大豆eIF5A基因亚型、基因工程菌及应用的制作方法

本发明涉及分子生物学和基因工程领域，具体涉及大豆eIF5A基因亚型、重组基因工程菌及应用。

背景技术：

真核生物起始因子5A(eIF5A)对细胞的持续性增殖起着关键的作用。eIF5A是唯一一个被认知的细胞内含有翻译后修饰形成氨基酸衍生物hypusine[Nε-(4-氨基丁基－2－羟丁基)赖氨酸]的蛋白质。

eIF5A基因发现至今，一直受到广泛关注，包括动植物、人体内的eIF5A不断被克隆和分析。

eIF5A其功能而言，以蛋白质合成起始功能为基础，通过促进一些特异mRNA的转移及相关特异基因的表达来促进细胞的增值或者细胞的衰老、死亡，或者产生环境胁迫的应答和抵抗能力。

在很多植物种的研究过程中发现，eIF5A基因往往存在2-4个亚型不等，而初步研究证明其每种亚型在生物体内的功能都有所不同。所以，对每个物种体内的eIF5A基因所有异构体进行克隆和功能的进一步研究，并通过促进某些亚型的表达或者抑制某些亚型的表达，有可能获得产量提高或者对环境胁迫的抗性强化的品种，实现eIF5A基因在生产实际中的有效应用。

目前，国内外还未有关于大豆eIF5A基因克隆和功能研究方面的报道。所以，克隆大豆eIF5A基因，研究其功能，研究其基因工程菌的特点，了解其在大豆生长发育、抗逆等方面的作用，为实际育种工作中利用大豆eIF5A基因功能奠定一定的理论和实验基础。

技术实现要素：

针对上述内容和问题，本发明提供大豆eIF5A基因亚型、重组基因工程菌及应用。

本发明提供的大豆eIF5A基因亚型GmeIF5A1、2、3，它们分别被定位在A1、D2、D1b连锁群上，序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

本发明还分别提供产大豆eIF5A蛋白的含有上述GmeIF5A1、GmeIF5A2或GmeIF5A3的基因工程菌，所述基因工程菌分别过表达GmeIF5A1、2或3基因，基因工程菌采用的载体为pPIC3.5K，宿主为毕赤酵母GS115。所述基因亚型GmeIF5A1序列如SEQ ID NO.1所示,基因亚型GmeIF5A2序列如SEQ ID NO.2所示,基因亚型GmeIF5A3序列如SEQ ID NO.3所示。包含基因亚型GmeIF5A1的基因工程菌过表达GmeIF5A1，包含基因亚型GmeIF5A2的基因工程菌过表达GmeIF5A2，包含基因亚型GmeIF5A3的基因工程菌过表达GmeIF5A3。表达载体均为pPIC3.5K质粒，基因GmeIF5A1、GmeIF5A2或GmeIF5A3位于pPIC3.5K质粒上的EcoR I和Not I酶切位点之间，形成重组质粒pPIC3.5K－GmeIF5A1、2或3。宿主为毕赤酵母GS115。

上述基因工程菌的制备方法为：

1、利用Trizol法提取大豆总RNA。

2、反转录反应：采用反转录试剂盒对总RNA进行反转录，反应体系、步骤等按试剂盒说明。

3、酵母表达用GmeIF5A基因的克隆

1)PCR扩增：以步骤2所得大豆总RNA反转录产物cDNA为模板分别扩增GmeIF5A1、2或3的序列，引物序列如下：

GmeIF5A1引物：

5'引物(Y5-1)：TAGAATTCATGTCGGACGAAGAACACCATTT

EcoRI

3'引物(Y3-1)：TTTGCGGCCGCCTAGTTCTTTGGCCCAATAT

NotI

GmeIF5A2引物：

5'引物(Y5-2)：TAGAATTCATGTCAGACGAGGAGCACCACTT

EcoRI

3'引物(Y3-2)：TTTGCGGCCGCTTACTTGGGGCCAATGTCCT

NotIGmeIF5A3引物：

5'引物(Y5-3)：TAGAATTCATGTCGGACGAAGAGCACCATTT

EcoRI

3'引物(Y3-3)：TTGCGGCCGCCTAGTTCTTTGGCCCAATAT

NotI

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

PCR结束后分别电泳检测。

2)目的片段的回收：将PCR扩增得到的目的片段通过琼脂糖凝胶回收。

3)目的片段与T载体连接：将回收产物与pGEM-T载体连接，分别命名为pGEM-GmeIF5A1、2、3。连接体系及条件pGEM-T载体使用说明。

4)转化大肠杆菌XLI-Blue感受态：参见《分子克隆试验指南》(萨姆布鲁克等，2002)

5)质粒的提取：质粒提取试剂盒操作说明进行质粒提取。

6)pGEM-GmeIF5A质粒PCR鉴定：

反应体系如下：

PCR反应条件如下：

PCR结束后电泳检测。

7)pGEM-GmeIF5A质粒的EcoRI-NotI双酶切鉴定：

反应体系如下：

于37℃水浴中反应2h后，电泳观察酶切结果并测序。

4、酵母表达载体的构建，载体构建如图8所示。利用EcoR I、Not I双酶切pGEM-GmeIF5A1、2或3，得到GmeIF5A1、2或3基因片段，经0.8％琼脂糖凝胶电泳后回收。将其与同样经EcoR I、Not I酶切回收的表达载体pPIC3.5按照一定比例混合，加入T4DNA Ligase，16℃连接过夜。然后转化大肠杆菌XLI-Blue感受态，挑取转化子于LB液体培养基37℃，200rpm振荡培养过夜，提取质粒，并用EcoR I、Not I双酶切鉴定和PCR鉴定。

双酶切体系：

连接反应体系：

PCR鉴定反应体系：

PCR条件：

PCR结束后电泳检测。

5、制备毕赤酵母感受态细胞；

6、毕赤酵母的电击转化

1)将构建好的酵母表达载体pPIC3.5K-GmeIF5A用限制性内切酶SacI消化线性化，胶回收。酶切体系如下：

酶切后，线性化的质粒胶回收，置冰上备用。

2)将线性化pPIC3.5K-GmeIF5A DNA溶解在TE溶液中，与新鲜毕赤酵母GS115感受态菌体混匀，转至冰预冷的电转化杯中；

3)将电转化杯冰浴5min；

根据电转化仪提供的资料，选择酵母参数fungi-pulse，电击转化。

7、毕赤酵母GS115重组子的鉴定

电击完毕后，加入冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，菌体悬液涂布于MD平板上；将平板置于30℃培养，直至单菌落出现。待电击转化后菌落长到肉眼可见时，除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，用灭菌的牙签挑取菌落在PCR管中沾一下，PCR扩增(反应体系和循环、条件参照步骤4酵母表达载体的构建的PCR鉴定体系和循环、条件，但体系中不再加模板)。琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，将有特异扩增条带出现的克隆-80℃保存，备用，经诱导表达鉴定后确定GmeIF5A1、2或3在细胞内成功表达的克隆为GmeIF5A1、2或3的基因工程菌。

本发明还提供上述的基因亚型在促进细胞增殖和植物抗环境胁迫中的应用。

大豆GmeIF5A1、2、3在酵母中具有明显的促进酵母菌生长繁殖功能，本发明提供的基因工程菌菌体密度上升速度明显高于未转基因毕赤酵母GS115，生长繁殖能力强，衰老缓慢；本发明提供的基因工程菌大豆eIF5A蛋白含量高，可用于高产大豆eIF5A蛋白生产，GmeIF5A1、2、3基因在毕赤酵母GS115细胞中最终表达量达到了细胞内总可溶性蛋白的11.3％、10.5％、11.7％，相当于1.5-1.7g/L。大豆GmeIF5A1、2、3可以应用于促进细胞增殖和植物抗环境胁迫领域，增加细胞相应代谢产物产量或用于培育抗环境胁迫植物新品种。

附图说明

图1目的序列的正确性与新颖性验证；

图2 GmeIF5A1、2、3基因电子定位结果；

图3大豆绥农10号总RNA提取；

图4大豆总RNA反转录，M:DNAMarker DL2000，1:Oligo dT引物的反转录，2:Eandom引物的反转录；

图5酵母表达用GmeIF5A基因的PCR扩增结果(A为PCR扩增，M：DNA Marker DL2000

1：无模板对照，2：GmeIF5A1，3：GmeIF5A2，4：GmeIF5A3；B为PCR产物回收，M：DNA Marker DL2000，1：GmeIF5A1，2：GmeIF5A2，3：GmeIF5A3)；

图6 pGEM-GmeIF5A质粒PCR鉴定，M：DNA Marker DL2000，1-2：pGEM-GmeIF5A1，3-4：pGEM-GmeIF5A2，5-6：pGEM-GmeIF5A3，7：阴性对照；

图7 pGEM-GmeIF5A质粒EcoRI-NotI双酶切鉴定，M：DNA Marker DL2000，1：pGEM-GmeIF5A1，2：pGEM-GmeIF5A 2，3：pGEM-GmeIF5A 3；

图8 GmeIF5A酵母表达载体的构建示意图；

图9 GmeIF5A和pPIC3.5K质粒载体EcoRI-NotI双酶切回收，1：GmeIF5A1，2：GmeIF5A2，3：GmeIF5A3，4：pPIC3.5K，M：DL2000；

图10 pPIC3.5K-GmeIF5A PCR鉴定，M：DL2000，1：阳性对照，2：pPIC3.5K-GmeIF5A1，3：pPIC3.5K-GmeIF5A2，4：pPIC3.5K-GmeIF5A3，5：阴性对照；

图11 pPIC3.5K-GmeIF5A EcoRI-NotI双酶切鉴定，M：DL2000，1：pPIC3.5K-GmeIF5A1，2：pPIC3.5K-GmeIF5A2，3：pPIC3.5K-GmeIF5A3；

图12 pPIC3.5K-GmeIF5A质粒SacI单酶切线性化后回收结果(A为pPIC3.5K-GmeIF5A1胶回收结果，M：λ-HindIII，1：pPIC3.5K-GmeIF5A1；B为pPIC3.5K-GmeIF5A2胶回收结果，M：λ-HindIII，1：pPIC3.5K-GmeIF5A2；C为pPIC3.5K-GmeIF5A3胶回收结果，M：λ-HindIII，1：pPIC3.5K-GmeIF5A3)；

图13整合GmeIF5A基因的毕赤酵母GS115菌落PCR鉴定，M：DL2000，1：pPIC3.5K-GmeIF5A1质粒(阳性对照)，2：pPIC3.5K-GmeIF5A2质粒(阳性对照)，3-4：转化GmeIF5A1的GS115菌落，5-6：转化GmeIF5A2的GS115菌落，7：GmeIF5A3，8：阴性对照；

图14转化GmeIF5A基因和未转化的GS115酵母菌生长曲线；

图15转化GmeIF5A1基因的毕赤酵母GS115Western Blot检测，M：Western Blot Marker，1：未转基因毕赤酵母GS115(阴性对照)，2-3：转化GmeIF5A1基因的毕赤酵母GS115，4：原核表达纯化的GmeIF5A1蛋白质(阳性对照)；

图16转化GmeIF5A1基因的毕赤酵母GS115Western Blot检测，M：Western Blot Marker，1-3：转化GmeIF5A2基因的毕赤酵母GS115，4：原核表达纯化的GmeIF5A2蛋白质(阳性对照)，5：未转基因毕赤酵母GS115(阴性对照)；

图17酵母培养144h后(18小时后开始诱导)电镜观察(10000倍)结果，A：未转基因GS115；B：转GmeIF5A1的GS115；C：转GmeIF5A2的GS115；

图18植物表达载体pBI121-GmeIF5A的构建示意图；

图19 T0代转GmeIF5A1烟草再生植株抗盐检测；A：转化株系及对照株系在含有100mmol/L的NaCl MS培养基上的生长情况；B：转化株系及对照株系在含有150mmol/L的NaCl MS培养基上的生长情况；

图20 T0代转GmeIF5A1烟草再生植株抗旱检测；A：转化株系及对照株系在含有3.33mmol/L PEG6000的MS培养基上的生长情况；B：转化株系及对照株系在含有6.67mmol/L PEG6000的MS培养基上的生长情况。

具体实施方式

以下实施例中使用的培养基、缓冲液等如下：

毕赤酵母培养基

1)YEPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)培养基：

配好后，高压灭菌备用。

2)MD(Minimal Dextrase Medium)/MM培养基(1L)：800ml蒸馏水高压灭菌20min，冷却后加入100ml10×YNB，2ml 500×B，100ml 10×D(MM培养基加入5ml 10×M)。固体培养基需加入15g/L的琼脂。4℃保存。

3)BMMY/BMGY培养基(1L)：溶解10g酵母浸出物，20g蛋白胨于700ml水中，灭菌20min冷至室温，加入下列混合液：100ml 1M磷酸钾缓冲液pH6.0，100ml 10×YNB，2ml 500×B，100ml 10×GY。制BMMY时，加入100ml 10×M取代10×GY。

植物培养基

发芽培养基，1/8MS，0.8％琼脂，pH5.8。

分化培养基，MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，30g/L蔗糖+0.8％琼脂，pH5.8

筛选培养基，分化培养基+Km(100mg/ml)+Amp(100mg/ml)。

生根培养基，1/2MS，pH5.8，0.8％琼脂。

核酸电泳用液

1)50X TAE缓冲液的配方

2)琼脂糖胶的制作

将50×TAE溶液稀释成1X的TAE溶液。称取适量的琼脂糖放入三角瓶中，以1：100(w/v)的比例(1％琼脂糖胶)加入1×TAE溶液，锡纸封口，于微波炉中，中强火加热1.5-2分钟。稍凉后加入溴化乙锭充分摇匀，倒入制胶平板内(大板50ml，小板25ml)并插上加样梳。待冷却凝固后即可使用。

蛋白质电泳用液配制

1)5×电极缓冲液(1000ml)pH8.3

超纯水定容

2)下胶缓冲液(200ml)pH8.8

超纯水定容

3)上胶缓冲液(200ml)pH6.8

超纯水定容

4)30％丙烯酰(500ml)

超纯水定容

WATERMAN 1号滤纸过滤

5)考马斯亮蓝R－250染色液(100ml)

WATERMAN 1号滤纸过滤

6)脱色液(1000ml)

纯水定容

7)加样缓冲液pH6.8

8)凝胶配方

以下实施例中使用材料如下：

植物材料

大豆(Glycine max L.)绥农10号(东北农业大学大豆研究所提供)、烟草(Nicotiana tabacum L.cv)龙江911(东北农业大学生命科学学院遗传学教研室提供)。

菌种及质粒

pGEM-T载体(Promega公司)，pPIC3.5K质粒载体(东北农业大学大豆研究所保存)，大肠杆菌(Escherichia coli)菌种XLI-Blue(东北农业大学大豆研究所保存)，毕赤酵母(Pichia Pastoris)菌种GS115(东北农业大学大豆研究所保存)，农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌种LBA4404(东北农业大学大豆研究所保存)。

工具酶及生物化学试剂

限制性内切酶：NdeI、XhoI(大连宝生物)，EcoRI、NotI、HindIII(MBI)，XbaI、SacI、BglII(上海东洋纺)

LATaq酶(大连宝生物)，Taq酶(上海生工)，T4DNA连接酶(Promega)，溶菌酶(哈尔滨伊事达生物工程有限公司进口分装)

dNTPs(上海生工)，IPTG(哈尔滨伊事达生物工程有限公司进口分装)，卡那霉素(Kanamycin，Km)、利福平(Rifampicin，Rif)、链霉素(Streptomycin，Sm)、氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)(哈尔滨伊事达生物工程有限公司进口分装)，阿莫西林克拉维酸钾(Ac)(哈药集团制药总厂)

Sephadex DEAE-25A阴离子交换柱料(GE Healthcare)

反转录试剂盒购自哈尔滨海基生物科技有限公司，质粒提取试剂盒、核酸胶回收试剂盒均购自北京博大泰克公司，荧光定量试剂盒购自东洋坊(TOYABO,QPK-212)

Western Blot试剂购自哈尔滨海基生物科技有限公司。

其它试剂均为国产分析纯。

实施例1电子克隆，确定大豆eIF5A基因三个亚型序列并定位：

首先在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索其他物种已知eIF5a基因的cDNA和氨基酸序列：Cassava(AF266464)、Medicago sativa(AF416338)、Solanum lycopersicum(AF296083)、Hevea brasiliensis(AF516357)、Euphorbia esula(AF225297)、Senecio vernalis(AJ238624)、Tamarix androssowii(AY587771)等。

以上述基因序列为种子序列；以大豆EST序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST)共839 014条、大豆基因组序列(http://www.phytozome.net)为数据库文件，利用本地BLAST软件进行序列同源性比对，参数设置为：E≤1e-10、Score≥100；利用拼接软件CAP3(http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php)对所有匹配的EST序列进行聚类拼接，获得不同类的重叠群序列，即不同的contigs，用上述不同类的重叠群序列作为新一轮同源分析的种子序列重复上述步骤，直至各类重叠群序列不再延伸为止；利用NCBI中的在线分析工具ORFfinder进行各类序列的完整性分析，如果具有完整的ORF，则作为克隆的候选序列，如果不完整还需将其与大豆基因组序列进行同样的分析，找到相对应的基因组序列，以此序列为中心，上下各延伸15kb的基因组序列，并利用在线分析软件Genscan(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)进行外显子预测。获得相应的候选序列。

通过上述方法共获得3个不同的完整的候选基因序列，将这3个候选序列进行在线的BLAST分析，以验证目的序列的正确性与新颖性，结果如图1所示，结果表明与已知eIF5a基因序列有高度的同源性，且在大豆中未见报道，可根据此3个序列进行克隆。

电子克隆得到的GmeIF5A基因三个亚型序列如下：

GmeIF5A1：EU881359序列见SEQ ID NO.1，GmeIF5A2：EU881360序列见SEQ ID NO.2，GmeIF5A3：EU881361序列见SEQ ID NO.3。

根据大豆基因组和大豆遗传图谱，对所得到的基因序列进行定位，以便今后根据QTL的信息推测基因的功能。总共1015SSR标记和709RFLP标记被用于大豆遗传图谱的构建(Song et al,2004)本地运行Blastn程序，将上述3个序列与大豆全基因组数据库(http://www.phytozome.net)比对。分别下载大豆20个连锁群上标记的序列(Cregan et al，1999)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，与大豆全基因组数据库(http://www.phytozome.net)比对。利用Perl语言编写的脚本Blastm.pl将上述两个步骤的比对结果中得分最高的一项按照格式Query、Database、Position 3项提取出来，并输出到Excel中。利用Excel的排序功能按照主要关键词：Database，升序、次要关键词：Position，升序进行排序，根据每个序列邻近的标记将其定位在大豆的20个连锁群上。经过定位，GmeIF5A1、2、3，分别被定位在A1、D2、D1b连锁群上，如图2所示。

实施例2GmeIF5A基因在酵母中的表达：

1、提取大豆总RNA

大豆总RNA的提取：利用Trizol法从大豆绥农10号叶子中提取总RNA。取适量样品在液氮中研磨成粉,取50～100mg放入115mL的离心管中,加1mL Trizol液,室温放置5min,加入200μL氯仿,剧烈摇荡15s,后取上层水相于另一离心管中,加入500μL异丙醇,放置10min,12 000r/min 4℃离心10min。弃去上清,加入75％乙醇清洗,后室温或真空干燥5～10min,加入100μL ddH2O溶解,紫外分光光度计测定RNA样品OD260、OD280值，两个样品OD260/OD280比值分别为1.93和1.96，该比值接近2.0，说明RNA纯度较高，基本没有DNA和蛋白质的污染。两管RNA浓度分别为0.659μg/μL和0.701μg/μL。琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，其余-80℃保存备用，电泳结果如图3所示，由图可见，RNA中无DNA污染，且28S和18S条带较清晰，无明显弥散，表明RNA的纯度和完整性均较好，可以用于cDNA的合成。

2、反转录反应

采用海基公司反转录试剂盒对总RNA进行反转录，反应体系如下：

在PCR仪上按以下条件进行反转录反应：30℃，5min；42℃，30-40min；95℃，5min；

4℃结束，然后电泳检测反转录产物结果如图4所示，用Oligo dT做引物反转录的效果比随机片段引物反转录要好。所以反转录PCR将用Oligo dT反转录产物做模板。

3、酵母表达用GmeIF5A基因的克隆

1)PCR扩增：以步骤2所得大豆绥农10号Oligo dT反转录产物cDNA为模板扩增酵母表达GmeIF5A1、2和3的序列，引物序列如下：

GmeIF5A1引物：

5'引物(Y5-1)：TAGAATTCATGTCGGACGAAGAACACCATTT(SEQ ID NO.4)

EcoRI

3'引物(Y3-1)：TTTGCGGCCGCCTAGTTCTTTGGCCCAATAT(SEQ ID NO.5)

NotI

GmeIF5A2引物：

5'引物(Y5-2)：TAGAATTCATGTCAGACGAGGAGCACCACTT(SEQ ID NO.6)

EcoRI

3'引物(Y3-2)：TTTGCGGCCGCTTACTTGGGGCCAATGTCCT(SEQ ID NO.7)

NotI

GmeIF5A3引物：

5'引物(Y5-3)：TAGAATTCATGTCGGACGAAGAGCACCATTT(SEQ ID NO.8)

EcoRI

3'引物(Y3-3)：TTGCGGCCGCCTAGTTCTTTGGCCCAATAT(SEQ ID NO.9)

NotI

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

PCR结束后电泳检测。

2)目的片段的回收：将PCR扩增得到的目的片段通过琼脂糖凝胶回收，回收方法参照北京博大泰克公司DNA胶回收试剂盒的使用说明。结果如图5所示。

3)目的片段与T载体连接：将回收产物与pGEM-T载体连接，分别命名为pGEM-GmeIF5A1、2、3。连接体系及条件参照Promega公司pGEM-T载体使用说明。

4)转化大肠杆菌XLI-Blue感受态：参见《分子克隆试验指南》(萨姆布鲁克等，2002)

5)质粒的提取：博大泰克公司质粒小量快速提取试剂盒操作说明进行质粒提取。

6)pGEM-GmeIF5A质粒PCR鉴定：

反应体系如下：

PCR反应条件如下：

PCR结束后电泳检测。

7)pGEM-GmeIF5A质粒的EcoRI-NotI双酶切鉴定：

反应体系如下：

轻弹离心管以混匀反应液，并短暂离心使液体下沉，于37℃水浴中反应2h后，电泳观察酶切结果。

以上结果分别为图6、图7所示，证明GmeIF5A1、2、3酵母表达用基因已分别连接pGEM-T载体成功。

8)测序及序列分析

将酶切鉴定和PCR鉴定阳性的转化子质粒送交上海生工生物工程公司测序，测序结果显示，GmeIF5A1、2、3两个基因序列与原克隆序列完全一致，可以用于下一步酵母表达载体构建实验。序列正确的质粒保存备用。

4、酵母表达载体的构建(操作均按照Invitrogen公司Pichia Expression Kit相关操作方法进行)

载体构建如图8所示。利用EcoR I、Not I双酶切pGEM-GmeIF5A1、2、3，得到GmeIF5A1、2、3基因片段，经0.8％琼脂糖凝胶电泳后回收，结果如图9所示。将其与同样经EcoR I、Not I酶切回收的的表达载体pPIC3.5按照一定比例混合，加入T4DNA Ligase，16℃连接过夜。然后转化大肠杆菌XLI-Blue感受态，挑取转化子于LB液体培养基37℃，200rpm振荡培养过夜，提取质粒，并用EcoR I、Not I双酶切鉴定和PCR鉴定，结果如图10和图11所示，证明pPIC3.5K-GmeIF5A1、2、3均构建成功。

双酶切体系：

连接反应体系：

PCR鉴定反应体系：

PCR条件：

PCR结束后电泳检测。

5、毕赤酵母感受态的制备

1)挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250～300rpm培养过夜；

2)取100～500μl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28～30℃、250～300rpm培养过夜，至OD600达到1.3～1.5；

3)将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

4)按步骤3)条件离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

5)按步骤3)条件离心，用20ml的冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；

6)按步骤3)条件离心，用1ml的冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml。

制好的感受态最好马上用于电机转化，也可以分装80μl/管，于-70℃保存。但电转化的效果会有所下降。

6、毕赤酵母的电击转化

1)将构建好的酵母表达载体pPIC3.5K-GmeIF5A用限制性内切酶SacI消化线性化，胶回收纯化结果如图12所示。

酶切体系如下：

酶切后，线性化的质粒胶回收，置冰上备用。

2)将5～20μg的线性化pPIC3.5K-GmeIF5A DNA溶解在5～10μl TE溶液中，与80μl的新鲜毕赤酵母GS115感受态菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；

3)将电转化杯冰浴5min；

根据电转化仪提供的资料，选择酵母参数fungi-pulse，电击转化；

4)电击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的离心管中；

将菌体悬液涂布于MD平板上，每200～600μl涂布一块平板；

5)将平板置于30℃培养，直至单菌落出现。

7、毕赤酵母GS115重组子的鉴定

待电击转化后菌落长到肉眼可见时，除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，用灭菌的牙签挑取菌落在PCR管中沾一下，PCR扩增(反应体系和循环上述步骤4PCR鉴定条件)。琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，结果如图13，GmeIF5A1、2、3转化的酵母均得到了阳性克隆。将有特异扩增条带出现的克隆-80℃保存，备用。

8、重组GmeIF5A酵母的诱导表达

1)挑选一单菌落，置于装有25ml BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28～30℃，250～300rpm培养至OD600＝2～6(约16-18h)。

2)室温下1500～3000g离心5min，收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD600＝1.0左右(约100～200ml)；

3)将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布封口，30℃、250～300rpm继续生长；

每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0％；

按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5ml离心管中，最大转速离心2～3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点取：0、12、24、36、48、60、72、96、120和144h，分别测定其波长在600nm时的OD值，制作生长曲线。

结果如表1和图14所示。结果显示，转化GmeIF5A1、2、3基因的毕赤酵母GS115菌体密度上升速度明显高于未转基因毕赤酵母GS115，最终菌体密度达到了OD600 60左右。而未转基因毕赤酵母GS115对照OD600只长到30多个。由此可以断定，大豆GmeIF5A1、2、3在酵母中具有明显的促进生长繁殖功能。

表1转化GmeIF5A基因和未转化的GS115酵母菌生长速度测定表(OD600值)

9、诱导表达GmeIF5A的毕赤酵母GS115Western Blot检测

1)蛋白质电泳样品制备

(1)溶菌酶的配置(刘超等，2006)：将称取的0.03g的溶菌酶溶于0.5M pH6.8的Tris-Cl缓冲液中，混匀。4度保存。

(2)酵母样品的处理：取培养到最后的菌液1ml于EP管12000rpm 1min，弃上清，收集菌体。将得到的菌体震荡悬于600微升的超纯水中，然后每管加入1微升溶菌酶溶液，60度水浴4小时。将每管菌液摇匀，每管取70微升用作SDS-PAGE的蛋白样品制作。将70微升2X上样缓冲液加入每管，轻轻混匀后，沸水浴20min，瞬时离心离去细胞碎片，小心吸取上清用于SDS-PAGE。

2)Western Blot检测用材料：

①SDS-PAGE采用标准Tris-Glycine电泳系统，采用15％浓度进行，电泳条件150v电泳1-1.25小时。

②转膜采用100mA恒流转膜2小时，使用NC膜进行实验。

③Western杂交，均使用超敏快速western试剂盒(海基：M1901)

3)实验方法：

①转膜完毕后20ml 10％脱脂奶粉封闭20min，15ml PBST洗涤一次，5min；

②含5％脱脂奶粉的10ml WB buffer加入预处理的一抗反应90min，一抗比例1：1000；

③PBST洗涤一次，5min；

④含5％脱脂奶粉的10ml WB buffer加入羊抗兔HRP标记二抗反应25min，二抗比例1：10000；

⑤PBST洗涤3次，5min每次；

⑥2ml ECL进行曝光至胶片，曝光30s。

实验结果如图15和图16所示，结果显示所检测转GmeIF5A1的2个毕赤酵母克隆和转GmeIF5A2的3个毕赤酵母克隆均为阳性，表明GmeIF5A1、2蛋白在毕赤酵母细胞中表达成功。

10、诱导表达GmeIF5A后毕赤酵母GS115的扫描电镜观察及分析

扫描电镜样品制备方法：

1)取材：12000rpm，4℃离心2min收集菌体

2)固定：加入2.5％pH7.2的戊二醛固定并置于4度冰箱中固定1.5小时。

3)冲洗：用0.1M pH6.8磷酸缓冲液冲洗2次，每次10分钟。

4)脱水：分别用浓度为50％、70％、90％，进行脱水，每次10分钟；100％的乙醇脱水2次，每次10分钟。

5)置换：100％乙醇：叔丁醇＝1：1、纯叔丁醇各一次，每次10分钟，用ES-2030(HITACHI)型冷冻干燥仪对样品进行干燥。大约需4小时。

6)粘样：将样品观察面向上，用导电胶带粘在扫描电镜样品台上。

7)镀膜：用E-1010(HITACHI)型离子溅射镀膜仪在样品表面镀上一层15nm厚的金属膜(金或铂膜)。

最后扫描电镜上镜观察记录实验结果。

诱导表达GmeIF5A1、2、3基因的毕赤酵母和未转基因毕赤酵母GS115细胞(培养144小时候样品)扫描电镜观察结果如图17所示。对照未转基因毕赤酵母GS115细胞多为大而圆且表面塌陷的菌体，并有些细胞已破裂(图17A)，证明已经进入衰老期。而转有GmeIF5A1、2基因的GS115细胞(图17B和C)多为小而饱满或正在旺盛出芽繁殖的菌体，证明大多数菌体还处于生长旺盛期。由此说明GmeIF5A基因在酵母中可能有明显促进菌体繁殖和延缓菌体衰老的作用，这结果与上一步菌体生长量测定实验结果吻合。

实施例3：GmeIF5A1、2、3基因在毕赤酵母GS115细胞中最终表达量达到了细胞内总可溶性蛋白的11.3％、10.5％、11.7％，相当于1.5-1.7g/L。

实施例4 GmeIF5A基因在烟草中的表达及功能分析：

1、克隆烟草表达用GmeIF5A基因

1)PCR扩增：以大豆cDNA序列做模板扩增烟草表达GmeIF5A1和2的序列(由于GmeIF5A3和GmeIF5A1的蛋白质序列相同，所以只做GmeIF5A1和2)，引物序列如下：

GmeIF5A1引物：

5'引物(P5-1)：TATCTAGAATGTCGGACGAAGAACACCATTT

XbaI

3'引物(P3-1)：AGGAGCTCCTAGTTCTTTGGCCCAATAT

SacI

GmeIF5A2基因的PCR引物：

5'引物(P5-2)：TATCTAGAATGTCAGACGAGGAGCACCACTT

XbaI

3'引物(P3-2)：AGGAGCTCTTACTTGGGGCCAATGTCCT

SacI

PCR结束后电泳检测。

2)回收目的片段。3)目的片段与T载体连接。4)大肠杆菌感受态的制备及转化。5)质粒的提取。6)pGEM-GmeIF5A1、2质粒PCR鉴定、pGEM-GmeIF5A质粒的XbaI-SacI双酶切鉴定。8)测序及序列分析：将酶切鉴定和PCR鉴定阳性的转化子质粒送交上海生工生物工程公司测序，测序结果显示，GmeIF5A1、2两个基因序列与原克隆序列完全一致，可以用于下一步植物表达载体构建实验。

2、构建植物表达载体：载体构建如图18所示

pBI121-GmeIF5A质粒转化根癌农杆菌LBA4404

1)制备根癌农杆菌LBA4404感受态细胞

2)pBI121-GmeIF5A质粒冻融法转化根癌农杆菌LBA4404

农杆菌介导的烟草遗传转化及抗性植株再生

1)先将烟草叶盘(约200块/质粒)预培养2～3d，然后用含有相应植物表达载体的农杆菌LBA4404分别进行侵染。共培养3～4d后，将叶盘取出，在含有除菌剂的液体培养基中除菌30min，然后再转到分化培养基上进行筛选及分化培养，约3周左右开始分化出抗性芽。待抗性芽长至3～4cm高时，将其从外植体基部切下，接种到生根培养基上进行生根培养。

2)二次筛选

待幼苗根系发达后，高度达到约5-7cm时，取叶片，再次扣取叶盘接到分化培养基上，进行分化培养，2个平行试验，每棵幼苗是一个株系，对其进行编号。4周后统计分化结果，发现每个株系的2个平行之间的表现很一致，分化的各株系之间的表型也很一致，分化率均达到80％以上，在该过程中可以除掉一些假阳性及嵌合体株系。

转GmeIF5A基因在烟草生长速度明显比未转基因对照烟草植株快，转化植株略显细长。

GmeIF5A在烟草中生物学功能检测

抗盐试验

NaCl筛选将经二次筛选后得到的抗性苗接种到NaCl浓度为100mmol/L和150mmol/L的生根培养基上，20d后统计抗性率结果如表2和图19所示。

转GmeIF5A基因的烟草再生植株生长速度比对照(未转化烟草植株)快，植株状态略显细长。这可能是因为eIF5A基因的持续表达促进了烟草转基因再生植株的生长有关。其中表达GmeIF5A1的再生植株，有较强的抗盐能力，而表达GmeIF5A2的再生植株没有明显的抗盐能力，与对照未转化烟草植株差别不明显，照片只采用了转GmeIF5A1的再生植株结果。

表2GmeIF5A耐盐性能检测结果

抗旱试验

将高约3cm的转基因植株接种到含3.33mmol/L及6.67mmol/L PEG6000的生根培养基上，20d后统计抗性率。结果如表3和图20所示。

表3转GmeIF5A基因植株的抗旱检测

其中表达GmeIF5A1的再生植株，有较强的抗旱能力，而表达GmeIF5A2的再生植株没有明显的抗旱能力，与对照未转化烟草植株差别不明显，照片结果只采用了转GmeIF5A1的再生植株结果。