一种用于临床样本PCR检测的快速提取核酸方法与流程

本发明属于分子生物学和医学检测领域，涉及一种用于临床样本pcr检测的快速提取核酸方法，具体是指采用简便可靠的方法抽提临床样本dna，再采用荧光定量pcr方法对抽提的核酸进行检测。

背景技术：

核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要从复杂多样的生物样本中迅速有效地分离和提取所需要的基因组核酸，而且抽提后的核酸质量及其完整性都会直接影响到随后的实验结果。目前，用于临床样本pcr检测的提取核酸常用抽提方法包括：煮沸法、碱抽提法和异硫氰酸胍-柱纯化抽提法。

煮沸法是在高温条件下将细胞裂解，再结合chelex-100金属离子螯合剂提取核酸。chelex-100对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用，能够抑制核酸酶对dna的消化作用，防止了dna在煮沸过程中的降解,这样的处理过程既达到了分离提取dna的目的。但是，煮沸法易发生蹦盖现象，造成交叉污染，且杂质较多，影响pcr的扩增。

异硫氰酸胍-柱纯化抽提法是用异硫氰酸胍裂解细胞后，将核酸吸附在离心柱膜上，通过加入不同洗涤试剂并反复离心，以达到核酸和杂质分离的目的，获得纯化的核酸。但此方法试剂耗材成本较高，且需要反复离心，不便于高通量、自动化操作。

碱抽提方法是用碱和十二烷基磺酸盐使细胞裂解，碱可以在保持共价闭合环状dna双链状态的同时，使高分子量染色体dna变性，十二烷基磺酸盐与细胞蛋白、破碎的细胞壁和变性的染色体dna形成复合物，离心后这些复合物沉淀，而质粒dna存在于上清中。虽然这种方法最初只适用于提取质粒dna，具有局限性。但是，经不断优化和改进，碱抽提法已广泛用于动物、植物、微生物和法医研究的各个领域。碱裂解法具有操作简便、提取速度快、通量大的特点，被认为是一种有效的dna快速提取方法。

技术实现要素：

本发明为解决传统核酸提取方法存在的缺陷，提出一种用于临床样本pcr检测的快速提取核酸的方法。为了实现本发明的发明目的，所采用的技术方案为一种用于临床样本pcr检测的快速提取核酸的方法，所述的方法包括以下步骤：

1.取少量生物样本，所述生物样本选自细菌、病毒、支原体、衣原体感染的拭子、宫颈刷或液基细胞样本。

2.取0.5ml样本加入1.5mlep管中，12000rmp离心2min。

3.小心弃上清，加入1ml生理盐水，旋涡振荡器上振荡打散沉淀(必要时用枪头轻轻打散沉淀)，12000rpm离心2-5min。

4.小心弃上清，加入50-80ul含5％-10％chelex-100、0.2-0.4mnaoh、1％-5％sds、ph＝11-13的溶液p1重悬细胞。注意：用移液枪温柔吹散沉淀细胞，盖紧管盖，温和地混合，不要剧烈震荡，溶液应变清亮。

5.加入5-10ulph＝4.8-5.7的醋酸钾溶液p2，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀(可用手指轻轻弹ep管底数次)，见白色絮状沉淀，12000rmp离心1-5min，上清液直接用于pcr反应。

其中，本发明的第一优先技术方案为，所述的加入生理盐水后离心时间为2-5min，优选4-5min；

本发明的第二优先技术方案为，所述的溶液p1的加入量为50-80ul，优选50-60ul。

本发明的第三优先技术方案为，所述的溶液p1中chelex-100的浓度为5％-10％，优选5％-8％。

本发明的第四优先技术方案为，所述的溶液p1中naoh的浓度为0.2-0.4m，优选0.2-0.3m。

本发明的第五优先技术方案为，所述的溶液p1中sds的浓度为1％-5％，优选1％-3％。

本发明的第六优先技术方案为，所述的溶液p1的的ph为11-13，优选12-13。

本发明的第七优先技术方案为，所述的溶液p2的加入量为5-10ul，优选5-8ul。

本发明的第八优先技术方案为，所述的溶液p2的ph为4.8-5.7，优选5.3-5.7。

本发明的的第九优选技术方案为，所述的加入溶液p2后离心时间为1-5min，优选1-2min。

其中，本发明的生物样本选自细菌、病毒、支原体、衣原体感染的拭子、宫颈刷和液基细胞样本。

本发明的技术优势为：

1.本发明操作简单，时间短。传统方法中需用溶菌酶裂解细胞，蛋白酶k来去除样本中的蛋白质，这个过程需耗时1-2小时，再进行柱纯化dna，离心步骤多。本发明的方法操作简单，采用碱溶液来裂解样本，使细胞膜破裂，细胞中蛋白与十二烷基磺酸钠(sds)结合，sds中钠离子与钾离子置换后生成不溶于水的十二烷基磺酸钾(pds)，从而达到分离核酸的目的。整个提取过程仅为8-10min，大大缩短了所需时间。

2.本发明操作步骤少且在同一ep管中即可完成整个提取过程，避免了操作过程中因样本转移导致的交叉污染现象，提高了检测结果的准确性。

3.本发明中使用的碱裂解法不仅用于提取细菌中dna，还可用于提取病毒、支原体、衣原体中的dna。

4.本发明使用chelex-100结合naoh，能充分裂解细胞。chelex-100本身碱性较强，能帮助naoh更好的裂解细胞，且chelex-100可以螯合一些对扩增反应有抑制作用的因子(如重金属离子)，提高了pcr扩增的效率。

附图说明

图1为具体实施方式中两种不同提取方法所提取dna的荧光定量pcr检测结果。

其中1为1号样本用宝生物的广谱型基因组dna小量纯化试剂盒提取的dna检测结果；2为1号样本用本发明方法提取的dna检测结果；3为2号样本用宝生物的广谱型基因组dna小量纯化试剂盒提取的dna检测结果；4为2号样本用本发明方法提取的dna检测结果；5为3号样本用宝生物的广谱型基因组dna小量纯化试剂盒提取的dna检测结果；6为3号样本用本发明方法提取的dna检测结果。

图2为具体实施方式中两种不同提取方法所提取dna的普通pcr产物电泳结果。

其中加样孔1：1号样本pcr产物经本发明方法浓缩后产物；加样孔2：2号样本pcr产物经本发明方法浓缩后产物；加样孔3：3号样本pcr产物经本发明方法浓缩后产物；加样孔4：1号样本pcr产物经天根普通dna产物纯化试剂盒浓缩后产物；加样孔5：2号样本pcr产物经天根普通dna产物纯化试剂盒浓缩后产物；加样孔6：dl2000dnamaker；加样孔7：3号样本pcr产物经天根普通dna产物纯化试剂盒浓缩后产物。

图3为具体实施方式中本发明方法提取的dna测序图谱。

图4为具体实施方式中宝生物的广谱型基因组dna小量纯化试剂盒提取的dna测序图谱。

具体实施方式

1.用宝生物的广谱型基因组dna小量纯化试剂盒和本发明方法提取解脲脲原体感染的尿道分泌物中的dna，分别用这两种抽提方法同时提取3个样本，平行比较。

1.1用宝生物的广谱型基因组dna小量纯化试剂盒抽提尿道分泌物中的dna。

1.1.1取200ul含尿道管分泌物的细胞保存液，加入400ul缓冲液ga。

1.1.2加入180ul的buffergl和20ulproteinasek溶液，旋涡10sec混匀，56℃放置10min。

1.1.3加入200ul缓冲液gb和200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。

1.1.4将上一步所得溶液都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(≈13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

1.1.5向吸附柱中加入已加入无水乙醇的500ulbufferwa，12,000rpm(≈13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

1.1.6向吸附柱中加入700ulbufferwb，12,000rpm(≈13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管。

1.1.7重复操作步骤7。

1.1.812,000rpm(≈13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

1.1.9将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50ul洗脱缓冲液，室温放置5min，12,000rpm(≈13,400×g)离心2min。

1.2用本发明的方法抽提尿道分泌物中的dna。

1.2.1.取500ul含尿道管分泌物的细胞保存液倒入1.5mlep管中，12000rmp离心2min。

1.2.2.小心弃上清，加入1ml生理盐水，旋涡振荡器上振荡打散沉淀(必要时用枪头轻轻打散沉淀)，12000rpm离心5min。

1.2.3.小心弃上清，加入50ul含5％chelex-100、0.2mnaoh、1％sds、ph＝13的溶液p1重悬细胞。注意：用移液枪温柔吹散沉淀细胞，盖紧管盖，温和地混合，不要剧烈震荡，溶液应变清亮。

1.2.4.加入5ulph＝5.5的醋酸钾溶液p2，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀(可用手指轻轻弹ep管底数次)，见白色絮状沉淀，12000rmp离心1min，上清液直接用于pcr反应。

2.dna鉴定方法

选择解脲脲原体基因的taqman探针和引物，用荧光定量pcr方法和普通pcr产物测序两种方法同时检测上述两种不同提取方法所提取dna。所有引物和探针由primerexpress3.0软件设计，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物探针信息如下：

用于荧光定量pcr方法检测解脲脲原体基因的上游引物为5’-tgtcaggatcatcaaatcaattcac-3’(seqidno:1)；

用于荧光定量pcr方法检测解脲脲原体基因的下游引物为5’-agtgsaaatgtgatccaacttgg-3’(seqidno:2)；

用于荧光定量pcr方法检测解脲脲原体基因的探针为5’-fam-caggagcaattaacttcgctgaaggcg-bhq1-3’(seqidno:3)；

用于普通pcr产物测序方法检测解脲脲原体基因的上游引物为5’-atgaagaatctgtgggaggtgg-3’(seqidno:4)；

用于普通pcr产物测序方法检测解脲脲原体基因的下游引物为5’-aatcgtcgcattccctatgct-3’(seqidno:5)。

2.1荧光定量pcr检测

pcr体系：10×pcrbuffer5ul，25mmmgcl26ul，25mmdntp0.8ul，10um上游引物1.25ul，10um下游引物1.25ul，10um探针0.5ul，5u/ul热启动dna聚合酶0.8ul，去离子灭菌水补足到50ul。

pcr扩增检测反应条件：37℃5min；95℃5min；95℃15s，60℃60s,40cycles。

2.2普通pcr产物测序检测

pcr体系：10×pcrbuffer5ul，25mmmgcl26ul，25mmdntp0.8ul，10um上游引物1.25ul，10um下游引物1.25ul，5u/ul热启动dna聚合酶0.6ul，去离子灭菌水补足到50ul。

pcr扩增检测反应条件：37℃5min；95℃5min；95℃15s，60℃30s，72℃30s，40cycles；72℃7min。

pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳，50v，30分钟。在凝胶成像仪的紫外灯下，拍下样本在琼脂糖凝胶上的迁移位置图片，结果如图2所示。同时将pcr产物送苏州金唯智生物科技有限公司测序，ncbiblast在线比对测序结果与目的基因的同源性，并观察测序图谱的质量。本发明方法提取的dna测序结果见图3，宝生物的广谱型基因组dna小量纯化试剂盒抽提的dna测序结果见图4。

3.结果分析结果分析

通过对提取产物dna的荧光pcr检测可发现，图1中2、4、6分别比1、3、5的ct值小。经分析，由于该方法提取后的dna浓度较高，且本方法提取的dna中干扰pcr的杂质较少，因此该方法提取产物的扩增检测ct值均小于宝生物的广谱型基因组dna小量纯化试剂盒提取产物dna的扩增检测ct值。由此可得，本发明方法提取的dna能用于临床样本的荧光定量pcr检测。

图2中经两种方法提取的dna普通pcr产物电泳条带大小和亮度均相似。由图3和图4可知，两种方法提取的dna测序图谱质量相同，且序列经比对后，与目的序列同源性均大于98％。由此证明，两种dna提取方法所提取的dna均能用于临床样本的普通pcr产物测序检测。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

sequencelisting

<110>江苏睿玻生物科技有限公司

<120>一种简单快速提取核酸方法

<130>20170321

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tgtcaggatcatcaaatcaattcac25

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

agtgsaaatgtgatccaacttgg23

<210>3

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

caggagcaattaacttcgctgaaggcg27

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

atgaagaatctgtgggaggtgg22

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

aatcgtcgcattccctatgct21