一种利用重组微生物发酵生产1,3‑丙二醇的方法与流程

本发明属于基因工程和生物发酵技术领域，具体地说，通过单一重组微生物将可发酵糖高效生物转化为1,3-丙二醇的方法。

背景技术：

1，3-丙二醇是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、涂料、润滑剂、抗冻剂等行业，其最主要的用途是作为聚酯和聚氨酯合成的单体，特别是与对苯二甲酸聚合生成聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)。PTT与PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、PBT(聚对苯二甲酸丁二醇酯)相比具有更优良的性能，例如更好的耐污染性、韧性和回弹性以及抗紫外性能等，此外还具有耐磨、吸水性低、低静电等优点。因此PTT被认为是PET的升级产品，具有广阔的市场前景。

目前，1，3-丙二醇的生产方法主要包括化学法和生物法。化学法通常是以环氧丙烷或者丙烯为原料通过复杂的催化过程合成1，3-丙二醇。化学合成法的缺点是副产物多，选择性差，操作条件需高温高压，设备投资巨大，原料为不可再生资源。因此，化学法生产1，3-丙二醇的工艺技术路线目前基本已经淘汰。

生物法生产1，3-丙二醇目前主要包含两条技术路线：一、以甘油为原料利用天然微生物生产1，3-丙二醇；二、以葡萄糖为原料利用重组微生物生产1，3-丙二醇。具体介绍如下。

一种是以甘油为原料利用天然微生物生产1，3-丙二醇。自然界存在天然的微生物，如克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、丁酸梭状芽胞杆菌(Clostridium butyricum)及弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)可以在厌氧或者微氧的条件下将甘油转化为1，3-丙二醇，其代谢途径主要包括两步反应，第一步：甘油在甘油脱水酶的作用下脱水生成3-羟基丙醛，第二步：3-羟基丙醛在1，3-丙二醇脱氢酶的催化下还原成1，3-丙二醇。其中甘油脱水酶由3个亚基构成，其编码基因为dhaBCE(或者dhaB123)。甘油脱水酶在催化甘油脱水的过程中会自动失活，需要在激活因子的作用下重新被激活。甘油脱水酶激活因子的编码基因为dhaG和dhaH。同时自然界中还存在1，2-丙二醇脱水酶及其激活因子可以催化甘油或者1,2-丙二醇的脱水，其编码基因为pduCDEGH。1，3-丙二醇脱氢酶是一个NADH依赖的醇脱氢酶，其编码基因为dhaT。其他一些醇脱氢酶如大肠杆菌里yqhD基因编码的NADPH依赖的醇脱氢酶也可以催化3-羟基丙醛还原生产1，3-丙二醇。甘油在还原生成1，3-丙二醇的过程，需要消耗还原力NADH或者NADPH，这些还原力是通过甘油氧化成其他副产物如乙酸、乳酸，2，3-丁二醇等产生的。

目前，工业上利用甘油生产1，3-丙二醇的工艺主要采用克雷伯氏肺炎杆菌(如中国专利CN 200810105722.8)。这个工艺路线的主要缺点是：一、克雷伯氏肺炎杆菌为条件致病菌，其生产过程中生物安全性需要严格控制；二、大量副产物如乙酸、乳酸，丁二酸，2，3-丁二醇的合成，使得整个后提取过程变得十分复杂；三、1，3-丙二醇的得率低，通常1，3-丙二醇对甘油的质量得率低于40％。

现有技术中还有一种是以葡萄糖为原料利用重组大肠杆菌生产1，3-丙二醇的方法。自然界不存在可以直接转化葡萄糖生成1，3-丙二醇的微生物。杜邦公司通过在大肠杆菌内外源表达来自酿酒酵母的甘油合成途径(甘油3-磷酸脱氢酶及甘油3-磷酸酶)和来自克雷伯氏肺炎杆菌的甘油脱水酶及其激活因子并利用大肠杆菌自身的NADPH依赖的醇脱氢酶YqhD，实现了从葡萄糖到1，3-丙二醇的一步转化(CN 200380104657.2)。这一工艺路线的缺点是大肠杆菌是生物安全性较差，大肠杆菌的发酵培养需要使用昂贵的原料酵母粉，因此该技术不利于产业化规模化生产。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种生物安全度高、产量高、操作简便且成本低廉的利用重组微生物发酵生产1,3-丙二醇的方法，以克服现有技术的不足。

本发明提出的1,3-丙二醇合成途径如图1所示。葡萄糖或者蔗糖等可发酵糖通过糖酵解途径产生磷酸二羟基丙酮，后者在磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶催化下生成二羟基丙酮，后者进一步在甘油脱氢酶的催化下合成成甘油。甘油在甘油脱水酶及醇脱氢酶的作用下最终生成1,3-丙二醇。该途径不同于杜邦公司采用的1,3-丙二醇合成方法，主要区别是杜邦公司通过表达甘油3-磷酸脱氢酶及甘油3-磷酸脂酶来合成中间产物甘油，而本发明提出的途径可以在不同微生物里实现从葡萄糖到1,3-丙二醇的合成。

本发明提供的一种利用重组微生物发酵生产1,3-丙二醇的方法，包括以下步骤：

(1)构建能够过表达磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶、甘油脱氢酶、甘油脱水酶及其激活因子、醇脱氢酶的重组微生物；

(2)以含可发酵糖的原料为底物进行好氧发酵。

本发明的方法中，所述重组微生物的构建方法为：1)构建分别能够过表达磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶和甘油脱氢酶的重组菌或重组质粒；2)构建构建分别能够过表达甘油脱水酶及其激活因子和醇脱氢酶的重组菌或重组质粒；3)将步骤1)获得的重组质粒电转化入步骤2)获得的重组菌中，或将步骤2)获得的重组菌电转化入步骤1)获得的重组菌中，筛选获得能够过表达磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶、甘油脱氢酶、甘油脱水酶及其激活因子、醇脱氢酶的重组微生物。

所述的微生物为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母。

本发明利用谷氨酸棒杆菌作为宿主微生物来构建1,3-丙二醇的合成途径。谷氨酸棒杆菌是一种食品安全级的微生物，广泛应用于氨基酸的生产，比如谷氨酸和赖氨酸的生产。利用谷氨酸棒杆菌来发酵生产1,3-丙二醇解决了生物安全性的问题。

本发明所述磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶来源于谷氨酸棒杆菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述甘油脱氢酶来源于大肠杆菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，本发明的磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶hdpA获得方法是：以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组为模板，以hdpA-F(cagctatgaccatgattacgATAAGGCTGATTAGCGGGAAAATTTCG)和hdpA-R(CCAGTCGTGTCTAGTCAGTGAACTGCTGCTCATCT)为引物进行PCR，获得hdpA基因(hdpA基因序列如SEQ ID NO.1)约0.9kb并进行PCR产物纯化。

本发明的甘油脱氢酶gldA以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，以gldA-F(CACTGACTAGACACGACTGGAATGCCGC)和gldA-R(atccccgggtaccgagctcgttaTTCCCACTCTTGCAGGAAACGC)为引物进行PCR，获得gldA基因(gldA基因序列如SEQ ID NO.2)约1.2kb并进行PCR产物纯化。

优选地，所述甘油脱水酶及其激活因子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，甘油脱水酶及其激活因子来源于克雷伯氏肺炎杆菌。

在本发明的实施例中，甘油脱水酶及其激活因子是以克雷伯氏肺炎杆菌HR526的基因组为模板，以pdu-F(CGCCCGCtaaAAGGAGATATACCATGAGATCGAAAAGATTTGAAG)和pdu-R(tgcctgcaggtcgactctagTTAAGCATGGCG)为引物进行PCR，获得包括甘油脱水酶及其激活因子的pduCDEGH操纵子片段(序列如SEQ ID NO.3)并进行PCR产物纯化。

本领域技术人员应当理解，除了表达来自克雷伯氏肺炎杆菌的甘油脱水酶外，表达其他来源的甘油脱水酶同样可以实现相同的功能。

本发明的利用重组微生物发酵生产1,3-丙二醇的方法中，所述醇脱氢酶来自大肠杆菌或肺炎克雷伯菌。

在本发明的一个实施例中，醇脱氢酶yqhD的制备方法是，以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，以引物yqhD-F(ctatgacatgattacgaattAAGGAGATATACCatgAACAACTTTAATCTGCAC)和yqhD-R(ATATCTCCTTttaGCGGGCGGCTTCG)为引物进行PCR，获得醇脱氢酶基因yqhD片段(序列如SEQ ID NO.3所示)并进行纯化。

本发明的利用重组微生物发酵生产1,3-丙二醇的方法中，步骤(2)所述含可发酵糖的原料为糖蜜，蔗糖、葡萄糖、淀粉水解液、玉米浆、木糖、木质纤维素水解液或甘油。

步骤(2)的发酵条件为，28-35℃，pH值5-8，溶氧值10％。可通过流加氨水控制发酵体系的pH值。

优选地，发酵温度为30-32℃，pH值为6-7。

发酵培养基包含糖，KH₂PO₄，MgSO₄，MnSO₄，FeSO₄,玉米浆，(NH₄)₂SO₄，盐酸硫胺素，维生素B12。

本发明的利用重组微生物发酵生产1,3-丙二醇的方法还包括发酵过程中流加碳源，以及发酵培养基中含有硫胺素和维生素B12。

上述方法在提高1,3-丙二醇产量中的应用属于本发明的保护范围。

本发明通过在谷氨酸棒杆菌中过表达内源的磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶基因hdpA来强化磷酸二羟基丙酮脱磷酸生成二羟基丙酮，引入外源的甘油脱氢酶将二羟基丙酮转化成甘油，甘油在外源的甘油脱水酶及其激活因子以及醇脱氢酶的作用下最终生成1,3-丙二醇。谷氨酸棒杆菌能够利用不同的廉价原料进行发酵，还可以使用廉价的玉米浆作为营养成分替代昂贵的酵母粉，可以进一步降低原料的成本，同时解决了生物安全性以及菌株对底物与产物的耐受性问题。发酵过程中的菌体可以作为产品，用在饲料添加剂当中。本发明方法操作简单，成本低廉，1,3-丙二醇得率高，副产物少，有利于进一步简化1,3-丙二醇的分离过程。

附图说明

图1为本发明利用重组微生物发酵葡萄糖生产1,3-丙二醇方法的流程图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1过表达磷酸二羟基丙酮磷酸酯酶基因和来源于大肠杆菌的甘油脱氢酶基因gldA

以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组为模板，以引物hdpA-F(cagctatgaccatgattacgATAAGGCTGATTAGCGGGAAAATTTCG)和hdpA-R(CCAGTCGTGTCTAGTCAGTGAACTGCTGCTCATCT)为引物进行PCR，获得hdpA基因(hdpA基因序列如SEQ ID NO.1)约0.9kb并进行PCR产物纯化。

以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，以引物gldA-F(CACTGACTAGACACGACTGGAATGCCGC)和gldA-R(atccccgggtaccgagctcgttaTTCCCACTCTTGCAGGAAACGC)为引物进行PCR，获得gldA基因(gldA基因序列如SEQ ID NO.2)约1.2kb并进行PCR产物纯化。

将大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pEC-K18mob2(Journal of Biotechnology 104(2003)287-299)用EcoRI进行酶切，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将hpdA片段和gldA片段一步连接到pEC-K18mob2上，获得的重组质粒命名为pEC-hdpA-gldA。

利用电穿孔仪(伯乐)将pEC-hdpA-gldA通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中，电击条件为电压2.5KV，电阻600Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。在含25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得重组菌，命名为C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA。

实施例2过表达来源于克雷伯氏肺炎杆菌的甘油脱水酶及其激活因子pduCDEGH和来自大肠杆菌的醇脱氢酶基因yqhD

以克雷伯氏肺炎杆菌HR526的基因组为模板，以引物pdu-F(CGCCCGCtaaAAGGAGATATACCATGAGATCGAAAAGATTTGAAG)和pdu-R(tgcctgcaggtcgactctagTTAAGCATGGCG)为引物进行PCR，获得包括甘油脱水酶及其激活因子的pduCDEGH操纵子片段(序列如SEQ ID NO.3所示)并进行PCR产物纯化。

以大肠杆菌MG1655的基因组为模板，以引物yqhD-F(ctatgacatgattacgaattAAGGAGATATACCatgAACAACTTTAATCTGCAC)和yqhD-R(ATATCTCCTTttaGCGGGCGGCTTCG)为引物进行PCR，获得醇脱氢酶基因yqhD片段(序列如SEQ ID NO.4所示)并进行纯化。

将大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXMJ19【公开于Jakoby,M.J.,Ngouto-Nkili,C.E.and Burkovski,A.Construction and application of new Corynebacterium glutamicum vectors.JOURNAL BioTechniques13,437-441(1999)】用XbaI进行酶切，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将pduCDEGH操纵子片段和yqhD片段一步连接到pXMJ19上，获得的重组质粒命名为pXMJ-yqhD-pdu。

利用电穿孔仪(伯乐)将pXMJ-yqhD-pdu通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA中，电击条件如实施例1所示。在含5mg/L的氯霉素和25mg/L的卡那霉素LB平板上筛选获得重组菌，命名为C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA/pXMJ-yqhD-pdu。

实施例3重组谷氨酸棒杆菌的发酵培养

将谷氨酸棒杆菌野生菌株ATCC13032以及实施例1制得的重组菌株C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA，实施例3制得的重组菌C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA/pXMJ-yqhD-pdu在LB平板上过夜培养。从该新鲜平板上单菌落接种到含有30ml种子培养基的250ml带档板摇瓶中，32℃，200rpm培养12小时。

种子培养基的配方包括(g/L)：葡萄糖25，(NH₄)₂SO₄ 5.0,K₂HPO₄ 1.5,MgSO₄ 1.0,MnSO₄ 0.005,FeSO₄ 0.005,玉米浆30，卡那霉素0.025。

以10％的接种量将种子液接种到2L发酵培养基当中，发酵采用5L的发酵罐，控制温度为32℃，通气量为1vvm，调整转速使得溶氧水平保持在10％以上，通过流加氨水控制pH值稳定在7.0左右。

发酵培养基配方包括(g/L)：葡萄糖100，(NH₄)₂SO₄ 30.0,K₂HPO₄2.5,MgSO₄ 1.0,MnSO₄ 0.010,FeSO₄ 0.010,玉米浆15，生物素0.0005,盐酸硫胺素0.005，维生素B12 0.005。

发酵48小时，利用高效液相色谱检测发酵产物野生菌株ATCC13032不产甘油以及1,3-丙二醇，C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA产52g/L的甘油但不产1,3-丙二醇。C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA/pXMJ-yqhD-pdu产32g/L的1,3-丙二醇，得率达到每克葡萄糖产0.32g 1,3-丙二醇。发酵中没有产生甲酸、丁二酸、2,3-丁二醇等副产物，相对其他工艺来讲，便于后续的提纯工艺。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学

<120> 一种利用重组微生物发酵生产1,3-丙二醇的方法

<130> KHP171111659.2

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 828

<212> DNA

<213> hdpA

<400> 1

atgacagtga acatttcata tctgaccgac atggacggcg tcctcatcaa agagggcgag 60

ataattccgg gtgcagatcg ttttcttcag tctctcaccg ataacaatgt ggagtttatg 120

gttttgacca acaactccat tttcaccccg agggatcttt ctgcacgtct taagacttcc 180

ggtttggaaa tcccgccgga gcgtatttgg acttctgcaa ccgccactgc tcacttcctg 240

aaatcccagg tcaaggaggg cacagcctat gttgttggcg agtccggtct gaccactgcg 300

ttgcataccg cgggttggat tttgacggat gcaaatcctg agtttgttgt cctgggcgaa 360

acccgcacat attccttcga ggcaatcact actgcgataa atctgatttt gggtggcgct 420

cgctttattt gcaccaaccc ggatgtcact ggaccttcac caagtggcat tttgcctgct 480

actggctctg tcgccgcact tattaccgca gctactggcg ctgagcctta ttacatcggc 540

aagccaaacc ctgtgatgat gcgcagtgcg ctgaacacca tcggggcgca ttccgagcac 600

actgtcatga tcggcgaccg catggacacc gacgtgaaat ctggtttgga agccggcctg 660

agcaccgtgc tggttcgaag cggaatttcc gacgacgccg agatccgccg ctaccccttc 720

cgcccaactc acgtgatcaa ttccatcgcc gatcttgccg attgctggga cgatcctttc 780

ggtgacggtg catttcacgt accagatgag cagcagttca ctgactag 828

<210> 2

<211> 1104

<212> DNA

<213> gldA

<400> 2

atggaccgca ttattcaatc accgggtaaa tacatccagg gcgctgatgt gattaatcgt 60

ctgggcgaat acctgaagcc gctggcagaa cgctggttag tggtgggtga caaatttgtt 120

ttaggttttg ctcaatccac tgtcgagaaa agctttaaag atgctggact ggtagtagaa 180

attgcgccgt ttggcggtga atgttcgcaa aatgagatcg accgtctgcg tggcatcgcg 240

gagactgcgc agtgtggcgc aattctcggt atcggtggcg gaaaaaccct cgatactgcc 300

aaagcactgg cacatttcat gggtgttccg gtagcgatcg caccgactat cgcctctacc 360

gatgcaccgt gcagcgcatt gtctgttatc tacaccgatg agggtgagtt tgaccgctat 420

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accgctatcc cggacgcgca tcactattat cacggtgaaa aagtggcatt cggtacgctg 840

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catgcggtag gtttgccaat aactctcgct caactggata ttaaagaaga tgtcccggcg 960

aaaatgcgaa ttgtggcaga agcggcatgt gcagaaggtg aaaccattca caacatgcct 1020

ggcggcgcga cgccagatca ggtttacgcc gctctgctgg tagccgacca gtacggtcag 1080

cgtttcctgc aagagtggga ataa 1104

<210> 3

<211> 5089

<212> DNA

<213> pduCDEGH

<400> 3

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aaggagtgga ttgaagaggg ctttatcgcg atggaaagcc ctaacgatcc caaaccttct 120

atccgcatcg tcaacggcgc ggtgaccgaa ctcgacggta aaccggttga gcagttcgac 180

ctgattgacc actttatcgc gcgctacggc attaatctcg cccgggccga agaagtgatg 240

gccatggatt cggttaagct cgccaacatg ctctgcgacc cgaacgttaa acgcagcgac 300

atcgtgccgc tcactaccgc gatgaccccg gcgaaaatcg tggaagtggt gtcgcatatg 360

aacgtggtcg agatgatgat ggcgatgcaa aaaatgcgcg cccgccgcac gccgtcccag 420

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cggccggtgc gtgaagagga cgtgatcgcc attcgcaaca aagccgcccg cgcgctgcag 1260

gcggtatttg ccggcatggg tttgccgcct attacggatg aagaagtaga agccgccacc 1320

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aattaacgaa acgctgctgc gccagattat cgaagaggtg ctgtcggaga tgaaatcagg 1740

cgcagataag ccggtctcct ttagcgcgcc tgcggcttct gtcgcctctg ccgcaccggt 1800

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caccgtcatc caccagcgcg gcctgccgcc gctttccaat ctggaactct tcccgcaggc 2160

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acgcgagtcg ccgcagccgg tgccgacgct taacgatcag atggctcgtc ccaaatacca 2280

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ccagccgcgc cgacaaacga caccgttcgc cagccaaaag ttagcgacta cccgttagcg 2520

acccgccatc cggagtgggt caaaaccgct accaataaaa cgctcgatga cctgacgctg 2580

gagaacgtat taagcgatcg cgttacggcg caggacatgc gcatcactcc ggaaacgctg 2640

cgtatgcagg cggcgatcgc ccaggatgcc ggacgcgatc ggctggcgat gaactttgag 2700

cgggccgcag agctcaccgc ggttcccgac gaccgaatcc ttgagatcta caacgccctg 2760

cgcccatacc gttccaccca ggcggagcta ctggcgatcg ctgatgacct cgagcatcgc 2820

taccaggcac gactctgtgc cgcctttgtt cgggaagcgg ccgggctgta catcgagcgt 2880

aagaagctga aaggcgacga ttaacagggg gtaagcatgc gctatatcgc tggcattgat 2940

attggcaact cctcgacaga agtcgccctg gcgacggtcg atgacgcagg tgtgctgaac 3000

actcgccaca gcgcgttggc tgaaaccacg ggtataaaag gcacattacg aaatgtgttc 3060

ggtatccagg aggcgctaac gcaggcggca aaagcggccg gcattcagct cagcgatatt 3120

tcgcttattc gcattaacga agccacgccg gtcattggcg atgtggcgat ggaaaccatc 3180

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gtcggactgg gggtcggcat caccatcaca ccagaggcgc tgctgtcctg ctccgcggac 3300

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aatgcggcaa cggcagcggg ctatcagata accggcatta ttttgcagca ggatgacggc 3420

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gaccggattc cacttggcat gctggcggcc gtcgaggtcg ctttacccgg taagatcatc 3540

gaaacgctct ccaaccccta cggtattgcg accgttttcg atctcaacgc cgaggagacc 3600

aaaaatatcg tgccaatggc gcgggcgctg attggcaacc gctcggccgt ggtggtgaaa 3660

accccctccg gcgacgtcaa ggcccgcgct attccggcag gtaatctgct gctcatcgct 3720

caagggcgca gcgtacaggt tgatgtggcc gccggggcgg aagccatcat gaaagcggtt 3780

gacggctgcg gcaaactgga caacgtcgcg ggagaagcgg gcaccaatat cggcggcatg 3840

ctagagcacg tgcgccagac catggcggag cttaccaata agccagctca ggagatccgc 3900

attcaggatc tgctggccgt tgatacggcg gtgccagtca gcgtgaccgg cggtcttgcg 3960

ggggagttct cgctggagca ggcggtgggt atcgcctcga tggtcaagtc ggatcgcctg 4020

cagatggccc tcatcgcccg tgaaattgag cacaaactgc agattgcggt tcaggtgggc 4080

ggcgccgaag cggaggcggc cattcttggg gcgctcacca ctcccggcac cacgcgcccg 4140

ctggcgatcc tcgatctggg cgccgggtcg accgacgcct ccattatcaa tgcgcaggga 4200

gagatcagcg ccactcacct ggccggcgcc ggcgatatgg tcacgatgat catcgcccgc 4260

gagctggggc ttgaggaccg ctacctggcg gaagagatca aaaaatatcc gctggctaaa 4320

gtcgaaagcc tgtttcatct gcgtcatgaa gacggcagcg tccagttttt tccgtcggcc 4380

ttaccaccga cggtatttgc ccgcgtctgc gtggtgaaac cggatgaact ggttcccctg 4440

cccggcgatc tgccgctgga gaaagtgcgc gccattcgcc gtagcgccaa atcacgcgtc 4500

tttatcacca acgccctgcg agcgttacgc caggtgagcc ctaccggcaa cattcgcgac 4560

atcccgttcg tggtgctggt gggcggctcg tccctcgatt tcgagatccc ccagctggtc 4620

accgacgcgc tggcgcacta ccggctggtt gccgggcgcg gcaacatccg cggctgtgaa 4680

ggcccacgca atgcggtcgc cagcggatta ctcctttcct ggcaaaaagg aggcacacat 4740

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gaccggcggc gatcttatcc atcacgcctg gcaggcggcg cagcgttcgc cgctgcaggt 4920

aggcatcgcc tgcgaccggg aacggctcat cgtgcactac aaaaatttac ccgcatcaac 4980

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gtgaaaaaaa ccggcgttct cgatcaagtt ctggatgccc tgaaaggcat ggacgtgctg 180

gaatttggcg gtattgagcc aaacccggct tatgaaacgc tgatgaacgc cgtgaaactg 240

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tacaccctgc cgccgcgtca ggtggctaac ggcgtagtgg acgcctttgt acacaccgtg 600

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acccacctct ccgactacgg tctggacggc agctccatcc cggctttgct gaaaaaactg 1080

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atatctcctt ttagcgggcg gcttcg 26