奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测方法及试剂盒与流程

本发明涉及奶牛新孢子虫检测领域，特别涉及奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测方法及试剂盒。

背景技术：

新孢子虫是一种细胞内寄生的原生病原体，在全世界范围内流行，主要引起奶牛流产、死胎以及犬科动物的致命神经系统疾病。感染新孢子虫会导致奶牛体重和产奶量下降，从而过早被淘汰，造成重大的经济损失。1984年在挪威报道了第1例因狗感染新孢子虫引起神经肌肉病变，从而导致后肢瘫痪的病例，随后确定犬科动物是新孢子虫的终末宿主。该病原体的传播途径分为垂直传播和水平传播，而经胎盘的垂直传播是奶牛新孢子虫主要传播途径。综上，建立一种快速简便的新孢子虫检测方法显得尤为重要，用于环境评估，食品安全检测，养殖场现场诊断等，进而采取措施遏制传播。

技术实现要素：

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测方法及其检测试剂盒。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

本发明的第一个目的是提供一种奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测试剂盒。

所述试剂盒包括以下几种成分：引物、探针混合液，冻干酶，反应预混液，横向流动试纸条和pbst；

所述引物、探针混合液中引物和探针的序列各自为：

上游引物：5'-tggtagcggtgagaggtgggatacgtggtt-3'；

下游引物：5'-biotin-gcactcgccagtcaacctacgtcttctgcc-3'；

探针：5'-fam-cgtcagggtgaggacagtgtgtcaatgata[thf]ttatcgagagttcag-/c3-spacer/-3'；

所述pbst的制备方法为：将1ml的tween-20溶于1000mlpbs中，混匀即可。

进一步的，引物、探针混合液的制备方法为：将10μm上游引物2.1μl，10μm下游引物2.1μl，10μm探针0.6μl混合于4.8μl纯水中。

进一步的，所述引物和探针基于新孢子虫nc-5基因设计。

本发明的第二个目的是提供奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测方法，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的，并使用上述的奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测试剂盒，检测方法包括以下几个步骤：

(1)对新孢子虫核酸样品进行重组酶聚合酶扩增；

扩增时使用的引物、探针各自为：

上游引物：5'-tggtagcggtgagaggtgggatacgtggtt-3'；

下游引物：5'-biotin-gcactcgccagtcaacctacgtcttctgcc-3'；

探针：5'-fam-cgtcagggtgaggacagtgtgtcaatgata[thf]ttatcgagagttcag-/c3-spacer/-3'；

(2)将扩增产物滴加到横向流动试纸条加样端进行检测，判定新孢子虫阳性或阴性。

进一步的，所述步骤(1)中重组酶聚合酶扩增反应的体系为：新孢子虫核酸样品1μl，引物、探针混合液17μl，冻干酶5mg，反应预混液32μl；最优反应条件为：37℃-39℃下反应20分钟。

进一步的，所述步骤(2)中将扩增产物滴加到横向流动试纸条加样端进行检测的具体方法为：取2μl扩增产物到98μlpbst中，混匀后吸取10μl溶液滴加到测流层析试纸条的加样端，并将加样端竖直插入装有200μlpbst的离心管中，5分钟后观察结果；

进一步的，所述pbst的制备方法为：将1ml的tween-20溶于1000mlpbs中，混匀即可。

本发明的第三个目的是提供了上述奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测方法在检测新孢子虫中的应用，其特征在于：所述检测不以疾病的诊断和治疗为目的。

作为优选，所述奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸来源于新孢子虫的所有基因型及所有虫体发育阶段。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明提供的奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测方法及其检测试剂盒，是建立在分子生物学基础上的，首先基于新孢子虫nc-5基因设计了特定的引物和探针，该基因对所有的新孢子虫基因型高度保守，而又对其他病原高度特异，再应用重组酶聚合酶扩增技术联合横向流动试纸条分析的方法制备快速检测奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的试剂盒，该试剂盒具有特异性强、敏感度高、反应迅速、操作简便、结果判定简便等优点，且得到核酸样品后整个反应过程可在非实验室环境下进行，不仅适用于临床诊断，还适用于食品安全检测、养殖场现场检测、环境评估等多个领域。

附图说明

图1为本发明的试剂盒的敏感性实验结果；

图2为本发明的试剂盒的特异性实验结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1

本发明的奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的快速检测试剂盒包括：

引物、探针混合液，重组酶聚合酶扩增试剂盒(twistampnfokit，twistdx)提供的冻干酶，反应预混液(29.5μlrehydrationbuffer和2.5μl280mmmagnesiumacetate混合液)，横向流动试纸条(mileniahybridtech1strips,mileniabiotec)和pbst。

具体制备方法为：

(1)引物、探针混合液：本申请针对新孢子虫的nc-5基因引物和探针，具体核苷酸序列如下：

上游引物：5'-tggtagcggtgagaggtgggatacgtggtt-3'；

下游引物：5'-biotin-gcactcgccagtcaacctacgtcttctgcc-3'；

探针：5'-fam-cgtcagggtgaggacagtgtgtcaatgata[thf]ttatcgagagttcag-/c3-spacer/-3'；

将10μm上游引物2.1μl，10μm下游引物2.1μl，10μm探针0.6μl混合于4.8μl纯水中，得到引物、探针混合液。

(2)pbst的制备方法为：将1ml的tween-20溶于1000mlpbs中，混匀备用。

本发明的试剂盒的使用方法为：

重组酶聚合酶扩增反应体系为：新孢子虫核酸样品1μl，引物、探针混合液17μl，冻干酶5mg，反应预混液32μl；最优反应条件为：37℃–39℃下反应20分钟。

反应后吸取2μl扩增产物与98μlpbst混匀，接着吸取10μl混合液滴加到横向流动试纸条的加样端，最后将试纸条竖直插入装有200μlpbst的离心管中，5分钟后观察结果，如果试纸条为两条杠，则为新孢子虫阳性，如果为一条杠则为阴性。

实施例2具体应用实施例

应用本发明的试剂盒快速检测奶牛流产胎儿中新孢子虫核酸的方法如下：

(1)重组酶聚合酶扩增反应：

吸取1μl核酸样品，与准备好的17μl的引物和探针混合液、32μl的反应预混液一同加入到装有5mg冻干酶的离心管中，混匀。在37℃–39℃下(可以捂在手中或腋窝下)反应20分钟。

(3)扩增产物的检测：

反应后吸取2μl扩增产物与200μlpbst混匀，接着吸取10μl混合液滴加到横向流动试纸条的加样端，最后将试纸条竖直插入装有200μlpbst的离心管中，5分钟后观察结果，如果试纸条为两条杠，则为新孢子虫阳性，如果为一条杠则为阴性。

实施例3本发明的试剂盒的敏感性实验

实验过程为：将新孢子虫核酸进行重组酶聚合酶扩增反应，每个扩增反应中加入的新孢子虫dna量分别为10⁶fg，10⁵fg，10⁴fg，10³fg，10²fg，10fg，1fg。反应后按照前面提到的方法进行横向流动试纸条检测，结果显示该方法可以最少检测到反应体系中100fg的dna。

实验结果参见图1(注：对照条带的显现是为了显示试纸条功能正常，检测条带的显现表示阳性；nc为空白对照)。

实施例4本发明的试剂盒的特异性实验

实验过程为：用弓形虫，哈蒙球虫，柱状艾美尔球虫，恶性疟原虫，环形泰勒虫和双芽巴贝斯虫的dna与新孢子虫dna进行特异性分析，结果发现该试剂盒只能检测到新孢子虫dna。

实验结果参见图2(注：对照条带的显现是为了显示试纸条功能正常，检测条带的显现表示阳性)。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。