本发明涉及一种蝉花人工培养过程中固体培养基的循环利用方法，属于食用菌栽培技术领域。
背景技术：
中药蝉花为蝉棒束孢isariacicadaemiquel(蝉拟青霉paecilomycescicadae(miquel)samson)寄生在蝉若虫上并利用寄主的营养形成的内菌核及子实体，是我国传统著名的中药材之一，其药用历史比冬虫夏草早800年。蝉花属药食兼用真菌，具有较高的营养价值和特定的功效。蝉花可产生多种在医疗和保健上有重要作用的生理活性物质，包括核苷类、环肽类、多糖类、醇类、甾醇类及有机酸等，在调节免疫、改善肾功能、调节脂类代谢、抗肿瘤、抗疲劳、镇痛、催眠、降压降血糖等方面作用明显。
天然蝉花资源十分有限，而且野生蝉花因为产地不同、采收时间不一、易被杂菌污染霉变及含重金属等问题，其品质得不到保障。然而，蝉花目前已经实现了人工培养，且保证了无污染不含重金属，因此，受到了人们的普遍关注。
人工培育蝉花，主要是通过固体发酵的原理，利用谷物作为培养基。将蝉棒束孢通过斜面种子接种到摇瓶、发酵罐扩大培养，经固体发酵形成若花状分叉多枝的孢梗束子实体，经采收干燥即可作食药用原料。而采收后的菌质(固体培养基)经除湿、菌丝分离后，剩余的小麦粒含水量大，如果处理不及时，会产生污染，造成浪费。而除湿烘干后的小麦粒目前没有较好的用处，且烘干会产生大量能耗。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种蝉花人工培养过程中固体培养基循环利用的方法，采用本发明方法同一批固体培养基可重复利用两次，利用循环处理的培养基培养得到蝉花孢子粉与普通工艺培养的孢子粉质量无明显差别，该方法既达到谷物培养基有效利用的目的，同时又减少了大量能耗。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种蝉花人工培养过程中固体培养基循环利用的方法，该方法以采收孢子粉后的固体培养基为原料，经过处理后得到的固体培养基继续用于蝉花的固体培养过程，具体包括如下步骤：
步骤1，对采收孢子粉后的固体培养基进行除湿；
步骤2，将除湿后的固体培养基与菌丝分离；
步骤3，将除去菌丝的固体培养基与水混合，灭菌，即得。
其中，步骤1所述“除湿”以去除固体培养基中的水分为目的，除湿方法包括采用除湿机除湿、阴干、晒干、烘干等方法。优选除湿机除湿。
进一步，除湿温度在30℃以下，更优选为25-30℃。
进一步，除湿后固体培养基湿度为75％-85％。
进一步，步骤3固体培养基与水混合的比例为1:(0.5～1)；优选为1:0.5。
其中，所述固体培养基为蝉花培养过程中常规的固体培养基，如谷物培养基，可选自小麦、玉米、大米、小米、黄豆粉、荞麦、大麦、燕麦、糙米、粳米中的任意一种或几种；农作物秸杆培养基，如麦秆、玉米杆、棉杆、豆杆、芝麻杆中的任意一种或几种；农作物皮壳培养基，如麸皮、大豆皮、棉籽壳等。
进一步，所述固体培养基为小麦培养基。
本发明的有益效果：本发明实现了对固体培养基的循环利用，采用本发明方法，同一批固体培养基可重复利用两次，利用循环处理的培养基培养得到蝉花孢子粉与普通工艺培养的孢子粉质量无明显差别，该方法既达到谷物培养基有效利用的目的，同时又减少了大量能耗。
具体实施方式
以下实施例1中所用蝉花菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号cgmccno3453(该菌种已在申请号为201110120603.1的发明专利中公开，为已知菌种)。本发明研究表明蝉花菌种类型并不构成影响本发明效果的因素，本发明干燥方法对不同蝉花菌种均能够实现效果。
实施例1蝉花的扩大培养
1.1斜面培养：将菌种接种于斜面试管中，再将接种菌种的斜面试管放入22℃培养箱，培养时间为7天，待菌丝长满试管；
1.2摇瓶培养：在500m1三角瓶中装入200m1液体培养基，在0.11mpa压力下高压灭菌30分钟，待冷却至室温，将1支斜面试管的菌种接种到500m1三角瓶培养基上，并置于恒温振荡培养箱，温度22±1℃，150转/分钟条件下培养，培养时间为3天；
1.3种子罐培养：在50l气升式发酵罐中装入20l液体培养基，培养基温度大于95℃，加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0.03％,在0.11mpa压力下，通入蒸汽加热到121℃，并保压30-45分钟；灭菌后，冷却至20℃时，将4瓶上述培养好的500m1摇瓶菌种接入培养基，培养温度为22±1℃，通气量为1：0.5v/vmin，保压4.903-7.0845×104pa，经3天通气培养，达到对数生长期后即可，终培养体积为20l。
1.4发酵罐培养：在500l气升式发酵罐中装入200l液体培养基，培养基温度大于95℃，加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0.03％,在0.11mpa压力下，通入蒸汽加热到121℃，并保压30-45分钟；灭菌后，冷却至20℃时，将上述培养好的200l种子罐种子全部接入培养，培养温度为22±1℃，通气量为1：0.5v/vmin，保压4.903-7.0845×104pa，经3天通气培养，达到对数生长期后即可。终培养体积为200l。
斜面试管培养基：每1升液体含有200克土豆煮汁，20克蔗糖，20克琼脂，余补水至1000毫升，ph值为6.5；
摇瓶、种子罐及发酵罐中的液体培养基：含有酵母浸出粉1％，复合氨基酸0.5％，白砂糖3.5％，余量补水至100％，ph值为6.5。
实施例2固体培养
将实施例1扩大培养的菌种按每个培养容器10％的接种量接种固体培养中，接种后的容器放入培养室培养。
培养条件：培养室温度为24-25℃，空气相对湿度50-60％；光照强度100lx～200lx；接种后定期检查，及时剔除生长势差、感染杂菌的培养容器。培养室要适时通风换气，保持发菌室空气新鲜。
固体培养基：小麦和水按1:1混合。
采收及处理：当培养基表面长满厚厚一层孢子粉时(15-20天)，及时采收孢子粉(编号1)。
实施例3固体培养
将实施例2采收孢子粉后的小麦培养基采用除湿机除湿，除湿温度30℃，除湿后培养基湿度达到80％；分离出菌丝体；再按照1:0.5的比例向小麦培养基中加入水，灭菌。在该培养基上接种实施例1扩大培养的菌种，按实施例2的培养方法进行固体培养并采收孢子粉(编号2)。
实施例4固体培养
将实施例2采收孢子粉后的小麦培养基采用除湿机除湿，除湿温度40℃；除湿后培养基湿度达到80％；分离出菌丝体；再按照1:0.5的比例向小麦培养基中加入水，灭菌。在该培养基上接种实施例1扩大培养的菌种，按实施例2的培养方法进行固体培养并采收孢子粉(编号3)。
实施例5固体培养
将实施例2采收孢子粉后的小麦培养基采用除湿机除湿，除湿温度50℃；除湿后培养基湿度达到80％；分离出菌丝体；再按照1:0.5的比例向小麦培养基中加入水，灭菌。在该培养基上接种实施例1扩大培养的菌种，按实施例2的培养方法进行固体培养并采收孢子粉(编号4)。
实施例6固体培养
将实施例2采收孢子粉后的小麦培养基采用除湿机除湿，除湿温度55℃；除湿后培养基湿度达到80％；分离出菌丝体；再按照1:0.5的比例向小麦培养基中加入水，灭菌。在该培养基上接种实施例1扩大培养的菌种，按实施例2的培养方法进行固体培养并采收孢子粉(编号5)。
实施例7固体培养
将实施例2采收孢子粉后的小麦培养基，置于阴凉处阴干，阴干温度30℃；阴干后培养基湿度达到80％；分离出菌丝体；再按照1:0.5的比例向小麦培养基中加入水，灭菌。在该培养基上接种实施例1扩大培养的菌种，按实施例2的培养方法进行固体培养并采收孢子粉(编号6)。
实施例8固体培养
将实施例2采收孢子粉后的小麦培养基，置于日光下晒干，温度30℃；晒干后培养基湿度达到80％；分离出菌丝体；再按照1:0.5的比例向小麦培养基中加入水，灭菌。在该培养基上接种实施例1扩大培养的菌种，按实施例2的培养方法进行固体培养并采收孢子粉(编号7)。
测定实施例2-8采收的孢子粉(编号1-7)中hea、甘露醇和多糖含量
1腺苷和n6-(2-羟乙基)腺苷(hea)的测定采用高效液相色谱法：
色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：symmetryc18(waters，4.6mm×250mm，5μm，l.n.0264313291)；流动相：乙腈-0.04mol/l磷酸二氢钾(5:95)；流速：1.0ml/min；检测波长：260nm；柱温：35℃；进样量：10μl。理论塔板数按腺苷峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备：取腺苷及hea对照品适量，精密称定，加50％甲醇水溶液制成25μg/ml的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取0.2g蝉花孢子粉，精密称定，置20ml具塞试管，精密加入5ml蒸馏水，超声(40khz)处理30分钟，取出，立即精密加入5ml甲醇，混匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，进样时间为20min，测定，在此波长下记录对照品及供试品对应的峰面积，根据浓度换算结果进行计算，即得。
2甘露醇的测定采用紫外-可见分光光度法：
样品提取液的制备：精密称取0.1g蝉花孢子粉，加入100ml70％乙醇水溶液，85-90℃水浴回流提取，溶液沸腾5min后，取出，过滤，取滤液，待滤液冷却至室温，用70％乙醇水溶液定容至100ml，摇匀，即为待测样品溶液。
样品甘露醇含量测定：精密移取样品提取液1ml，置15ml具塞试管中，精密加入1ml高碘酸钾溶液，混匀，室温放置10min，再加0.1％l-鼠李糖溶液2ml以除去过多的高碘酸盐，振荡混匀，最后加4ml新鲜配制的nash试剂，53℃水浴加热15min使其显色，快速冷却至室温。照紫外-可见分光光度法(中华人民共和国药典一部附录va)，在412nm波长处测定吸光值，带入标准曲线，求出样品甘露醇浓度(mg/ml)，再根据公式计算样品甘露醇含量(mg/g)。
3多糖的测定按照《保健食品功效成分检测方法》(白鸿主编)的方法测定
测定结果见表1。
表1不同培养基培养得到的孢子粉成分含量测定
表1结果可以看出，编号2的孢子粉(即由实施例3的固体培养基培养得到的孢子粉)质量与编号1的孢子粉质量无显著差别。其他方法得到的培养基培养得到的孢子粉产量明显下降。可见，除湿温度不宜超过30℃，如果超过30℃，一则影响孢子粉中有效成分含量，另一方面，温度偏高，微生物繁殖速度快，不利于灭菌彻底性，导致培养基容易腐烂。因此，优选除湿机进行除湿，除湿温度不能高于30℃。
实施例9固体培养
将实施例1扩大培养的菌种按每个培养容器10％的接种量接种固体培养中，接种后的容器放入培养室培养。
培养条件：培养室温度为24-25℃，空气相对湿度50-60％；光照强度100lx～200lx；接种后定期检查，及时剔除生长势差、感染杂菌的培养容器。培养室要适时通风换气，保持发菌室空气新鲜。
固体培养基：大麦和水按1：1的比例混合。
采收及处理：当培养基表面长满厚厚一层孢子粉时(15-20天)，及时采收孢子粉(编号8)。
实施例10固体培养
将实施例9采收孢子粉后的大麦培养基采用除湿机除湿，除湿温度30℃；除湿后培养基湿度达到80％；分离出菌丝体；再按照1:0.5的比例向大麦培养基中加入水，灭菌。在该培养基上接种实施例1扩大培养的菌种，按实施例9的培养方法进行固体培养并采收孢子粉(编号9)。
实施例11固体培养
将实施例9采收孢子粉后的大麦培养基采用除湿机除湿，除湿温度40℃；除湿后培养基湿度达到80％；分离出菌丝体；再按照1:0.5的比例向大麦培养基中加入水，灭菌。在该培养基上接种实施例1扩大培养的菌种，按实施例9的培养方法进行固体培养并采收孢子粉(编号10)。
实施例9-11采收的孢子粉测定其主要成分含量，结果见表2。
表2不同培养基培养得到的孢子粉成分含量测定
实施例12固体培养
将实施例1扩大培养的菌种按每个培养容器10％的接种量接种固体培养中，接种后的容器放入培养室培养。
培养条件：培养室温度为24-25℃，空气相对湿度50-60％；光照强度100lx～200lx；接种后定期检查，及时剔除生长势差、感染杂菌的培养容器。培养室要适时通风换气，保持发菌室空气新鲜。
固体培养基：荞麦和水按1：1的比例混合。
采收及处理：当培养基表面长满厚厚一层孢子粉时(15-20天)，及时采收孢子粉(编号11)。
实施例13固体培养
将实施例12采收孢子粉后的荞麦培养基，进行烘干，烘干温度30℃；烘干后培养基湿度达到80％；分离出菌丝体；再按照1:0.5的比例向荞麦培养基中加入水，灭菌。在该培养基上接种实施例1扩大培养的菌种，按实施例12方法进行固体培养并采收孢子粉(编号12)。
实施例14固体培养
将实施例12采收孢子粉后的荞麦培养基，进行烘干，烘干温度40℃；烘干后培养基湿度达到80％；分离出菌丝体；再按照1:0.5的比例向荞麦培养基中加入水，灭菌。在该培养基上接种实施例1扩大培养的菌种，按实施例12方法进行固体培养并采收孢子粉(编号13)。
实施例12-14采收的孢子粉测定其主要成分含量，结果见表3。
表3不同培养基培养得到的孢子粉成分含量测定
实施例15循环次数考察
考察以下三组孢子粉的成分含量，结果见表4。
①实施例2培养得到的孢子粉(编号1)；
②实施例3培养得到的孢子粉(编号2)；培养基循环利用一次；
③实施例3采收孢子粉后的小麦培养基重复实施例3的除湿步骤，制备的培养基继续培养实施例1的菌种，按实施例2的培养方法进行固体培养并采收孢子粉(编号15)。培养基循环利用两次。
表4不同培养基培养得到的孢子粉成分含量测定
结果表明，本发明方法重复2次后，得到的孢子粉质量仍与实施例2孢子粉无差别。通过计算，按照投料100kg小麦计算，同一批小麦培养基可重复利用2次，最终获得孢子粉总产量为12.7kg，同时分离获得9.3kg菌丝体；而常规方法中固体培养基仅利用一次，获得孢子粉产量仅为4.5kg，且没有回收菌丝体。