小麦抗旱基因TaH2A.9及其应用的制作方法

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种小麦抗旱基因(基因TaH2A.9)及其应用。

背景技术：

干旱严重影响农作物产量，特别是随着工业的发展，干旱灾害愈来愈严重，而且土壤盐渍化也加剧了干旱灾害，使得干旱变成了一个全球关注的社会问题。我国人口众多，而干旱灾害更为严重，已经成为制约我国经济和社会发展的重要因素。因此，除了加快科学灌溉系统建设、缓解土壤盐渍化以外，培育抗旱作物新品种已成为当前一个十分迫切的任务。

利用转基因技术改良植物将新的性状转入高生物量植物中，以此开发高效的转基因植物新品种并用于在旱地种植，是一项具有广阔应用前景的技术。

目前，利用基因工程技术开展植物抗旱方面的研究已取得了较大的进展，克隆了大量相关基因，并将这些基因转入植物中，用于抗旱机制研究。一些实验表明，将植物本身以及其它生物中与抗旱相关的基因转入植物中，其转录和翻译产物可以使转基因植物的抗旱能力得到提高。

检索表明已发现了一些能显著提高植物抗旱能力的基因，但有关H2A基因在植物抗旱过程中的作用报道较少。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种抗旱基因——小麦基因TaH2A.9及其应用。

本发明的技术方案是：从小麦中分离得到基因TaH2A.9，然后将该基因转化到拟南芥中，进行转基因功能验证(拟南芥转化筛选及旱胁迫表性分析)，以实现研究H2A基因的功能以及抗旱机理。

本发明所述的小麦抗旱基因，其特征在于：所述基因命名为小麦抗旱基因TaH2A.9，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种含有上述小麦抗旱基因TaH2A.9的植物表达载体pSTART-TaH2A.9。

本发明所述小麦抗旱基因TaH2A.9以及含有所述小麦抗旱基因TaH2A.9的植物表达载体pSTART-TaH2A.9在培育抗旱植物中的应用，其中，所述植物优选是普通小麦或拟南芥。

本发明所述的小麦抗旱基因TaH2A.9以及含有所述小麦抗旱基因TaH2A.9的植物表达载体pSTART-TaH2A.9可广泛用于培育抗旱农作物品种。

将本发明所述小麦抗旱基因TaH2A.9导入植物细胞，植物即可相应地获得抗旱能力。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因TaH2A.9的植物表达载体(pSTATR-TaH2A.9)进行加工，如可以加入选择标记(GUS等)或者具有抗性的抗生素标记物(潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等)等。

实际上，任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，本发明优选的载体是pSTART。

本发明的有益效果是：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了小麦抗旱基因TaH2A.9，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，转基因植株的抗旱能力明显提高，证实本发明的基因具有广泛的应用前景。

附图说明

图1：TaH2A.9基因全长cDNA序列的扩增结果

其中：M为λDNA/(BamH I+Sac I)Marker，下同；-：阴性对照。

图2：NaCl胁迫下小麦中TaH2A.9的RT-PCR分析

其中：Leaf表示叶；Root表示根；TaActin表示小麦Actin基因(内参)；数字表示胁迫时间(小时)。

图3：pSTART-TaH2A.9拟南芥表达载体构建过程

其中：A为带酶切位点的TaH2A.9片段扩增；B为Xba I和BamH I对pSTART-TaH2A.9载体进行双酶切条带；C为转化了pSTART-TaH2A.9大肠杆菌的菌体PCR验证；D为转化了pSTART-TaH2A.9农杆菌的菌体PCR验证。

图4：拟南芥TaH2A.9转基因植株的基因组PCR和RT-PCR检测

其中：V为空载体转基因株系；T1、T2为两个独立的转基因株系；C为野生型拟南芥；AtActin为拟南芥Actin基因内参；Genomic PCR为通过基因组PCR验证TaH2A.9整合到拟南芥基因组；RT-PCR为通过RT-PCR验证TaH2A.9在转基因株系中正常表达。数据显示，在转基因株系中能够扩增出TaH2A.9条带，而在空载体转基因株系及野生型中不能扩增出条带，表明TaH2A.9整合到拟南芥基因组中并且正常表达。

图5：干旱胁迫下转基因植株的生长状况

其中：WT为未转化拟南芥植株；T1/T2为两个独立的转基因株系；VC为空载体对照。数据表明，转化TaH2A.9的转基因拟南芥的抗旱能力明显增加。

具体实施方式

实施例1、TaH2A.9的克隆和表达分析

1.1提取小麦Total RNA

1.将组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

2.待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入1ml的Invitrogen公司的TRIzol提取液，融化后，用加样枪反复吸吹，剧烈振荡混匀样品，使样品充分裂解，室温放置5分钟；

3.加入0.2ml氯仿，剧烈振荡混匀15秒，室温放置10分钟；

4. 4℃，12000rpm离心15分钟；

5.用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，-20℃,沉淀30min或过夜；

6. 4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；

7. RNA沉淀用1ml的75％乙醇洗涤；4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；

8.重复用75％乙醇洗涤一次RNA沉淀；

9.去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入适当体积(30-50μl)的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃长期保存)；

10.紫外分光光度计及1％Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。

注：a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD＝40μg/ml。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。

b)用1％Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取1μl RNA加入3μl的RNase-free水，加1μl上样缓冲液65℃变性5分钟。电泳后用EB染色，另取3μl的1kb DNA Marker作为对照。

1.2cDNA反转录

反转录酶：M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen)。

1. 12μl反应体系

2. 65℃变性5min，迅速插入冰中，然后依次加入:

5×First-Strand Buffer 4μl

0.1M DTT 2μl

RNaseOUT(Invitrogen) 1μl

3.轻轻混匀，37℃反应2min；

4.加入1μl M-MLV RT，混匀，37℃反应50min；

5. 70℃温育15min使M-MLV RT失活；

6.加入1μl RNase H(Invitrogen)，37℃反应20min；

7.用超纯水稀释至合适浓度。作为PCR模板。

1.3开放阅读框的克隆和序列测定

1.引物序列：根据测序结果，设计基因上下游引物，扩增基因的开放阅读框。

2. PCR反应体系(50μl)：

3. PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃复性45sec，72℃延伸1.5min，循环35次；72℃延伸7min。

4.扩增片段回收后与pMD-18T载体连接并转化大肠杆菌DH10B，测序由上海Invirtron公司完成。结果见图1。

1.4基因表达分析(RT-PCR)

1. RNA的提取

山融3号和济南177小麦种子正常萌发，Hangload培养液培养至株高约10cm时(约3周时间)开始施加盐胁迫(200mM NaCl)，处理0、1、6、12、24小时取幼嫩的叶片和根系提取RNA。

2.反转录(RT)产生cDNA

反转录产生cDNA，方法同上。

3. PCR反应及电泳

(1)以cDNA为模板，进行PCR反应。

(2)PCR体系：

(3)PCR程序：

95℃5min；25～30cycles 95℃20s,57℃60s,72℃60s；72℃7min。

根据内参Actin的扩增情况确定PCR的循环数，调整cDNA模板的加入量。

(4)PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色。结果见图2。

实施例2、植物表达载体的构建

利用植物表达载体pSTART，选用XbaI和BamHⅠ分别对pSTART和含有目的基因的pMD18-T载体进行双酶切；回收载体大片段和目的基因小片段，用T₄DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，鉴定重组子后即得到带有目的基因的植物表达载体。

1.双酶切，以pSTART空载体和pMD18-T为例

碱裂解法提取pSTART空载体和pMD18-T质粒，各取10μg酶切，酶切体系如下：

于30℃恒温水浴锅酶切2小时以上。双酶切后以1×TAE为电泳缓冲液，将酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pSTART中14kb的载体大片段和pMD18-T中大约0.45kb的目的基因条带，回收该条带。结果见图3A。

2. pSTART质粒酶切回收的载体大片段的脱磷。

3.经酶切和脱磷的pSTART载体片段(约14kb)和pMD18-T双酶切回收片段(约0.45kb)以摩尔比1:4的比例进行16℃连接过夜。

4.利用热激法将连接产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，转化菌在含50μg/ml Kan的LB固体平板上37℃培养16小时左右。

5.重组子的鉴定

(1)质粒的PCR验证

挑取单菌落分别接种于5ml含Kan的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜，碱变性法提取质粒，用基因特异引物进行PCR扩增。

PCR反应条件：预变性94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果间图3C。

(2)质粒酶切鉴定

提质粒进行XbaI和BamHI双酶切，酶切体系同上。0.8％琼脂糖凝胶电泳，检测是否含有预期分子量大小的片段，验证载体的正确构建。结果见图3B。

实施例3、农杆菌感受态的制备与转化

3.1农杆菌AGL1/EHA105感受态的制备

1.从YEP平板(含50μg/ml利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于YEP液体培养基(含50μg/ml利福平)中，200rpm/min，28℃培养过夜。

2.取2ml过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的YEP液体培养基中在相同条件下培养至OD₆₀₀达0.5。

3.菌液冰浴30min，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

4.将菌体重悬于冰浴的10ml 0.15mol/L的NaCl中，离心收集菌体。

5.再悬浮于1ml 20mmol/L冰预冷的CaCl₂溶液中，以200μl/管将菌液分装在1.5ml Eppendorf管中，置液氮中速冻1min，-70℃保存备用。

3.2冻融法转化根癌农杆菌AGL1/EHA105

1.在室温下融化农杆菌感受态细胞，加入1μg表达载体质粒DNA，混匀后冰浴30min。

2.置液氮速冻1min，迅速移至37℃保温3min。

3.加入无抗生素的YEP 800μl，28℃震荡培养3小时。

4. 7000rpm离心30s收集菌体，涂于含50μg/ml利福平、50μg/ml Kan的YEP平板上，28℃倒置暗培养2-3天。

3.3菌体PCR鉴定

挑取2.4的单菌落转移到如前所述的PCR体系(不加DNA模板)中，用基因特异引物进行PCR扩增。PCR反应条件：预变性94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果见图3D。

实施例4、转基因功能验证－拟南芥转化筛选及抗旱表型分析

4.1拟南芥种植

将种子放入EP管中，70％乙醇中浸泡5min，洗涤10-15min，无菌水冲洗4次，4℃春化72h。向消毒好的种子中加入0.5％agarose(冷却至40℃)，铺于1/2MS固体培养基上，超净台上吹干。转入人工气候室中培养一周左右，可移栽。将人工土壤装入合适大小的培养钵，70℃烘干2小时以上，然后将培养钵放在营养液中，使其充分吸水，将在1/2MS固体培养基上生长7-10天的幼苗移栽于饱含营养液的人工土壤中，盖上保鲜膜，转入人工气候室中培养。1-2天后揭去保鲜膜。隔几天浇一次水(浇在培养钵底下的托盘里)。

4.2拟南芥转化

1.当拟南芥(哥伦比亚野生型)花序形成时，将花序顶端减掉以诱导测花序的生成，转化前将材料浇透营养液。

2.转化前一天，取2ml活化的农杆菌AGL1加到含相应抗生素的200ml YEP培养基中，过夜培养至OD₆₀₀＝1.0-1.2。

3.离心收集菌体，并重悬于浸染液(5％蔗糖，0.04％Silwet L-77)中，使OD₆₀₀＝0.8。

4.将花序浸入浸染液30秒，其间前后摆动花序，使花序上形成一层膜。

5.用保鲜膜覆盖花序，暗培养一天后揭去保鲜膜，至于19-22℃培养室培养。

6.隔5-7天再同法浸染一次。

7.大约一个月后收获种子。

4.3小麦和拟南芥转化阳性株系筛选

1.收获的T₀代种子消毒后，铺于含50μg/ml Kan的MS筛选培养基上(方法同上)。

2. 4℃春化48h，移到人工气候室生长7-10天。将抗性小苗移到土中继续生长。

3.等植物绝大多数花苞已经结果荚，用小绳将植物单株绑起，以便单株收种子T₁代种子。

4. PCR扩增以转化株系的基因组DNA为模板，使用基因特异引物进行基因组PCR，鉴定阳性克隆。结果见图4。

5.T₁种子处理同前，在T₂代植物中挑选抗性比为3:1的单插入独立株系。

6.将T2代植株种子按照上述方法，铺于含50μg/ml Kan的MS筛选培养基上，筛选全部Kan抗性的系，移栽到培养钵中，收获T3带纯系种子，用于后续分析。

7.从T3带纯系株系上取下1片叶子，按照上述方法提取RNA，进行RT-PCR分析，鉴定转基因的表达情况。结果见图4。

4.4拟南芥阳性株系抗旱表型分析

1.按照上述方法将拟南芥种子消毒、铺在1/2MS培养基上培养，得到7-10天幼苗，移栽到培养钵中培养至一月大小，进行控水试验。

2.控水试验：停止浇水10天后，正常浇水，观察转基因和非转基因株系生长情况。结果见图5。

序列表

<110>山东大学

<120>小麦抗旱基因TaH2A.9及其应用

<141>2017-03-16

<160> 1

<210> 1

<211>456

<212>cDNA

<213>小麦

<221>小麦抗旱基因TaH2A.9

<222>（1）…（456）

<400>1

atggccggaa ggaagggagg cgacaggaag aaggcggtga ccaggtccgt caaggccggg 60

gttctccagt tccccgtcgg ccgcatcggg cgctacctca agaagggccg ctacgcgcag 120

cgcgtcggct ccggcgcccc cgtctacctc gccgccgtcc tcgagtacct cgccgctgag 180

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