水稻OsTOE1基因在增加穗粒数和降低穗长中的应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及水稻OsTOE1基因在增加穗粒数和降低穗长中的应用。通过转基因的方法，在水稻中超量表达OsTOE1基因的蛋白质编码区显著的增加了穗粒数和降低了穗长，表明OsTOE1基因在水稻遗传改良中具有重要的利用价值。

背景技术：

随着全球人口的不断增长以及人类消费方式的改变，全球的粮食危机日益严峻。水稻是全球最重要的粮食作物之一，我国有超过一半的人口以稻谷为主粮，因此提高水稻的产量对保障国家的粮食安全具有重要的战略意义。

水稻的单株产量是由分蘖数、每穗颖花数和粒重共同决定的，其中每穗颖花数的多少取决于穗型的形成过程。水稻的穗是在进入生殖生长以后由花序分生组织分化而来的，在最终形成花器官之前，水稻的穗部会逐渐产生一次枝梗分生组织、二次枝梗分生组织和小穗分生组织，这些不同分生组织之间转变的时间在很大程度上决定了水稻的穗型(Kyozuka et al.,Control of grass inflorescence form by the fine-tuning of meristem phase change.Curr Opin Plant Biol,2014,17:110-115)。如果小穗分生组织的分化被推迟的话，则可能产生更多的二次枝梗甚至三次枝梗，从而可以提高最终的穗粒数。鉴于在农业生产上具有重要的利用价值，有关穗型的研究长期以来都是植物学研究的热门领域，科学家已经通过各种手段，分离克隆了多个参与穗型形成决定的基因，并且一些基因已经在育种实践中得到了应用(Zhang and Yuan,Molecular control of grass inflorescence development.Annu Rev Plant Biol,2014,65:553-578)。从目前分离到的基因来看，转录因子在其中占了很大的一部分，表明基因转录调控对穗型的形成具有重要的决定作用。申请人通过分析水稻多个连续发育阶段的幼穗的全基因组转录组也发现转录因子表达模式在不同的发育时期差别很大，这也进一步暗示转录因子在修饰穗型中发挥着核心的作用(Wang et al.,A dynamic gene expression atlas covering the entire life cycle of rice.Plant J,2010,61:752-766)。

MicroRNA172是一类在不同植物中高度保守的非编码小RNA，其通过调节AP2类的转录因子来发挥作用。AP2是最早被鉴定的参与花器官模式建成的A类基因，因此microRNA172和AP2之间的调控作用对花器官的形态建成具有重要的调节作用(Chen,A microRNA as a translational repressor of APETALA2in Arabidopsis flower development.Science,2004,303:2022-2025)。此外，受microRNA172调节的AP2类基因还在植物多个发育过程中发挥作用，比如参与玉米的性别决定过程，也与大麦的闭花受精和密穗的形成过程密切相关(Chuck et al.,The maize tasselseed4microRNA controls sex determination and meristem cell fate by targeting Tasselseed6/indeterminate spikelet1.Nat Genet,2007,39:1517-1521；Houston et al.,Variation in the interaction between alleles of HvAPETALA2and microRNA172determines the density of grains on the barley inflorescence.Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110:16675-16680；Nair et al.,Cleistogamous flowering in barley arises from the suppression of microRNA-guided HvAP2mRNA cleavage.Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107:490-495)。在水稻中microRNA172可以调控5个编码AP2类转录因子的靶基因，其中3个靶基因的功能已经被公开报道过(Lee and An,Two AP2family genes,SUPERNUMERARY BRACT(SNB)and OsINDETERMINATE SPIKELET 1(OsIDS1),synergistically control inflorescence architecture and floral meristem establishment in rice.Plant J,2012,69:445-461；Zhou et al.,Genetic control of seed shattering in rice by the APETALA2transcription factor SHATTERING ABORTION1.Plant Cell,2012,24:1034-1048)。其中SNB和OsIDS1主要参与花器官发育，而SHAT1则是参与调节水稻的落粒性。本发明阐述了另外一个受microRNA172调控的基因OsTOE1的功能。本发明通过超量表达OsTOE1基因的蛋白质编码区显著的增加了水稻穗粒数和降低了水稻的穗长，为在农业生产上利用OsTOE1基因来对水稻进行遗传改良提供了新的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供一种OsTOE1基因在增加水稻穗粒数和降低穗长中的应用。本发明的另外一个目的是提供了一种通过OsTOE1基因来增加水稻穗粒数和降低穗长的遗传转化载体和方法。OsTOE1基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，也包括与SEQ ID NO:1所示的DNA序列有90％以上同源性的基因序列，也包括因插入、替代或缺失一个或多个碱基而产生的突变体等位基因或衍生物。本发明还包括OsTOE1基因编码的蛋白质，其序列如SEQ ID NO:3所示，也包括与SEQ ID NO:3所示的序列具有90％以上同源性的蛋白质序列，也包括因插入、替代或缺失一个或多个氨基酸而产生的功能改变的蛋白或蛋白类似物。本发明通过超量表达OsTOE1基因的蛋白质编码区显著的增加了水稻的穗粒数和降低了水稻的穗长，这些结果表明OsTOE1基因在水稻育种中可能具有重要的利用价值。OsTOE1基因的蛋白质编码区的序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。本发明提供的OsTOE1基因可用于与其它调控元件，如组成型启动子(如CaMV35S启动子)或器官特异性启动子融合构建基因表达载体；也可通过转基因技术、反义RNA、RNAi、锌指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN)和CRISPR(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats)/Cas9等技术对其操控以调控水稻的穗粒数和穗长。

实现本发明的具体技术方案如下：

1、利用PCR的方法从水稻叶片RNA反转录而来的cDNA中扩增OsTOE1基因的蛋白质编码区；具体方法在实施例1中有详细描述。

2、将OsTOE1基因的蛋白质编码区连接到pCAMBIA1301S载体上，构建超量表达载体35S:OsTOE1OE；具体方法在实施例2中有详细描述。

3、利用优化过的农杆菌介导的转基因方法(Lin and Zhang,Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice.Plant Cell Rep,2005,23:540-548)将载体35S:OsTOE1OE导入水稻受体中花11(中国农业科学院作物科学研究所)，获得转化植株；具体方法在实施例3中有详细描述。

4、借助PCR的方法分析鉴定阳性转基因植株和共分离检测，并对T1代单株进行表型鉴定和统计分析；具体方法在实施例4中有详细描述。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

1、本发明阐述了水稻OsTOE1基因在增加水稻穗粒数和降低穗长中的功能；

2、本发明将OsTOE1基因的蛋白质编码区导入水稻，实现了对水稻穗粒数和穗长的遗传改良；

3、本发明发现了一种利用OsTOE1基因来对水稻进行遗传改良的方法。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是OsTOE1基因的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:2是OsTOE1基因的编码蛋白质的CDS序列。

序列表SEQ ID NO:3是OsTOE1基因编码的蛋白质序列。

图1：OsTOE1与microRNA172(miR172)的核苷酸配对示意图。

图2：表达载体35S:OsTOE1OE构建过程示意图。附图标记说明：

图2中的A图：插入转化载体35S:OsTOE1OE的包含有OsTOE1蛋白质编码区的DNA片段示意图。

图2中的B图：空载体pCAMBIA1301S的结构示意图。将图2中的A图所示的片段通过KpnI和BamHI双酶切插入载体pCAMBIA1301S的KpnI和BamHI酶切位点中间形成转化用的终载体35S:OsTOE1OE。

图3：本发明构建的表达载体35S:OsTOE1OE的结构示意图。

图4：35S:OsTOE1OE转基因T1代单株的基因型检测。附图标记说明：

图4中的A图：35S:OsTOE1OE转基因第一个家系的T1代植株基因型检测。所用的引物是OsTOE1OEJCF和OsTOE1OEJCR，752bp大小的产物是该对引物扩增的基因组DNA片段，219bp大小的产物是该对引物扩增的转入的OsTOE1基因的蛋白质编码区的片段。出现219bp大小的扩增产物的单株是转基因阳性单株。第一个泳道是DNA marker。

图4中的B图：35S:OsTOE1OE转基因第二个家系的T1代植株基因型检测。所用的引物是OsTOE1OEJCF和OsTOE1OEJCR，752bp大小的产物是该对引物扩增的基因组DNA片段，219bp大小的产物是该对引物扩增的转入的OsTOE1基因的蛋白质编码区的片段。出现219bp大小的扩增产物的单株是转基因阳性单株。第一个泳道是DNA marker。

图5：野生型中花11(WT)与35S:OsTOE1OE转基因(OsTOE1OE)的植株的表型比较。附图标记说明：

图5中的A图：野生型中花11(WT)与35S:OsTOE1OE转基因(OsTOE1OE)的植株的形态比较。

图5中的B图：野生型中花11(WT)与35S:OsTOE1OE转基因(OsTOE1OE)的植株的穗型比较。

图5中的C图：野生型中花11(WT)与35S:OsTOE1OE转基因(OsTOE1OE)的植株的一次枝梗形态比较。

具体实施方式

实施例1：水稻OsTOE1基因的蛋白质编码区克隆

水稻中一共有5个AP2类的基因受到microRNA172的调控，其中基因登陆号为LOC_Os05g03040的功能还没有被阐述。根据水稻基因组注释的结果(http://rice.plantbiology.msu.edu/)，该基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，其蛋白质编码区序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示，编码的蛋白质序列见序列表中的SEQ ID NO:3。将该基因的蛋白质序列同拟南芥的蛋白质进行比对，发现该基因是拟南芥开花抑制子TOE1基因的直系同源基因，因此本发明中命名该基因为OsTOE1。OsTOE1基因与microRNA172的序列配对关系见图1。

本发明采用水稻叶片的RNA经过反转录得到的cDNA为模板，利用OsTOE1基因的特异引物，通过PCR的方法分离克隆OsTOE1基因的蛋白质编码区，具体的操作如下：

(1)提取水稻叶片RNA

抽提水稻品种中花11植株分蘖期叶片的RNA，RNA抽提用的试剂是购买自Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)。

(2)反转录合成cDNA第一链

步骤如下：

1)取抽提的总RNA 2μg，加入DNaseI 1μl,10xDNaseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂，工作浓度为0.01％)处理过的水到10μl，混匀后于室温放置15min以去除残留的基因组DNA；

2)15min后加入0.2M EDTA 1μl，并于65℃水浴中孵育10min以去除DNaseI的活性；

3)加入1μl引物oligo(dT)₁₅，并于65℃水浴中孵育10min以破坏RNA的二级结构，然后冰上放置5min；

4)加入5x first strand buffer 4μl，0.1M DTT(巯基乙醇)2μl，10mM dNTP mixture 1μl，反转录酶1μl，混匀后置于42℃水浴锅内温浴1.5h；

5)反应结束后将反转录产物置于90℃干浴3min以灭活反转录酶；

6)向反转录产物中加入120μl水，混匀后-20℃保存反应最终产物。反应中用到的试剂全部购自 Invitrogen公司。

(3)扩增OsTOE1基因的蛋白质编码区

为了扩增OsTOE1基因蛋白质编码区，设计如下引物：

OsTOE1OEF(正向引物):5'-GGTACCATGGAGTTGGATCTGAACAACGTGG-3'(下划线序列为KpnI识别位点)；

OsTOE1OER(反向引物):5'-GGATCCTCAATGGTGGTGGTGATGGCG-3'(下划线序列为BamHI识别位点)；

该对引物可以扩增出如序列表SEQ ID NO:2所示的基因片段。

以步骤(2)反转录而来的cDNA为模板，用引物OsTOE1OEF和OsTOE1OER进行PCR扩增。PCR反应总体积为20μl，包含cDNA模板1μl，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 2μl，10mM引物OsTOE1OEF和OsTOE1OER各0.3μl，ExTaq酶0.2μl,加去离子水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、rTaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。

PCR反应条件如下：①94℃4min，②94℃40s，③58℃40s，④72℃2min，⑤从②－④循环38次，⑥72℃7min，⑦4℃保存。PCR产物在1％(质量/体积)的TBE琼脂糖凝胶上电泳检测，回收长度为1551bp(1539bp的目标DNA区段加上引物上附加的两个限制性酶切位点12bp)的DNA片段。并将回收的PCR产物连接到T-A克隆载体pGEMT-vector上(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)，利用载体上T7和SP6引物对该PCR产物进行测序验证。将包含该PCR产物的重组质粒命名为质粒TA-OsTOE1。

实施例2：OsTOE1基因的超量表达载体构建

用KpnI和BamHI双酶切质粒TA-OsTOE1(所述的KpnI和BamHI购买自宝生物工程大连有限公司，具体用法与用量参考该公司相应产品的说明书，质粒TA-OsTOE1来自实施例1，如图2A所示)，回收包含OsTOE1基因的蛋白质编码区的1551bp的DNA片段，然后与经过KpnI和BamHI双酶切的载体质粒pCAMBIA1301S[该载体被公开报道:Zhou et al.,Over-expression of aspartate aminotransferase genes in rice resulted in altered nitrogen metabolism and increased amino acid content in seeds.Theor Appl Genet,2009,118:1381-1390；其基本骨架起源于澳大利亚CAMBIA实验室(http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)的pCAMBIA1301，通过加入35S启动子实现对转化基因的表达调控，其结构如图2B所示]利用T4DNA连接酶(购自Promega公司，具体用法与用量参考该公司产品的说明书)进行连接。连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自Promega公司)中，加400μl LB培养基复苏45min，涂于含50mg/L的卡那霉素的LA培养基平板上，37℃温箱培 养14-16h(LA与LB配方参考：萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)。挑取单克隆，扩大培养并抽提质粒，通过KpnI和BamHI双酶切筛选阳性克隆，并将所得的表达载体命名为35S:OsTOE1OE。

实施例3：转基因水稻的获得

将表达载体35S:OsTOE1OE(来自实施例2)通过农杆菌介导的遗传转化方法导入水稻品种中花11的愈伤组织，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素(用于筛选阳性的转基因愈伤的一种抗生素，购买自丹麦的罗氏制药有限公司)抗性的愈伤组织、分化、生根及炼苗移栽大田，得到转基因植株。农杆菌遗传转化的方法和所用的试剂及配方是根据Hiei等人的报道优化而来(Hiei et al.,Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J,1994,6:271-282；Lin and Zhang,Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice.Plant Cell Rep,2005,23:540-548)。

本发明所涉及到的农杆菌介导的遗传转化试剂及配方如下：

(1)试剂和溶液缩写

6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2)N6min母液[100倍浓缩液(100X)]

室温下溶解并定容至1000ml。

3)Fe₂-EDTA贮存液(100X)

在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)2.78g

在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73g

在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2h，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MSmax母液(10X)

室温下溶解并定容至1000ml。

6)MSmin母液(100X)

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2,4-D贮存液(1mg/ml)

2,4-D 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)

6-BA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

9)NAA贮存液(1mg/ml)

NAA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)IAA贮存液(1mg/ml)

IAA 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)

葡萄糖 125g

蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液

AS 0.392g

DMSO 10ml

分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

氢氧化钾(KOH)5.6g

蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

14)KT贮存液(1mg/ml)

KT 100mg.

1ml 1N氢氧化钾溶解5min，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

(3)培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。

使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μlAS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的潮霉素和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的潮霉素和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并定容至1000ml，分装到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

10)LA培养基(LB培养基不含琼脂粉)

蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后室温保存备用。

本发明所涉及到的农杆菌介导的遗传转化的步骤如下：

(1)愈伤诱导

1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1min，0.15％氯化汞(HgCl₂)15min

2)灭菌水洗种子4-5次；

3)将种子放在诱导培养基上；

4)置于黑暗处培养5周，温度26±1℃。

(2)愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度26±1℃。

(3)预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4d，温度26±1℃。

(4)农杆菌培养

1)在带有卡那霉素的LA培养基上预培养含构建好载体的农杆菌EHA1052d，温度28℃；

2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3h。

(5)农杆菌侵染

1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；

2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30min；

4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养2d，温度19-20℃。

(6)愈伤洗涤和选择培养

1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

2)浸泡在含400ppm头孢霉素的灭菌水中30min；

3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次头孢霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)

(7)分化

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7d；

2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃，5－7周。

(8)生根

1)拔出分化好的苗子，剪掉分化时产生的根；

2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

(9)移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。在温室炼苗约2周左右后，再移载至大田。

实施例4：转基因水稻的鉴定与表型观察

为检测转基因植株的基因型，设计以下引物：

OsTOE1OEJCF(正向引物):5'-GGGCCAATTCCTTGGCAAGA-3'；

OsTOE1OEJCR(反向引物):5'-TGTGAGGCTGCAGGCTGAGA-3'；

因为OsTOE1OEJCF是设计在OsTOE1基因的第2个外显子上的，而OsTOE1OEJCR是设计在OsTOE1基因的第6个外显子上的，而遗传转化用的是没有内含子的OsTOE1基因的蛋白质编码区进行的，因此使用该对引物扩增转基因植株，可以得到一条来自基因组DNA的752bp的片段，同时如果是转基因阳性植株的话，还可以得到一条来自OsTOE1基因蛋白质编码区的219bp的片段。根据这两条带型就可以判断PCR是否成功以及所检测的单株是否是转基因阳性的。

抽提T0代35S:OsTOE1OE转化植株(来自实施例3)叶片的总DNA，DNA抽提方法为CTAB法(Zhang et al.,Genetic diversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis.Theor Appl Genet,1992,83:495-499)。以叶片总DNA为模板，用引物OsTOE1OEJCF和OsTOE1OEJCR进行PCR扩增。PCR反应总体积为20μl，包含DNA模板100ng，10xPCR buffer 2μl，10mM dNTP 2μl，10mM引物OsTOE1OEJCF和OsTOE1OEJCR各0.3μl，rTaq酶0.2μl,加去离子水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、rTaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃4min，②94℃40s，③58℃40s，④72℃1min，⑤从②－④循环38次，⑥72℃7min，⑦4℃保存。PCR产物在1％(质量/体积)的TBE琼脂糖凝胶上电泳检测。

PCR检测结果表明，对载体35S:OsTOE1OE转基因而来阳性植株相对于阴性植株而言，全部表现为穗长变短，每穗一次枝梗数不变，但是每穗二次枝梗数和每穗粒数都明显增加，其表型如图5所示。

为了进行表型分析，申请人将35S:OsTOE1OE的2个独立转化而来的T0植株的种子(来自实施例3)经过浸种、催芽后播种于秧田，20d以后移栽至大田获得T1代转基因植株。种植密度为15厘米×24厘米，种植地点为中国湖北省武汉市洪山区华中农业大学的试验田，在一个有安全防护设施条件下按常规的水稻种植方法进行田间管理。利用引物OsTOE1OEJCF和OsTOE1OEJCR进行PCR扩增以检测分离单株的阴阳性，并且进行转基因事件和表型变化的共分离检测，以及统计表型数据。

分析结果表明在T1代，本发明构建的载体35S:OsTOE1OE转基因后代分离出来的所有阳性单株相对于阴性单株而言，都表现为穗长变短，每穗一次枝梗数不变，但是每穗二次枝梗数和每穗粒数都明显增加，表明35S:OsTOE1OE的转基因事件同这些表型的变化是共分离的(见图4和图5)。

考察和记录T1代相关植株的表型数据，包括穗长、每穗一次枝梗数、每穗二次枝梗数和每穗粒数，并以每个家系分离出来的的阴性单株为对照，进行统计学分析。

表135S:OsTOE1OE(OsTOE1OE)转基因的T1代阳性和阴性单株的表型统计值。

表1说明：表1中的(+)和(-)分别表示转基因阳性和阴性单株。利用t测验进行统计学分析，^a,b,c分别表示P<0.05,0.01和0.001的显著水平。