一种利用表面固定化技术发酵生产L‑乳酸的方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用表面固定化技术反复批次发酵生产L-乳酸的方法。

背景技术：

L-乳酸是合成多种手性物质的前体，在食品、医药和化妆品等方面的应用十分广泛。L-乳酸最主要的功能是可以用于合成聚乳酸的前体，聚乳酸具有与聚苯乙烯相似的光泽度和加工性能。由聚乳酸制成的产品具有很好的生物相容性，可以用于制作骨内固定物、手术缝合线和药物控释载体等医用材料；还可以替代聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯等材料生产新型环保包装材料。

目前发酵法是生产乳酸的主要方法，但高纯度L-乳酸的生产规模相对较小，传统的游离细胞发酵方式有一些不足。一方面，发酵过程大都为钙盐法中和乳酸，即采用定期添加碳酸钙作为中和剂控制pH，而且是采用发酵开始预加过量的方式，不仅pH控制的不是很准确，而且会给后续分离提取中的活性炭和纳滤膜带来很大压力。因为乳酸钙溶液中含有少量的残糖和氨基酸，在分离的沉降絮凝时会发生美拉德反应，生成水溶性黑精，使乳酸钙溶液呈黄褐色，极难去除。另一方面，传统游离细胞的分批发酵的细胞浓度低、周期长、底物转化率低、产酸率不高。同时，初始底物浓度过高，培养基灭菌后抑制菌体生长，从而使生产成本升高。

近年来越来越多的人将固定化技术应用于乳酸发酵。传统的固定化方法主要存在传质问题，到发酵后期会造成死细胞大量累积影响发酵速率。美国俄亥俄州立大学的杨尚天教授等人于1992年发明了一种新型的细胞固定化反应器——纤维床生物反应器用于固定化发酵，主要是使菌体吸附于载体表面形成高密度培养，但固定化载体单一，主要以棉织物为主，现阶段应用范围小而且仅限于实验室规模的操作，目前还没有将该固定化技术应用于L-乳酸的文献报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，提供一种利用表面固定化技术发酵生产L-乳酸的方法，以解决现有技术中L-乳酸固定化发酵产量少的问题。

一种利用表面固定化技术发酵生产L-乳酸的方法，包括如下步骤：

(1)菌种固定化：将凝结芽孢杆菌种子液接入发酵罐中，温度40～60℃、发酵液pH值为5.5～7.0、搅拌速度50～200rpm培养48～108h，最后将发酵罐中的培养物打入固定化反应器中，循环流速为30～100mL/min，循环时间为72～132h；

所述的固定化反应器中设有中空的纤维固定架，所述的纤维固定架外包裹有纤维材料，所述的纤维材料为无纺布、棉纤维、竹炭纤维中的任意一种或几种；

或者，所述的纤维固定架内填充有纤维材料，所述的纤维材料为：秸秆、甘蔗渣、玉米芯、棉纤维、麻纤维、竹纤维、无纺布、静电纺丝、活性炭纤维、细菌纤维素膜、聚乙烯醇纤维、聚砜纤维中的任意一种或几种；

(2)发酵：将发酵罐和固定化反应器中的培养基泵出，再泵入新的发酵培养基开始固定化发酵。

步骤(1)中，所述的凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌CCTCC M 2012156，该菌株的保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2012156，该菌株的详细信息已经在申请号为201210172600.7的中国专利中详细公开。

步骤(1)中，发酵培养基为玉米淀粉120～180g/L，酵母膏12～18g/L，七水硫酸镁0.5～1g/L，蛋白胨0.5～1g/L，无水乙酸钠3～5g/L。

所述的发酵培养基利用如下方法配置：

将玉米淀粉溶于水中，加入液化酶，处理50～100min，然后加入酵母膏、七水硫酸镁、蛋白胨、无水乙酸钠，加入糖化酶，处理10～300min。所述的糖化酶购自诺维信，所述的液化酶为苏宏牌α淀粉酶。

其中，所述糖化酶的处理温度为80～100℃，所述液化酶的处理温度为40～60℃。

步骤(2)中，固定化发酵方式为单批补料发酵、补料分批发酵或同步糖化发酵中的任意一种。

有益效果：

本发明具有如下优势：

(1)本发明不使用碳酸钙作为中和剂，而是通过中间流加氨水等液体碱性物质，中和不断产生的乳酸，维持发酵所需要的适宜酸度，避免了在发酵结束时会形成高浓度的乳酸钙固体，从而给后续分离提取中的活性炭和纳滤膜带来很大压力，造成下罐困难，清洗、取样不便。同时利用氨水作为中和剂在后期分离中产生的NH4SO4有较高的经济利用价值，可以提高L-乳酸生产链的经济效益。

(2)固定化反应器中细胞吸附于纤维材料表面，很大程度上提高了细胞密度，而纤维材料作为固定化载体具有高空隙率和比表面积的特点，使其传质效率明显高于传统固定化方式，可以有效避免固定化后期堵塞的问题。

(3)改进优化了纤维材料的固定方式，避开传统的铁丝网+纤维+铁丝网三明治形式的固定方式，将纤维材料直接缝接在特定的支架上或者是填充在分三层设计的钢丝网槽中，增加了发酵液中的菌体与纤维材料的接触面积，利于发酵液中的菌体更好地吸附在纤维材料上。

(4)在反复批次过程中，通过分批补料和同步糖化发酵控制较低浓度的碳源，可以减小底物抑制，提高底物利用率和发酵效率。

(5)利用表面固定化技术进行反复批次发酵的特点在于每一批次结束后不需要保留发酵液作为下一批次的种子液，而是直接利用纤维材料固定的菌体直接进行发酵，上一批次发酵过程中纤维床反应器固定菌体可以直接作为下一批次发酵的种子，略去了种子培育的时间，极大地节省了种子培养的时间和劳动力。

(6)本发明的单批发酵与传统的单批游离细胞发酵相比，发酵速率提高了0.62～0.88g/L/h，发酵时间由144～168h缩短至72～132h，产物得率(乳酸产量/葡萄糖消耗)提高了1.74％～15.42％(w/w)。

附图说明

图1是将纤维材料固定于不锈钢支架构成细胞固定化载体的一种方式的示意图。

图2是将纤维材料固定于不锈钢支架构成细胞固定化载体的另一种方式的示图。

图3为固定化反应器系统发酵生产L-乳酸的示意图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

如图1和图2展示了两种不同的纤维固定架结构，图1中在中间的支撑杆上360°错落焊接带有小孔的不锈钢铁片，将纤维材料如无纺布、棉纤维、竹炭纤维等是通过小孔绕一圈缝接在不锈钢铁片上。

图2是将不锈钢丝网槽焊接在四根细不锈钢管上并附有不锈钢丝网盖子，将纤维材料如玉米芯、秸秆颗粒、甘蔗渣等填充在分三层的不锈钢网槽内。

图1～3中，1表示不锈钢支架；2表示不锈钢铁片上的小孔；3表示纤维材料；4表示焊有网槽的不锈钢支架；5表示可拆卸的不锈钢丝网盖子；6表示恒温水浴锅；7表示固定化反应器(内有固定化载体)；8表示发酵罐；9表示发酵罐控制箱；10表示磁力搅拌桨；11表示pH电极；12表示温度电极；13表示碱液瓶；14表示补料瓶；15表示氮气入口；16表示尾气出口；17表示蠕动泵；18表示蠕动泵。

以下各实施例中的分析方法如下：

(1)生物量的测定：

将发酵液样品稀释，用尤尼柯7200分光光度计于600nm处测量其吸光度，其吸光度OD600与每升的细胞干重(DW/L)的转化值为:1OD600＝0.436g DW/L。

(2)乳酸和葡萄糖含量的测定：

将各发酵液样品进行离心，测定菌体干重，取上清稀释后，采用Agilent1260高效液相色谱仪测定L-乳酸含量(HPLC)。色谱柱为日本住友公司的Sumichiral OA-5000(150×4.6mm)，柱温30℃，检测器为紫外检测器，检测波长：254nm，流动相为95％的2mM的Cu2SO4水溶液和5％的异丙醇溶液的混合物；流速1mL/min；进样量：10μL。

(3)L-乳酸光学纯度测定：手性分离柱Sumichiral OA-5000(150×4.6mm I.D.,Sumika chemical Analysis Service,Osaka,/Japan)，95％的2mM的Cu2SO4水溶液和5％的异丙醇溶液的混合物作为流动相，流速：1ml/min，紫外检测器，检测波长：254nm，操作温度：30℃，L-乳酸标品购于Sigma-Aldrich公司。

实施例1：

本实施例以玉米淀粉为原料，采用同步糖化发酵的补料形式进行固定化反复批次发酵，方法步骤如下：

平板培养基(g/L)：葡萄糖5g/L，酵母膏3g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，七水硫酸镁0.5g/L，碳酸钙3g/L；

发酵培养基(g/L)：玉米淀粉150g/L，酵母膏15g/L，七水硫酸镁0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，无水乙酸钠3g/L。

(1)平板培养：将冻存保藏的菌株接种到平板培养基上，恒温培养箱中50℃静置培养48h活化。

(2)种子培养：从活化的平板挑取菌体接入100ml种子培养基中，50℃下100rpm培养24h形成一级种子液。再将一级种子液转接于装有500ml种子培养基中，接种量8％，50℃下150rpm培养24h形成二级种子液。

(3)固定化反复批次发酵：

①固定化反应体系的构建：将麻纤维3固定在不锈钢支架1外围(如图1所示)放入带夹套的不锈钢柱中构建固定化反应器7，固定化反应器通过循环管路与发酵罐8相连(如图3所示)，发酵罐的调控系统9和循环管路保证固定化反应器的液体混匀以及调控反应器的pH，并且在固定化反应器的夹套内通过蠕动泵18循环通入由恒温水浴锅控温6的水以控制反应器的温度。

②发酵培养基的预处理：将玉米淀粉用液化酶90℃液化80min后加入糖化酶以及灭过菌的其他发酵培养基成分，打入发酵罐。

③固定化过程：将培养至对数期(培养时间24h)的种子液接入装有发酵培养基的发酵罐，接种量10％，发酵罐内的工作体积为4L，培养温度50℃，搅拌速度100rpm，并流加NaOH将pH控制在6.0，培养28h至菌悬液吸光度(OD600)达到10.0左右，通过蠕动泵17将发酵罐中的培养基打入固定化反应器，将循环流速设置为30mL/min，在FBB反应器内开始菌体的固定化过程，这个过程进行72h。

④反复批次发酵过程：固定化过程结束之后将发酵罐和固定化反应器中的培养基泵出，通过蠕动泵将含有新鲜发酵培养基打入发酵罐，然后开启循环管路的蠕动泵，将循环流速设置为80mL/min，利用固定化反应器内麻纤维固定的菌体发酵生产L-乳酸，当残糖浓度低于10g/L时，放出发酵罐和固定化反应器内的料液(保留麻纤维)，然后将新鲜的发酵培养基通过蠕动泵打入发酵罐并且通过循环管路与固定化反应器接通，开始反复批次发酵的第二批发酵，共进行了3个批次的发酵。HPLC检测结果见表1。

表1 同步糖化发酵结果

实施例2：

本实施例以单批补料的形式进行固定化反复批次发酵，具体方法步骤如下：

平板培养基和种子培养基同实施例1。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖150g/L，酵母膏15g/L，七水硫酸镁0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，无水乙酸钠3g/L。

(1)平板培养：同实施例1；

(2)种子培养：同实施例1；

(3)固定化反复批次发酵：

①固定化反应体系的构建：将玉米芯填充在带有网槽的不锈钢支架4内放入带夹套的不锈钢柱中构建固定化反应器，其他步骤同实施例1的步骤①。

②固定化过程同实施例1的步骤③。

③反复批次发酵过程：固定化过程结束之后将发酵罐和固定化反应器中的培养基泵出，通过蠕动泵将高糖浓度的新鲜发酵培养基打入发酵罐，然后开启循环管路的蠕动泵，将循环流速设置为80mL/min，利用固定化反应器内玉米芯固定的菌体发酵生产L-乳酸，通过流加氨水将pH控制在5.8，当残糖浓度低于10g/L时，放出发酵罐和固定化反应器内的料液(保留玉米芯)，然后将新鲜的发酵培养基通过蠕动泵打入发酵罐并且通过循环管路与FBB反应器接通，开始反复批次发酵的第二批发酵，共进行了5个批次的发酵。HPLC检测结果见表2。

表2 单批补料发酵结果

实施例3：

本实施例以玉米淀粉水解糖液为原料，采用补料分批的形式进行固定化反复批次发酵，具体方法步骤如下：

平板培养基和种子培养同实施例1。

发酵培养基(g/L)：玉米淀粉水解糖液60g/L，酵母膏15g/L，七水硫酸镁0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，无水乙酸钠3g/L。

(1)平板培养：同实施例1；

(2)种子培养：同实施例1；

(3)固定化反复批次发酵：

①固定化反应体系的构建：将活性炭纤维固定在不锈钢支架外围放入带夹套的不锈钢柱中构建固定化反应器，其他步骤同实施例1的步骤①。

②发酵培养基的预处理：将玉米淀粉用液化酶90℃液化80min后用糖化酶60℃处理250min，得到玉米淀粉水解糖液，然后加入灭过菌的其他发酵培养基成分，打入发酵罐。

③固定化过程同实施例1的步骤③。

④反复批次发酵过程：固定化过程结束之后将发酵罐和固定化反应器中的发酵培养基泵出，通过蠕动泵将含有低浓度玉米淀粉水解糖液的新鲜发酵培养基打入发酵罐，然后开启循环管路的蠕动泵，将循环流速设置为70mL/min，利用固定化反应器内活性炭纤维固定的菌体发酵生产L-乳酸，当残糖浓度低于10g/L时进行补料(只补加玉米淀粉水解糖液60g/L，培养基其他成分不补加)，每一批都补加两次。当糖耗大于135g/L时，放出发酵罐和固定化反应器内的料液(保留活性炭纤维)，然后将新鲜的发酵培养基通过蠕动泵打入发酵罐并且通过循环管路与固定化反应器接通，开始反复批次发酵的新一批的发酵。共进行5个批次的发酵，HPLC检测结果见表3。

表3 玉米淀粉水解糖液为原料进行补料分批发酵结果

实施例4：

本实施例以葡萄糖为原料，采用补料分批的形式进行固定化反复批次发酵，具体方法步骤如下：

平板培养基和种子培养基同实施例1。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖60g/L，酵母膏7g/L，七水硫酸镁0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，无水乙酸钠3g/L。

(1)平板培养：同实施例1；

(2)种子培养：同实施例1；

(3)固定化反复批次发酵：

①固定化反应体系的构建：将甘蔗渣填充在带有网槽的不锈钢支架内放入带夹套的不锈钢柱中构建固定化反应器，其他步骤同实施例1的步骤①。

②固定化过程同实施例1的步骤③。

③反复批次发酵过程：固定化过程结束之后将发酵罐和固定化反应器中的培养基泵出，通过蠕动泵将含有低浓度葡萄糖的新鲜发酵培养基打入发酵罐，然后开启循环管路的蠕动泵，将循环流速设置为90mL/min，利用固定化反应器内甘蔗渣固定的菌体发酵生产L-乳酸，当残糖浓度低于10g/L时进行补料(只补加葡萄糖60g/L和酵母膏7g/L，培养基其他成分不补加)，每一批都补加两次。当糖耗大于135g/L时，放出发酵罐和FBB反应器内的料液(保留甘蔗渣)，然后将新鲜的发酵培养基通过蠕动泵打入发酵罐并且通过循环管路与FBB反应器接通，开始反复批次发酵的新一批的发酵。共进行5个批次的发酵，HPLC检测结果见表4。

表4 以葡萄糖为原料采用补料分批发酵结果

实施例5：

本实施例以玉米淀粉为原料，采用同步糖化发酵的补料形式进行固定化反复批次发酵，方法步骤如下：

平板培养基和种子培养基同实施例1。

发酵培养基(g/L)：玉米淀粉150g/L，酵母粉15g/L，七水硫酸镁0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，无水乙酸钠3g/L。

(1)平板培养：同实施例1；

(2)种子培养：同实施例1；

(3)固定化反复批次发酵：

①固定化反应体系的构建：将秸秆填充在带有网槽的不锈钢支架内放入带夹套的不锈钢柱中构建固定化反应器，其他步骤同实施例1的步骤①。

②发酵培养基的预处理同实施例1的步骤②。

③固定化过程同实施例1的步骤③。

④反复批次发酵过程：固定化过程结束之后将发酵罐和固定化反应器中的培养基泵出，通过蠕动泵将新鲜发酵培养基打入发酵罐，然后开启循环管路的蠕动泵，将循环流速设置为100mL/min，利用固定化反应器内秸秆固定的菌体发酵生产L-乳酸，当残糖浓度低于10g/L时，放出发酵罐和固定化反应器内的料液(保留秸秆)，然后将新鲜的发酵培养基通过蠕动泵打入发酵罐并且通过循环管路与固定化反应器接通，开始反复批次发酵的新一批的发酵。共进行8个批次的发酵，HPLC检测结果见表5。

表5 以玉米淀粉为原料采用同步糖化发酵结果

实施例6：

本实施例是传统的单批游离细胞发酵，具体方法步骤如下：

平板培养基和种子培养基同实施例1。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖150g/L，酵母膏15g/L，七水硫酸镁0.5g/L，蛋白胨0.05g/L，无水乙酸钠3g/L，CaCO3 70g/L。

1)平板培养：同实施例1的步骤1)

2)种子培养同实施例1的步骤1)和步骤2)。

3)传统的单批游离细胞发酵：

将培养至对数期(培养时间24h)的凝结芽孢杆菌种子液接入7.5L的发酵罐，接种量10％，发酵罐内的工作体积为4L，培养温度50℃，搅拌速度100rpm，发酵时间5天。最终乳酸产量73.93g/L，得率(乳酸产量/葡萄糖消耗)85.58％(w/w)，发酵速率0.61g/L/h，L-乳酸光学纯度99.03％。