTCTTACCTTATTAAGTCATCAATTCTCGCGTTTGAAC

GAGGTCGATTCGATTTTCGTCAACACTTTCGATCGCTTGGAACAACAGGAAGTTGATTGGATGGGAAGCAAATATCCATTCAAGAACATTGGACCAATGGTACCCTCCATGTATTTGGATGGACAGCTAAAGGATGACACAGATTATGGTCTCTGTCTTTGTGATCAAAATATGGATTCAACAATGAATTGGATTCATTCGAAACCCGATAACTCACTCATTTATGTGTCATTTGGAAGCATGGCAGAATTGGGGAAAGAGCAAATGGAAGAGATAGCATGGGGATTGAAAATGAGCAATAGATTCTTCTTGTGGGTTGTTAGAGAATCTGAAATCCAAAAGCTTCCTAACAATTTTATAGAAGAAACATCTGAGAAAGGTACGGTAGTGAATTGGTGTCCTCAGTTGGAAGTTTTGGGTCATAAATCAATTGGATGTTTCATCAGTCATTGTGGTTGGAATTCAACTCTTGAAGCATTGAGTTTGGGAGTTCCAATGGTGGCAATGCCACAGACTTCAGACCAACCAACAAATGCAAAATATGTGGAGGATGTGTGGAAGGTTGGGAGAAGGGTCAGAGTGGATGAAGGTCAAGGAATTGCCAAAAGGGAAGAGATACTACTCTCTATTAATGAGGTGATGGAGGGAGAAAAGAGTAGAGAAATTAGAGACAATCTAAGGAAATGGAAGGAATTGGCAAAACAAGCTATGGATGAACATGGAACTTCCAACAATAACATTAATGAATTTGTAGACAAACTTACCCGCAATAAATAA。

通过以上技术方案的实施，本发明公开的绞股蓝糖基转移酶的工程菌及其构建方法与应用所具有的积极效果在于：

1）本发明所述的糖基转移酶能成功的在体外合成稀有人参皂苷CK。是一种新的生产方法，流程简单，产量较高，消耗低。

2）本发明所述的绞股蓝糖基转移酶基因丰富了目前的糖基转移酶数据库。

附图说明

图1是质粒pET-28a（+）-comp20426的图谱，用于表达绞股蓝糖基转移酶UGTGp4；

图2是原人参二醇糖基化产物的质谱（MS）谱图；

图3是原人参二醇及其糖基化产物的HPLC谱图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明以下实施例中所用的材料、试剂、仪器和方法未经特殊说明均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得；例如Tryptone(胰蛋白胨)，Yeast Extract（酵母提取物），Agar（琼脂）；卡那霉素，E.coliDH5α等等。

本发明中质粒提取采用生工生物工程（上海）有限公司的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（Catalog NO.：B518191），切胶回收是采用生工生物工程（上海）有限公司的SanPrep柱式胶回收试剂盒（Catalog NO.：B518131），DNA片段的连接是使用fermentas公司的T4 DNA Ligase（Catalog NO.：EL0014），DNA片段的扩增使用fermentas公司的pfu DNA polymerase（Catalog NO.：EP0571）,PCR质粒模板的消化使用fermentas公司的Fast DigestXhoI（Catalog NO.：FD0694），BamHI（Catalog NO.：FD0054） E.coli电击转化实验使用Bio-Rad的电转仪（Catalog NO.：165-2100）。

实施例1

源自绞股蓝的糖基转移酶UGTGp4的克隆

借助于基于化合物、化学反应的检索工具，结合NCBI等数据库的资源，以及植物的PSPG盒等原则，筛选了可能催化原人参二醇糖基化的糖基转移酶基因。利用引物SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2，并利用聚合酶通过PCR从绞股蓝cDNA文库扩增基因。扩增后的片段进行切胶纯化，并用XhoI和BamHI进行双酶切，酶切后的片段与同样经过XhoI和BamHI双酶切的质粒pET-28a（+）质粒进行连接，将载体：目的片段按摩尔比为1:3的比例混合，加入T4 DNA Ligase后在22℃下酶连5h，连接产物转化E.coliDH5α，并在卡纳板上进行筛选阳性克隆，测序验证。获得重组质粒pET-28a（+）-comp20426。

实施例2

大肠杆菌表达菌株的建立以及绞股蓝糖基转移酶UGTGp4的纯化

将重组表达质粒转化到宿主菌E.coli BL21(DE3)（NEB公司）感受态细胞，得到绞股蓝糖基转移酶的重组表达菌株。培养重组菌至OD为0.6～0.8时，添加0.1mM IPTG，在低温16℃诱导表达20h。4℃，5500rpm离心收集细胞，将细胞进行超声破碎。对其利用Ni-NTA His-结合树脂纯化。

实施例3

in vitro酶实验

按照所述配制体外的反应体系，进行糖基转移酶的实验。

在30℃下，对反应混合物进行3h的培养反应后，加入相同体积正丁醇使其终止反应。

实施例4

产物的检测

对反应体系用正丁醇抽提，萃取的有机相真空干燥后加甲醇回溶。进行电喷雾电离质谱（ESI）检测，结果如图2所示，结果显示(m/z)622.68为glc-O-原人参二醇的分子离子峰，结果与预期产物glc-O-原人参二醇（623）的分子量相符，(m/z)644.24为glc-O-原人参二醇的加钠峰，结果与glc-O-原人参二醇（Na+）（645）的分子量相符。

仪器：Finnigan

LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer

(Thermo Electron,CA)

离子化模式：电喷雾负离子模式；

电喷雾范围：400-500 m/z；

干燥器温度：250 ℃；

喷雾压力：45 psi；

毛细管电压：4500 V；

进样量：0.2 mL/min；

产物的质谱图如图2所示，根据分子量判断，该化合物为原人参二醇的单糖基化产物Glc-O-原人参二醇(m/z)623。

对反应体系用正丁醇抽提，萃取的有机相真空干燥后加甲醇回溶。进行HPLC检测分析与定量结果如图3所示。

使用Shimadzu LC-20A prominence system (Shimadzu, Kyoto, Japan ),使用Shodex C18-120-5 4E column (5μm 4.6mm×250mm)，按照每分钟800 μl的流速，0 min，35%乙腈，50 min，90%乙腈，55 min，90%乙腈，55-65 min，35%乙腈。检测波长203 nm。

图3结果表明：

（1）标准品CK在35 min左右出峰；

（2）负对照未添加酶液在35 min没有产物出现；

（3）添加酶液反应后在35 min有产物峰出现，且峰值较高。

实施例5

以原人参二醇PPD和糖基供体UDP-葡萄糖为底物，在绞股蓝糖基转移酶的催化下，原人参二醇的C20位发生糖基化反应，生成稀有人参皂苷CK。按实施例3中的比例配制100mL 的反应液。在30 ℃条件下，反应48 小时。加入相同体积正丁醇终止反应。取上层有机相旋转蒸发干燥，用硅胶柱纯化，洗脱剂为氯仿:甲醇（85:15），每5 mL 等份收集，收集的样品进行ESI和HPLC 分析(条件同前所述) ，获得原人参二醇糖基化产物部分，纯度<90%。

进一步利用Sep-Pak tC18 柱(Waters) 对上述收集部分进行纯化，水(A) 和乙腈(B) 作为洗脱剂，采用梯度洗脱(20% B 、40% B 、50% B 、60% B 、65% B 、70% B 、75% B 、80%B 、85%B 、90%B 、100%B)，在70% 及75% 乙腈洗脱时，获得原人参二醇糖基化产物部分，纯度达到98% 。于40 ℃旋转蒸发或冷冻干燥得白色粉末。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的范围和精神。

SEQUENCE LISTING

<110> 南开大学

<120> 绞股蓝糖基转移酶的工程菌及其构建方法与应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgggatccat ggaaagagat gaaaaaggc 29

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgctcgagt tatttattgc gggtaagttt g 31

<210> 3

<211> 458

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma texanum

<400> 3

Met Glu Arg Asp Glu Lys Gly Lys Glu Val His Val Ile Val Val Pro

1 5 10 15

Phe Cys Ile Gln Gly His Ile Asn Pro Leu Leu Gln Phe Ser Lys His

20 25 30

Leu Ala His Lys Gly Leu Lys Val Thr Leu Pro Thr Ile Phe Thr His

35 40 45

Lys Phe Asn Asn Asn Thr Ser Ser Thr His Pro Ser Leu Leu Thr Ile

50 55 60

Asp Gln Val Pro Leu Leu Pro Tyr Gln Glu Pro Glu Pro Glu Tyr Val

65 70 75 80

Ser Ala Tyr Trp Arg Arg His His Thr Ser Ile Arg Val His Leu Thr

85 90 95

Glu Leu Met Thr Arg His Gln Ser Ala Gly Asn His Val Ser Cys Ile

100 105 110

Val Tyr Asp Ser Ile Met Thr Trp Val Leu Asp Ile Val Lys Gln Phe

115 120 125

Gly Val Leu Gly Ala Ser Phe Phe Thr Gln Ser Cys Ala Val Asn Ala

130 135 140

Ile Tyr Tyr Asn Tyr His Met Gly Leu Leu Asn Val Pro Leu Asp His

145 150 155 160

Asn Phe Val Leu Asp Gly Phe Pro Ile Leu His Lys Ser Asp Leu Pro

165 170 175

Leu Phe Leu Val Glu Ser Glu Lys Tyr Ser Ser Ile Leu Thr Leu Leu

180 185 190

Ser His Gln Phe Ser Arg Leu Asn Glu Val Asp Ser Ile Phe Val Asn

195 200 205

Thr Phe Asp Arg Leu Glu Gln Gln Glu Val Asp Trp Met Gly Ser Lys

210 215 220

Tyr Pro Phe Lys Asn Ile Gly Pro Met Val Pro Ser Met Tyr Leu Asp

225 230 235 240

Gly Gln Leu Lys Asp Asp Thr Asp Tyr Gly Leu Cys Leu Cys Asp Gln

245 250 255

Asn Met Asp Ser Thr Met Asn Trp Ile His Ser Lys Pro Asp Asn Ser

260 265 270

Leu Ile Tyr Val Ser Phe Gly Ser Met Ala Glu Leu Gly Lys Glu Gln

275 280 285

Met Glu Glu Ile Ala Trp Gly Leu Lys Met Ser Asn Arg Phe Phe Leu

290 295 300

Trp Val Val Arg Glu Ser Glu Ile Gln Lys Leu Pro Asn Asn Phe Ile

305 310 315 320

Glu Glu Thr Ser Glu Lys Gly Thr Val Val Asn Trp Cys Pro Gln Leu

325 330 335

Glu Val Leu Gly His Lys Ser Ile Gly Cys Phe Ile Ser His Cys Gly

340 345 350

Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ala Leu Ser Leu Gly Val Pro Met Val Ala

355 360 365

Met Pro Gln Thr Ser Asp Gln Pro Thr Asn Ala Lys Tyr Val Glu Asp

370 375 380

Val Trp Lys Val Gly Arg Arg Val Arg Val Asp Glu Gly Gln Gly Ile

385 390 395 400

Ala Lys Arg Glu Glu Ile Leu Leu Ser Ile Asn Glu Val Met Glu Gly

405 410 415

Glu Lys Ser Arg Glu Ile Arg Asp Asn Leu Arg Lys Trp Lys Glu Leu

420 425 430

Ala Lys Gln Ala Met Asp Glu His Gly Thr Ser Asn Asn Asn Ile Asn

435 440 445

Glu Phe Val Asp Lys Leu Thr Arg Asn Lys

450 455

<210> 4

<211> 1377

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggaaagag atgaaaaagg caaagaagtt catgtaatag ttgttccatt ctgtatccaa 60

ggtcacatta acccattgct ccaattttca aaacatcttg cccacaaagg gctcaaagtt 120

acacttccca ccattttcac acacaaattc aataacaata catcatccac acatccctca 180

ctactcacca ttgatcaagt tcctcttttg ccataccaag aacctgagcc tgagtacgtt 240

tctgcgtatt ggcgtcgaca tcatacgtcg atccgtgtgc atctaaccga gcttatgact 300

cgacatcaaa gcgccggcaa tcatgtttct tgcattgttt atgactctat catgacttgg 360

gttctagaca ttgtcaaaca gtttggggtt ttgggtgctt ctttcttcac ccaatcttgt 420

gctgtcaatg ctatttatta caactatcac atggggttgt taaatgttcc attggatcac 480

aactttgttc ttgatgggtt ccctattctc cacaaatccg atctcccact tttccttgtt 540

gaatcagaga agtactcatc aattcttacc ttattaagtc atcaattctc gcgtttgaac 600

gaggtcgatt cgattttcgt caacactttc gatcgcttgg aacaacagga agttgattgg 660

atgggaagca aatatccatt caagaacatt ggaccaatgg taccctccat gtatttggat 720

ggacagctaa aggatgacac agattatggt ctctgtcttt gtgatcaaaa tatggattca 780

acaatgaatt ggattcattc gaaacccgat aactcactca tttatgtgtc atttggaagc 840

atggcagaat tggggaaaga gcaaatggaa gagatagcat ggggattgaa aatgagcaat 900

agattcttct tgtgggttgt tagagaatct gaaatccaaa agcttcctaa caattttata 960

gaagaaacat ctgagaaagg tacggtagtg aattggtgtc ctcagttgga agttttgggt 1020

cataaatcaa ttggatgttt catcagtcat tgtggttgga attcaactct tgaagcattg 1080

agtttgggag ttccaatggt ggcaatgcca cagacttcag accaaccaac aaatgcaaaa 1140

tatgtggagg atgtgtggaa ggttgggaga agggtcagag tggatgaagg tcaaggaatt 1200

gccaaaaggg aagagatact actctctatt aatgaggtga tggagggaga aaagagtaga 1260

gaaattagag acaatctaag gaaatggaag gaattggcaa aacaagctat ggatgaacat 1320

ggaacttcca acaataacat taatgaattt gtagacaaac ttacccgcaa taaataa 1377