本发明属于促腐剂技术领域，具体涉及一种高效促腐剂的制备方法。
背景技术：
利用秸秆或农家肥制作有机肥或者将秸秆或农家肥直接堆沤还田，都需要加入促腐剂使原料快速腐熟，秸秆或农家肥促腐过程主要涉及微生物及酶学降解过程，是一个微生物菌种不断对秸秆和农家肥进行分解和转化的过程，秸秆或农家肥降解产物富含氮磷钾等养分，可供作物生长所需。这就说明，促腐剂中有益菌种的活性越高，其促进秸秆和农家肥腐烂的速度越快，促腐剂的效果越好。因此，高效促腐菌剂的开发与应用，是实现清洁高效农业生产的较为有效的技术途径。
现有技术的促腐菌剂由霉菌、放线菌和细菌等组成，其制备方法是将各菌种进行一、二级培养而后按照比例混合即得菌剂，所述菌剂可用于秸秆高温堆腐。虽然公开了各菌种的制备是将菌种接种至配制好的各自的液体培养基中进行培养制得，但是利用这些培养基培养的菌种活性不高，并且制备方法是直接将各菌种的一级培养种子液与分接种的液体培养按比例混合进行摇床培养得到二级培养液，一级培养采用的是摇床培养，并未进行划线培养，没有分离并挑选出单菌落，一级培养物没有得到纯化，因此二级培养液中的菌种纯度不高，活性不强。它虽然可以降解农田残留的秸秆，但是所得菌剂对秸秆降解速度慢，促腐效率低。因此，研制一种能使秸秆或农家肥腐熟速度显著提高，降解能力强，促腐效率高，效果好的高效促腐剂的制备方法是客观需要的。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种能使秸秆或农家肥腐熟速度显著提高，降解能力强，促腐效率高，效果好的高效促腐剂制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种高效促腐剂的制备方法，包括以下几个步骤：
A、菌种的活化及纯化
A1、将真菌接种到PDA培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养至菌丝体丰富或孢子产生；
A2、将放线菌接种到MS agar培养基上划线培养，置于30℃恒温培养箱中培养至单菌落或孢子产生；
A3、将细菌接种到Nutrient Agar培养基或LB培养基上划线培养，置于30℃恒温培养箱中培养1-2天，培养至单菌落产生；
B、液体摇床扩大培养
B1、挑取步骤A1中真菌的菌丝体或孢子接种至配制好的液体PDA培养基中液体摇床培养，培养温度为28℃；
B2、挑取步骤A2中放线菌的单菌落或孢子接种至配制好的液体MS agar培养基中液体摇床培养，培养温度为30℃；
B3、挑取步骤A3中细菌的单菌落接种至配制好的液体Nutrient Agar培养基或LB培养基中液体摇床培养，培养温度为30℃；
C、固体菌粉的制备
C1、将米粉、麸皮、豆粉按照质量百分比为 65：35：10混合均匀，然后加入105％的水，灭菌处理，制备成培养料；
C2、将步骤B1、B2、B3中各液体培养基的菌种分别按重量5％的比例接种到培养料中，置于25℃培养 5-10 天，取出后揉散，在40℃条件下干制 18小时；
C3、将步骤C2中干制好的各菌种按照数量份数比为真菌：放线菌：细菌 =25-35：15-25：45-55混合，制备成活性高的高效促腐剂。
进一步地，步骤A1中所述真菌由酿酒酵母、绿色木霉、米曲霉、米根霉四种真菌组成，其数量份数比为25-35：15-25：25-35：15-25；
步骤A2中所述放线菌由灰色链霉菌和细黄链霉菌组成，其数量份数比为45-55：45-55；
步骤A3中所述细菌由枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌组成，其数量份数比为15-25：15-25：15-25：15-25：15-25。
进一步地，步骤B1、B2、B3中所述液体摇床培养转速为200 rpm。
进一步地，本发明所用试剂和原料除特殊说明外，均市售可得。
本发明的有益效果是：在一级培养中将真菌接种到PDA培养基上，得到活性较高的菌丝体或孢子，将放线菌接种到MS agar培养基上得到活性较高的单菌落或孢子，将细菌接种到Nutrient Agar培养基或LB培养基上，得到活性较高的单菌落，然后再采用划线培养，挑选出活性高的单菌落或孢子接种到二级培养基中扩大培养，由于一级培养的菌种得到了分离和纯化，致使二级培养基中有益微生物菌种的活性更高，繁殖能力增强，显著地增加了微生物菌剂对秸秆和农家肥降解能力，加快了原料腐熟速度，缩短了原料腐熟的周期。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。
实验材料—培养基的制备：
Nutrient Agar培养基：Pepton 5 g， Beef extract 30 g，NaCl 5g ，Agar 15 g，加 dH 2O 至1000 mL，pH：7.0-7.2；
LB培养基：Tryptone 10 g， Yeast extract 5 g，NaCl 10 g，加dH 2O 至1000 mL，pH=7.0；
MS agar培养基：琼脂 20 g，甘露醇 20 g，大豆粉 20 g，去离子水定容至1000 mL，用5 M NaOH调pH至7.2，高温高压灭菌两次；
PDA培养基：200g马铃薯，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖和17-20g琼脂，高压蒸汽灭菌（121℃）灭菌20分钟。
实施例1
（一）菌种的活化和纯化以及液体摇床扩大培养：
（1）将由酿酒酵母、绿色木霉、米曲霉、米根霉按数量份数比为25：15：25：15组成的真菌接种到PDA培养基上，置于28℃恒温培养箱中，培养至菌丝体丰富或孢子产生；挑取真菌的菌丝体或孢子接种至配制好的真菌液体培养基中液体摇床培养，培养温度为28℃，摇床培养转速为200 rpm；
（2）将由灰色链霉菌和细黄链霉菌按数量份数比为45：45组成的放线菌接种到MS agar培养基上划线培养，置于30℃恒温培养箱中，培养至单菌落或孢子产生；挑取放线菌的单菌落或孢子接种至配制好的放线菌液体培养基中液体摇床培养，培养温度为30℃，摇床培养转速为200 rpm；
（3）将由枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌按数量份数比为15：15：15：15：15组成的细菌接种到Nutrient Agar培养基或LB培养基上划线培养，置于30℃恒温培养箱中培养1-2天，培养至单菌落产生；挑取中细菌的单菌落接种至配制好的细菌液体培养基中液体摇床培养，培养温度为30℃，摇床培养转速为200 rpm。
（二）固体菌粉的制备：
（1）将米粉、麸皮、豆粉按照重量百分比为 65：35：10混合均匀，然后加入105％的水，灭菌处理，制备成培养料；
（2）将上述各液体培养基的各菌种分别按重量5％的比例接种到培养料中，置于25℃培养 5-10 天，取出后揉散，在40℃条件下干制 18小时；
（3）将干制好的各菌种按照数量份数比为真菌：放线菌：细菌 =25：15：45混合，制备成活性较高的高效促腐剂。
（三）应用：按照以上方法制备的促腐剂，用于农家肥的高温堆腐，堆腐时的菌剂接种量约为0.25-0.5亿个菌/克农家肥。将上述促腐剂按重量比菌剂：农家肥=1：800的比例拌匀，水份控制在55-65%之间，温度控制在30℃堆腐15-18天即可。
实施例2
（一）菌种的活化和纯化以及液体摇床扩大培养：
（1）将由酿酒酵母、绿色木霉、米曲霉、米根霉按数量份数比为30：20：30：20组成的真菌接种到PDA培养基上，置于28℃恒温培养箱中，培养至菌丝体丰富或孢子产生；挑取真菌的菌丝体或孢子接种至配制好的真菌液体培养基中液体摇床培养，培养温度为28℃，摇床培养转速为200 rpm；
（2）将由灰色链霉菌和细黄链霉菌按数量份数比为50：50组成的放线菌接种到MS agar培养基上划线培养，置于30℃恒温培养箱中，培养至单菌落或孢子产生；挑取放线菌的单菌落或孢子接种至配制好的放线菌液体培养基中液体摇床培养，培养温度为30℃，摇床培养转速为200 rpm；
（3）将由枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌按数量份数比为20：20：20：20：20组成的细菌接种到Nutrient Agar培养基或LB培养基上划线培养，置于30℃恒温培养箱中培养1-2天，培养至单菌落产生；挑取中细菌的单菌落接种至配制好的细菌液体培养基中液体摇床培养，培养温度为30℃，摇床培养转速为200 rpm。
（二）固体菌粉的制备：
（1）将米粉、麸皮、豆粉按照重量百分比为 65：35：10混合均匀，然后加入105％的水，灭菌处理，制备成培养料；
（2）将上述各液体培养基的各菌种分别按重量5％的比例接种到培养料中，置于25℃培养 5-10 天，取出后揉散，在40℃条件下干制 18小时；
（3）将干制好的各菌种按照数量份数比为真菌：放线菌：细菌 =30：20：50混合，制备成活性较高的高效促腐剂。
（三）应用：按照以上方法制备的促腐剂，用于农家肥或秸秆的高温堆腐，堆腐时的菌剂接种量约为0.25-0.5亿个菌/克农家肥。将上述促腐剂按重量比菌剂：农家肥（或秸秆）=1：800的比例拌匀，水份控制在55-65%之间，温度控制在30℃，农家肥堆腐12-15天，秸秆堆腐15-18天即可。
实施例3
（一）菌种的活化和纯化以及液体摇床扩大培养：
（1）将由酿酒酵母、绿色木霉、米曲霉、米根霉按数量份数比为35：25：35：25组成的真菌接种到PDA培养基上，置于28℃恒温培养箱中，培养至菌丝体丰富或孢子产生；挑取真菌的菌丝体或孢子接种至配制好的真菌液体培养基中液体摇床培养，培养温度为28℃，摇床培养转速为200 rpm；
（2）将由灰色链霉菌和细黄链霉菌按数量份数比为55：55组成的放线菌接种到MS agar培养基上划线培养，置于30℃恒温培养箱中，培养至单菌落或孢子产生；挑取放线菌的单菌落或孢子接种至配制好的放线菌液体培养基中液体摇床培养，培养温度为30℃，摇床培养转速为200 rpm；
（3）将由枯草芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌按数量份数比为25：25：25：25：25组成的细菌接种到Nutrient Agar培养基或LB培养基上划线培养，置于30℃恒温培养箱中培养1-2天，培养至单菌落产生；挑取中细菌的单菌落接种至配制好的细菌液体培养基中液体摇床培养，培养温度为30℃，摇床培养转速为200 rpm。
（二）固体菌粉的制备：
（1）将米粉、麸皮、豆粉按照重量百分比为 65：35：10混合均匀，然后加入105％的水，灭菌处理，制备成培养料；
（2）将上述各液体培养基的各菌种分别按重量5％的比例接种到培养料中，置于25℃培养 5-10 天，取出后揉散，在40℃条件下干制 18小时；
（3）将干制好的各菌种按照数量份数比为真菌：放线菌：细菌 =35：25：55混合，制备成活性高的高效促腐剂。
（三）应用：按照以上方法制备的促腐剂，用于农家肥或秸秆的高温堆腐，堆腐时的菌剂接种量约为0.25-0.5亿个菌/克农家肥。将上述促腐剂按重量比菌剂：农家肥（或秸秆）=1：800的比例拌匀，水份控制在55-65%之间，温度控制在30℃，农家肥堆腐10-12天，秸秆堆腐13-16天即可。
按照上述几种配比制备促腐剂时，分别将真菌、放线菌和细菌接种到各自的培养基上进行一级培养，培养产生的菌丝体或孢子或单菌落活性较高，经一级培养后再采用划线培养，使接种物随所划的线而分散，在平板的表面形成单个分离的细胞接种物，分离出单菌落，再挑选出分离的单菌落接种到二级培养基中扩大培养，使培养物得到了纯化，培养的菌种活性更高，降解能力更强，显著地增加了微生物菌剂对秸秆和农家肥分解和转化的能力，腐熟速度快，促腐效率高，效果好。