本发明涉及细胞分离
技术领域：
，尤其涉及一种肝星状细胞分离制备方法。
背景技术：
：肝星状细胞（hsc）位于肝原代细胞和肝窦内皮细胞之间。一般认为肝星状细胞的主要作用是储存营养物质，特别是维生素，若大量失去维生素a将导致星状细胞纤维化。正常情况下肝星状细胞处于静止状态，当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，肝星状细胞被激活，其表型由静止型转变为激活型。激活的肝星状细胞一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高，这两类变化最终奠定了肝纤维化、门静脉高压症发病的病理学基础。故肝星状细胞是研究肝纤维化的工具，被广泛应用于肝功能，肝疾理，病理，药理和其它相关研究。因此，如何分离制备高产量、高纯度、高存活率、形态完整、体外代谢活性高的肝星状细胞受到研究者的广泛关注。自1953年anderson创剪切法从肝脏分离肝细胞以来,各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进。在众多方法中,主要分为非灌流的方法和灌流的方法。其中，非灌流的方法以其简单易行的特点得到了一定的应用,但由于存在消化不完全、分离得到的肝细胞中多细胞团块存在的问题,不能满足许多基础研究或临床应用的要求。1969年，berry和friend引入了肝脏灌流法,灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触,不仅提高了分离效率,还使分离所得肝细胞的活力和数量大大提高。自从引入灌流法分离肝细胞以来,许多学者根据不同的应用条件对灌流法进行了改良。其中seglen经过一系列细致的研究,创立了改良的seglen两步灌流法,这一方法已成为应用至今的标准的原代肝细胞分离方法。两步灌流法主要是通过门静脉先后用含edta或egta缓冲液和胶原酶缓冲液进行灌注来分离肝细胞的方法。许多学者在具体操作中,不断改进两步灌流法的灌注条件,目的在于进一步减少分离过程中肝细胞的损伤,提高肝细胞的活率。肝星状细胞在肝组织细胞中密度最小，所以在两步灌流法的基础上最后用特定的密度液梯度离心出肝星状细胞。然而，肝脏是由实质细胞（肝原代细胞）和非实质细胞构成，其比例为3：2。肝脏的复杂性在于非实质细胞包括：星状细胞，窦内皮，胆管上皮和免疫细胞（淋巴细胞和粒细胞），而整个肝脏组是由60%实质细包和40%非实质细胞交错分布组成一个大的网络结构，单一酶解达不到很好的效果，加上常用缓冲体系诸如d-hank’s液、hank’s液对酶解作用的限制，使得分离效果相对较差，因此，有必要对现有技术中的肝星状细胞分离制备方法进行改进。技术实现要素：本发明为克服上述现有技术所述的至少一种不足，提供一种肝星状细胞分离制备方法，分离制备高产量、高纯度、高存活率、形态完整、体外代谢活性高的肝星状细胞。为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案予以实现：一种肝星状细胞分离制备方法，通过灌注、剥离、密度梯度分离得到肝星状细胞，灌注过程中先后用灌注液i、灌注液ii、灌注液iii进行灌注；其中，所述灌注液i包括缓冲液i；所述灌注液ii由每毫升缓冲液ii加入0.22~0.38mg链霉蛋白酶e构成；所述灌注液iii由每毫升缓冲液ii加入0.52~0.68mg胶原酶d构成；所述缓冲液i每升包括下述重量份的各组分：nacl7000~9000mg，kcl350~450mg，nah2po4·h2o80~100mg，na2hpo4100~140mg，hepes2200~2600mg，nahco3300~400mg，egta150~250mg，glucose800~1000mg，其余为h2o；所述缓冲液ii每升包括下述重量份的各组分：nacl7000~9000mg，kcl350~450mg，nah2po4·h2o80~100mg，na2hpo4100~140mg，hepes2200~2600mg，nahco3300~400mg，cacl2·2h2o500~620mg，其余为h2o。hepes：4-羟乙基哌嗪乙磺酸；egta：乙二醇二乙醚二胺四乙酸；glucose：葡萄糖。本发明根据不同肝细胞的表面特性，先后使用链霉蛋白酶e和胶原酶d进行灌注，解决分离肝星状细胞中血液干扰和组织特异性问题，得到高存活率、高纯度的肝星状细胞。肝脏是由肝细胞组成，并有丰富的血管网，呈红褐色，质软而脆，易受暴力打击而破裂，导致传统机械法分离肝星状细胞得率和存活率十分低下而极少人使用。一般酶解法由于血管网丰富而导致酶的合力低下，另外，肝脏组织中各类细胞交错分布，单一酶解达不到很好的效果。链霉蛋白酶e和胶原酶d的分别作用使得结构复杂、每种细胞表面生长基质不同的肝脏能够被充分酶解而得到单个细胞，而且该过程不会破坏周围的血管网，使得酶解得到的肝星状细胞具有较高存活率和较高得率。同时，链霉蛋白酶e和胶原酶d分别灌注，使得两种酶的酶解作用不会相互干扰，分离效果更佳。另外，本发明采用特殊的缓冲体系即缓冲液ii为酶解过程提供了良好的环境，促进酶解的进行，提高分离效率和改善分离效果，glucose为细胞生活提供了必要能量来源，为分离过程赢得时间，提高分离得到的单细胞的存活率。进一步地，所述灌注液ii由每毫升缓冲液ii加入0.3mg链霉蛋白酶e构成；所述灌注液iii由每毫升缓冲液ii加入0.6mg胶原酶d构成；剥离过程中，将经灌注处理后的肝脏置于平衡溶液中漂洗并剪碎，然后在37℃温度下于解离液中孵育20min，过滤离心，弃上清，用含145~155ul脱氧核糖核酸酶i的8~12ml平衡溶液重悬细胞。其中，所述平衡溶液包括缓冲液iii；所述解离液由每毫升缓冲液ii加入0.45~0.55mg链霉蛋白酶e、0.45~0.55mg胶原酶d和0.015~0.025mg脱氧核糖核酸酶构成；所述缓冲液iii每升包括下述重量份的各组分：kcl320~420mg，mgcl2·6h2o170~250mg，mgso4·7h2o60~80mg，na2hpo450~70mg，kh2po425~35mg，glucose890~1100mg，nahco3190~270mg，cacl2·2h2o185~265mg，其余为h2o。本发明将经过灌注的肝脏摘除剪碎后进一步采用复合酶配以缓冲体系缓冲液iii使肝细胞得到进一步分离，并在37℃温度下进行孵育，改善分离效果。进一步地，所述解离液由每毫升缓冲液ii加入0.5mg链霉蛋白酶e、0.5mg胶原酶d和0.02mg脱氧核糖核酸酶构成；密度梯度分离过程中，将经灌注、剥离处理得到的细胞悬液先后加入平衡溶液和离心液a，混匀后移入预先加入离心液b的离心管中，再加入平衡溶液，离心，回收肝星状细胞。其中，所述平衡溶液包括缓冲液iii；所述离心液a由每毫升缓冲液iii加入0.15~0.25g密度梯度分离试剂构成；所述离心液b由每毫升缓冲液iii加入0.08~0.12g密度梯度分离试剂构成；所述缓冲液iii每升包括下述重量份的各组分：kcl320~420mg，mgcl2·6h2o170~250mg，mgso4·7h2o60~80mg，na2hpo450~70mg，kh2po425~35mg，glucose890~1100mg，nahco3190~270mg，cacl2·2h2o185~265mg，其余为h2o。密度梯度分离试剂采用nycodenz粉剂。本发明采用特殊的缓冲体系缓冲液iii配合密度梯度分离液得到特殊的密度梯度分离体系，该体系拥有与肝星状细胞密度一致的密度层，能够将肝星状细充分富集，提高肝星状细胞的得率。进一步地，所述离心液a由每毫升缓冲液iii加入0.2g密度梯度分离试剂构成；所述离心液b由每毫升缓冲液iii加入0.1g密度梯度分离试剂构成。进一步地，所述缓冲液i每升包括下述重量份的各组分：nacl7500~8500mg，kcl380~420mg，nah2po4·h2o85~95mg，na2hpo4110~130mg，hepes2300~2500mg，nahco3320~380mg，egta170~220mg，glucose850~950mg，其余为h2o；所述缓冲液ii每升包括下述重量份的各组分：nacl7500~8500mg，kcl380~420mg，nah2po4·h2o85~95mg，na2hpo4110~130mg，hepes2300~2500mg，nahco3320~380mg，cacl2·2h2o520~600mg，其余为h2o。所述缓冲液iii每升包括下述重量份的各组分：kcl345~395mg，mgcl2·6h2o190~230mg，mgso4·7h2o65~75mg，na2hpo455~65mg，kh2po427.5~32.5mg，glucose940~1050mg，nahco3210~250mg，cacl2·2h2o205~245mg，其余为h2o。更进一步地，所述缓冲液i每升包括下述重量份的各组分：nacl8000mg，kcl400mg，nah2po4·h2o88.17mg，na2hpo4120.45mg，hepes2380mg，nahco3350mg，egta190mg，glucose900mg，其余为h2o；所述缓冲液ii每升包括下述重量份的各组分：nacl8000mg，kcl400mg，nah2po4·h2o88.17mg，na2hpo4120.45mg，hepes2380mg，nahco3350mg，cacl2·2h2o560mg，其余为h2o。所述缓冲液iii每升包括下述重量份的各组分：kcl370mg，mgcl2·6h2o210mg，mgso4·7h2o70mg，na2hpo459.6mg，kh2po430mg，glucose991mg，nahco3227mg，cacl2·2h2o225mg，其余为h2o。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的肝星状细胞分离制备方法能够有效分离肝星状细胞，先后采用链霉蛋白酶e和胶原酶d的单独作用、剪碎后再用复合酶共同作用使得每种细胞的不同表面生长基质都能够得到充分的酶解，从而得到单个的细胞悬液。特殊缓冲体系缓冲液ii的配合为酶的酶解作用提供了适宜的环境，使得酶解更为完全，从而提高分离肝星状细胞的得率。特殊的缓冲体系缓冲液iii配合nycodenz得到特殊的密度梯度分离体系，该体系拥有与肝星状细胞密度一致的密度层，能够将肝星状细充分富集，提高肝星状细胞的得率。具体实施方式为了让本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。选取65只大小相近、种类相同、肝脏大小约为1~2g的健康小鼠作为实验对象，将65只健康小鼠随机分为13个试验组，试验组1采用实施例1进行试验，试验组2采用实施例2进行试验，以此类推。实施例1本实施例的肝星状细胞分离制备方法，包括如下步骤：一、配制实验试剂灌注液i：取缓冲液i；灌注液ii：取缓冲液ii，每毫升缓冲液ii加入0.3mg链霉蛋白酶e；灌注液iii：取缓冲液ii，每毫升缓冲液ii加入0.6mg胶原酶d；平衡溶液：取缓冲液iii；解离液：取缓冲液ii，每毫升缓冲液ii加入0.5mg链霉蛋白酶e、0.5mg胶原酶d和0.02mg脱氧核糖核酸酶；离心液a：取缓冲液iii，每毫升缓冲液iii加入0.2gnycodenz密度梯度分离试剂；离心液b：取缓冲液iii，每毫升缓冲液iii加入0.1gnycodenz密度梯度分离试剂。其中，缓冲液i每升包括下述重量份的各组分：nacl8000mg，kcl400mg，nah2po4·h2o88.17mg，na2hpo4120.45mg，hepes2380mg，nahco3350mg，egta190mg，glucose900mg，其余为h2o；缓冲液ii每升包括下述重量份的各组分：nacl8000mg，kcl400mg，nah2po4·h2o88.17mg，na2hpo4120.45mg，hepes2380mg，nahco3350mg，cacl2·2h2o560mg，其余为h2o；所述缓冲液iii每升包括下述重量份的各组分：kcl370mg，mgcl2·6h2o210mg，mgso4·7h2o70mg，na2hpo459.6mg，kh2po430mg，glucose991mg，nahco3227mg，cacl2·2h2o225mg，其余为h2o。二、分离制备肝星状细胞s1.灌注：用25g留置针插入下腔静脉，灌注开始后结扎肝动脉，剪断肝门静脉，由肝门静脉以5ml/min的速度用灌注液i灌注5min、再以5ml/min的速度用灌注液ii灌注5min、最后以5ml/min的速度用灌注液iii灌注5min。；s2.剥离：将步骤s1处理后的肝脏置于20ml平衡溶液中漂洗并剪碎，均分至2个50ml离心管中，补加预热的解离液至50ml，在37℃温度下孵育20min得到单细胞悬液，将单细胞悬液用70ul的无菌筛过滤后，在4℃下以500rpm离心1min，弃上清，用含150ul脱氧核糖核酸酶i的10ml平衡溶液重悬细胞的细胞悬液；s3.分离：将步骤s2得到的细胞悬液补加平衡溶液至36ml，再加入14ml离心液a，混匀后平均分至4个预先加入4ml离心液b的15ml离心管中，最后加入1.5ml平衡溶液，在4℃下以300rpm离心20min，回收浑浊带即得肝星状细胞。实施例2本实施例除了缓冲液i、缓冲液ii、缓冲液iii各组分的重量份组成不同外，其他同实施例1。所述缓冲液i每升包括下述重量份的各组分：nacl7500mg，kcl380mg，nah2po4·h2o85mg，na2hpo4110mg，hepes2300mg，nahco3320mg，egta170mg，glucose850mg，其余为h2o；所述缓冲液ii每升包括下述重量份的各组分：nacl7500mg，kcl380mg，nah2po4·h2o85mg，na2hpo4110mg，hepes2300mg，nahco3320mg，cacl2·2h2o520mg，其余为h2o。所述缓冲液iii每升包括下述重量份的各组分：kcl345mg，mgcl2·6h2o190mg，mgso4·7h2o65mg，na2hpo455mg，kh2po427.5mg，glucose940mg，nahco3210mg，cacl2·2h2o205mg，其余为h2o。实施例3本实施例除了缓冲液i、缓冲液ii、缓冲液iii各组分的重量份组成不同外，其他同实施例1。所述缓冲液i每升包括下述重量份的各组分：nacl8500mg，kcl420mg，nah2po4·h2o95mg，na2hpo4130mg，hepes2500mg，nahco3380mg，egta220mg，glucose950mg，其余为h2o；所述缓冲液ii每升包括下述重量份的各组分：nacl8500mg，kcl420mg，nah2po4·h2o95mg，na2hpo4130mg，hepes2500mg，nahco3380mg，cacl2·2h2o600mg，其余为h2o。所述缓冲液iii每升包括下述重量份的各组分：kcl395mg，mgcl2·6h2o230mg，mgso4·7h2o75mg，na2hpo465mg，kh2po432.5mg，glucose1050mg，nahco3250mg，cacl2·2h2o245mg，其余为h2o。实施例4本实施例除了缓冲液i、缓冲液ii、缓冲液iii各组分的重量份组成不同外，其他同实施例1。所述缓冲液i每升包括下述重量份的各组分：nacl7000mg，kcl350mg，nah2po4·h2o80mg，na2hpo4100mg，hepes2200mg，300mg，egta150mg，glucose800mg，其余为h2o；所述缓冲液ii每升包括下述重量份的各组分：nacl7000mg，kcl350mg，nah2po4·h2o80mg，na2hpo4100mg，hepes2200mg，nahco3300mg，cacl2·2h2o500mg，其余为h2o。所述缓冲液iii每升包括下述重量份的各组分：kcl320~420mg，mgcl2·6h2o170mg，mgso4·7h2o60mg，na2hpo450mg，kh2po425mg，glucose890mg，nahco3190mg，cacl2·2h2o185mg，其余为h2o。实施例5本实施例除了缓冲液i、缓冲液ii、缓冲液iii各组分的重量份组成不同外，其他同实施例1。所述缓冲液i每升包括下述重量份的各组分：nacl9000mg，kcl450mg，nah2po4·h2o100mg，na2hpo4140mg，hepes2600mg，nahco3400mg，egta250mg，glucose1000mg，其余为h2o；所述缓冲液ii每升包括下述重量份的各组分：nacl9000mg，kcl450mg，nah2po4·h2o100mg，na2hpo4140mg，hepes2600mg，nahco3400mg，cacl2·2h2o620mg，其余为h2o。所述缓冲液iii每升包括下述重量份的各组分：kcl420mg，mgcl2·6h2o250mg，mgso4·7h2o80mg，na2hpo470mg，kh2po435mg，glucose1100mg，nahco3270mg，cacl2·2h2o265mg，其余为h2o。实施例6本实施例与实施例1除了灌注液ii和灌注液iii各组分重量份组成不同外，其他同实施例1。灌注液ii：取缓冲液ii，每毫升缓冲液ii加入0.22mg链霉蛋白酶e；灌注液iii：取缓冲液ii，每毫升缓冲液ii加入0.52mg胶原酶d；实施例7本实施例与实施例1除了灌注液ii和灌注液iii各组分重量份组成不同外，其他同实施例1。灌注液ii：取缓冲液ii，每毫升缓冲液ii加入0.38mg链霉蛋白酶e；灌注液iii：取缓冲液ii，每毫升缓冲液ii加入0.68mg胶原酶d；实施例8本实施例与实施例1除了解离液各组分重量份组成不同外，其他同实施例1。取缓冲液ii，每毫升缓冲液ii加入0.45mg链霉蛋白酶e、0.45mg胶原酶d和0.015mg脱氧核糖核酸酶；实施例9本实施例与实施例1除了解离液各组分重量份组成不同外，其他同实施例1。取缓冲液ii，每毫升缓冲液ii加入0.55mg链霉蛋白酶e、0.55mg胶原酶d和0.025mg脱氧核糖核酸酶；实施例10本实施例与实施例1除了离心液a和离心液b各组分重量份组成不同外，其他同实施例1。离心液a：取缓冲液iii，每毫升缓冲液iii加入0.15gnycodenz密度梯度分离试剂；离心液b：取缓冲液iii，每毫升缓冲液iii加入0.08gnycodenz密度梯度分离试剂。实施例11本实施例与实施例1除了离心液a和离心液b各组分重量份组成不同外，其他同实施例1。离心液a：取缓冲液iii，每毫升缓冲液iii加入0.25gnycodenz密度梯度分离试剂；离心液b：取缓冲液iii，每毫升缓冲液iii加入0.12gnycodenz密度梯度分离试剂。实施例12本实施例与实施例1除了分离制备肝星状细胞步骤不同外，其他同实施例1。s1.灌注：用25g留置针插入下腔静脉，灌注开始后结扎肝动脉，剪断肝门静脉，由肝门静脉以5ml/min的速度用灌注液i灌注5min、再以5ml/min的速度用灌注液ii灌注5min、最后以5ml/min的速度用灌注液iii灌注5min。；s2.剥离：将步骤s1处理后的肝脏置于20ml平衡溶液中漂洗并剪碎，均分至2个50ml离心管中，补加预热的解离液至50ml，在37℃温度下孵育20min得到单细胞悬液，将单细胞悬液用70ul的无菌筛过滤后，在4℃下以500rpm离心1min，弃上清，用含145ul脱氧核糖核酸酶i的8ml平衡溶液重悬细胞的细胞悬液；s3.分离：将步骤s2得到的细胞悬液补加平衡溶液至36ml，再加入14ml离心液a，混匀后平均分至4个预先加入4ml离心液b的15ml离心管中，最后加入1.5ml平衡溶液，在4℃下以300rpm离心20min，回收浑浊带即得肝星状细胞。实施例13本实施例与实施例1除了分离制备肝星状细胞步骤不同外，其他同实施例1。s1.灌注：用25g留置针插入下腔静脉，灌注开始后结扎肝动脉，剪断肝门静脉，由肝门静脉以5ml/min的速度用灌注液i灌注5min、再以5ml/min的速度用灌注液ii灌注5min、最后以5ml/min的速度用灌注液iii灌注5min。；s2.剥离：将步骤s1处理后的肝脏置于20ml平衡溶液中漂洗并剪碎，均分至2个50ml离心管中，补加预热的解离液至50ml，在37℃温度下孵育20min得到单细胞悬液，将单细胞悬液用70ul的无菌筛过滤后，在4℃下以500rpm离心1min，弃上清，用含155ul脱氧核糖核酸酶i的12ml平衡溶液重悬细胞的细胞悬液；s3.分离：将步骤s2得到的细胞悬液补加平衡溶液至36ml，再加入14ml离心液a，混匀后平均分至4个预先加入4ml离心液b的15ml离心管中，最后加入1.5ml平衡溶液，在4℃下以300rpm离心20min，回收浑浊带即得肝星状细胞。实验结果：项目细胞得率（%）细胞存活率（%）细胞纯度（%）试验组191%96%95%试验组288%90%88%试验组385%86%89%试验组483%88%80%试验组580%85%82%试验组682%80%83%试验组783%84%85%试验组882%88%83%试验组985%85%82%试验组1082%83%81%试验组1188%89%85%试验组1283%85%91%试验组1388%81%86%由以上检测数据可以看出，采用本发明的肝星状细胞分离制备方法制备肝星状细胞具有较高的细胞得率、细胞存活率、细胞纯度，其中，采用实施例1所述制备方法制备肝星状细胞的细胞得率、细胞存活率、细胞纯度均达到90%以上，其细胞存活率及细胞纯度均达到95%以上，具有明显的优越性。当前第1页12