一种用于检测半胱氨酸的荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于荧光检测技术领域，具体涉及一种用于检测半胱氨酸的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，是组成蛋白质的20多种氨基酸中唯一具有还原性基团巯基(-sh)的氨基酸。医学研究表明半胱胺酸与很多疾病有关，比如肾功能衰竭、老年痴呆症等，它们在生物体内的含量变化可以作为这些疾病诊断的依据，因此开发选择性地检测半胱氨酸的检测方法尤其重要。

目前测定氨基酸含量的方法有很多，如比色法、碘量法、酶循环法、毛细管电泳法和hplc法等，这些方法各有优点，但也都有不足之处。

比色法是以生成有色化合物的显色反应为基础的，一般包括两个步骤：首先是选择适当的显色试剂与待测组分反应，形成有色化合物，然后再比较或测量有色化合物的颜色深度，在此过程中，溶液的酸度、显色剂的用量、温度、溶剂等对显色反应都有影响，测量的灵敏度和准确度较差；

碘量法是氧化还原滴定法中，应用比较广泛的一种方法，但对样品溶液的酸度和温度反应敏感，不易操作；

酶循环法是利用酶的底物特异性来放大被测物质的测定方法，但使用的工具酶用量大，成本较高；

毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法，毛细管直径小，使光路太短，灵敏度较低，而且电渗会因样品组成而变化，进而影响分离的重现性，这些弊端都会导致疾病诊断的误差；

hplc法准确性高，样品处理简单，但受色谱柱局限，且耗费时间很长。

而荧光探针检测法以无损、可视化原位检测等优点备受研究者重视，但是能够与半胱氨酸特异性响应的荧光探针尚未见报道。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种用于检测半胱氨酸的荧光探针及其制备方法和应用。

本发明采用如下技术方案：

一种用于检测半胱氨酸的荧光探针，所述荧光探针的结构式如下：

上述用于检测半胱氨酸的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)取4-溴-1,8-萘二甲酸酐与正丁胺反应得到化合物1，其结构式如下：

(2)以铜盐作催化剂，将步骤(1)所得化合物1与甲醇钠反应得到化合物2，其结构式如下：

(3)将步骤(2)所得化合物2与浓hbr反应得到化合物3，其结构式如下：

(4)将步骤(3)所得化合物3与六次甲基四胺和多聚甲醛反应得到化合物4，其结构式如下：

(5)将化合物4与tcf和乙酸铵反应得到化合物5，其结构式如下：

其中，tcf(2-(2-cyano-3,4,4-trimethylcyclopent-2-en-1-ylidene)malononitrile)的结构式如下：

tcf的具体合成方法如下：将1g乙醇钠溶解在10-15ml无水乙醇中，室温下加入9g3-羟基-3-甲基-2丁酮(市售购得)与12g丙二腈，搅拌1-2h后，加入30ml无水乙醇，加热回流反应1-3h，冷却后，置于冰箱中冷冻过夜，抽滤得固体，2-5ml冰乙醇洗涤后，干燥得到灰白色固体10-13g，即为tcf，不经纯化可直接用于下一步反应。

(6)将化合物5与丙烯酰氯反应即得所述荧光探针。

优选地，所述步骤(1)的具体合成方法如下：将摩尔比为1：6的4-溴-1,8-萘二甲酸酐与正丁胺加入到乙醇中，氮气保护下回流反应至反应液澄清，浓缩后冷却析出晶体，乙醇重结晶后即得所述化合物1。

优选地，所述步骤(2)的具体合成方法如下：取步骤(1)所得化合物1溶于甲醇中，然后加入甲醇钠和硫酸铜，回流反应11-15h后，浓缩后冷却析出晶体，去离子水洗涤后即得化合物2；

化合物1与甲醇钠的摩尔比为1：8-12。

优选地，所述步骤(3)的具体合成方法如下：将步骤(2)所得化合物2约1.0-2.0g加入到20-40ml浓hbr中，回流反应12-24h后，冷却后过滤，乙醚洗涤后即得化合物3。

优选地，所述步骤(4)的具体合成方法如下：将步骤(3)所得化合物3、六次甲基四胺和多聚甲醛加入到乙酸中，回流反应1-3h后，降温至80-90℃并加入过量浓盐酸继续反应35-40min，冷却，去离子水稀释，过滤取滤液，二氯甲烷萃取得粗产品，所得粗产品利用柱色谱分离，得到所述化合物4；

化合物3与六次甲基四胺的摩尔比为1：1-1.5；六次甲基四胺和多聚甲醛的质量比为1：1-1.5。

优选地，所述步骤(5)的具体合成方法如下：将步骤(4)所得化合物4、tcf和乙酸铵加入混合溶剂中，避光搅拌反应22-24h，反应结束后将反应液旋蒸，然后柱色谱分离得到所述化合物5；

化合物4、tcf和乙酸铵的摩尔比为1：1-5.1：1-1.2；

所述混合溶剂为体积比为4：1的四氢呋喃和乙醇。

优选地，所述步骤(6)的具体合成方法如下：将步骤(5)所得化合物5和丙烯酰氯加入到乙腈中，避光搅拌反应2-3h，反应结束后将反应液旋蒸，然后柱色谱分离得到所述荧光探针；

化合物5和丙烯酰氯摩尔比为1：1-1.5。

上述用于检测半胱氨酸的荧光探针的应用，用于待测样品中半胱氨酸含量的荧光检测、目视定性检测和细胞成像检测，其中细胞成像检测的具体操作过程为本领域所公知，本发明不再赘述。

本发明的有益效果如下：

本发明以新型萘酰亚胺染料，设计并合成了萘酰亚胺-丙烯酸酯荧光探针，在乙醇体系中，所述荧光探针整体分子呈淡黄色、弱黄色的荧光，随着体系中特定分析物半胱氨酸浓度的不断增加，诱导丙烯酸酯与半胱氨酸反应，使丙烯酸酯和半胱氨酸成环，荧光探针释放出萘酰亚胺染料分子单体，荧光强度显著增强并伴随明显的颜色变化，选取的干扰离子等对检测效果几乎无影响，因而实现了对半胱氨酸的特异性识别响应，而且直接肉眼观察就能判断半胱氨酸的存在与否，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明所述荧光探针的合成路线图；

图2为本发明所述荧光探针的核磁氢谱图；

图3为本发明所述荧光探针的核磁碳谱图；

图4为本发明所述荧光探针的质谱图；

图5为本发明所述荧光探针与10当量的半胱氨酸随反应时间的增加荧光光谱的变化结果；

图5中的点状图为669nm处荧光强度随反应时间增加的变化情况(ex＝615nm，em＝625-850nm，ex.slit/em.slit＝5/10)；

图6为本发明所述荧光探针与不同当量的半胱氨酸反应后的荧光光谱的变化结果；点状图为669nm处荧光强度随半胱氨酸加入当量的变化情况(ex＝615nm，em＝625-850nm，ex.slit/em.slit＝5/10)；

图7为本发明所述荧光探针与不同氨基酸及离子反应后的荧光光谱的变化结果(ex＝615nm，em＝625-850nm，ex.slit/em.slit＝5/10)；

图8为本发明所述荧光探针与不同氨基酸及离子反应后669nm处的荧光强度的柱状图结果(ex＝615nm，em＝625-850nm，ex.slit/em.slit＝5/10)；

图8中：1：空白对照、2：半胱氨酸cys、3：谷胱甘肽gsh、4：ch3coo^-、5：脯氨酸、6：i^-、7：no2^-、8：f^-、9：co3^2-、10：hco3^-、11：缬氨酸、12：so3^2-、13:hso3^-、14：br^-、15：cl^-、16：亮氨酸、17：同型半胱氨酸hcy；

图9为本发明所述荧光探针与半胱氨酸反应前后的溶液在日光灯下的颜色变化；

图10为本发明所述荧光探针与半胱氨酸反应前后的溶液在紫外灯下的颜色变化。

具体实施方式

为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明。

实施例1

一种用于检测半胱氨酸的荧光探针，其合成路线图如下：

具体制备方法包括以下步骤：

(1)取4-溴-1,8-萘二甲酸酐与正丁胺反应得到化合物1，其结构式如下：

所述步骤(1)的具体合成方法如下：将摩尔比为1：6的4-溴-1,8-萘二甲酸酐与正丁胺加入到乙醇中，氮气保护下回流反应至反应液澄清，浓缩后冷却析出晶体，乙醇重结晶后即得所述化合物1。

(2)以硫酸铜作催化剂，将步骤(1)所得化合物1与甲醇钠反应得到化合物2，其结构式如下：

所述步骤(2)的具体合成方法如下：取步骤(1)所得化合物1溶于甲醇中，然后依次加入甲醇钠和硫酸铜，回流反应11-15h后，浓缩后冷却析出晶体，去离子水洗涤后即得化合物2；

化合物1与甲醇钠的摩尔比为1：8-12。

(3)将步骤(2)所得化合物2与浓hbr反应得到化合物3，其结构式如下：

所述步骤(3)的具体合成方法如下：将步骤(2)所得化合物2(1.5g)加入到30ml浓hbr(质量分数为40％)中，回流反应约10-24h(此时tlc监测发现，化合物2已反应完全)，冷却过滤，乙醚洗涤后即得化合物3。

(4)将步骤(3)所得化合物3与六次甲基四胺和多聚甲醛反应得到化合物4，其结构式如下：

所述步骤(4)的具体合成方法如下：取化合物3200.4mg(0.744mmol)、六次甲基四胺(通用名为乌洛托品)104.3mg(0.744mmol)、多聚甲醛104.3mg于50ml圆底烧瓶中，加入过量乙酸(15ml左右)回流1h，降温至85℃，加入过量浓盐酸(质量分数为37.5％，15ml左右)反应35min；将反应液冷却到室温，加入去离子水稀释，过滤取滤液，用二氯甲烷萃取得粗产品，然后用硅胶柱进行分离得到化合物4，硅胶颗粒大小为200-300目，柱分离洗脱剂配比为石油醚：乙酸乙酯＝3：1，产率：80.69％；

(5)将化合物4与tcf和乙酸铵反应得到化合物5，其结构式如下：

所述步骤(5)的具体合成方法如下：取化合物4(260mg,0.8745mmol)、tcf(191.4mg，0.9620mmol)、乙酸铵(80.3mg,1.0417mmol)于50ml圆底烧瓶中，加入体积比为4：1的四氢呋喃和乙醇的混合溶剂15ml使其溶解，避光搅拌反应24小时，反应结束后将反应液旋蒸，并用二氯甲烷：甲醇(20：1)的洗脱剂(洗脱剂也可选用纯二氯甲烷)进行柱色谱提纯，得到化合物5，所述硅胶颗粒大小为200-300目，产率：61.6％；

(6)将化合物5与丙烯酰氯反应即得所述荧光探针。

所述步骤(6)的具体合成方法如下：取化合物5(41.3mg,0.086mmol)、丙烯酰氯(8μl，0.094mmol)于50ml圆底烧瓶中，加入乙腈(5ml)使其溶解，避光搅拌反应3小时，反应结束后将反应液旋蒸，并用二氯甲烷：甲醇(200：1)的洗脱剂(洗脱剂也可选用纯二氯甲烷)进行柱色谱提纯得到目标化合物荧光探针，所述硅胶颗粒大小为200-300目，产率：53.25％；

根据图2至图4的结构表征结果，其中碳谱数据为：¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ175.10,172.44,163.53,163.30,163.08,151.51,138.78,136.46,133.30,130.26,128.79,128.75,127.73,126.11,125.83,125.00,123.37,121.78,117.41,111.29,110.51,99.97,98.20,40.54,30.18,25.78,20.34,13.83，综合上述数据可以判断，得到了预期结构的荧光探针，其结构式如下：

荧光检测应用试验

(1)试剂准备

a.荧光探针溶液(1.00×10^-3mol·l^-1)的配制：

取实施例1所制备的本发明所述荧光探针溶于二甲基亚砜中，配制成浓度为1.00×10^-3mol·l^-1的荧光探针溶液；

b.各种氨基酸及阴离子的标准溶液的配制

各种氨基酸及阴离子的标准品均用去离子水配置成为浓度为1.00×10^-3mol·l^-1的标准溶液，此外半胱氨酸再配制一份浓度为1.00×10^-2mol·l^-1的标准溶液；

从步骤a所配制的荧光探针溶液中取出30μl加入到比色皿中，再加入浓度为1.00×10^-2mol·l^-1的半胱氨酸(简称为cys)标准溶液，用乙醇稀释至3ml，然后每隔1min测量其荧光性质一次，直到其荧光强度不再增强为止(ex＝615nm，em＝625-850nm,ex.slit/em.slit＝5/10)，所得荧光光谱如图5所示，由图5可见，随反应时间的增加，荧光强度逐渐增强，说明探针与半胱氨酸作用存在一定的时间效应，为探针其他响应性研究中提供可靠的作用时间。

从步骤a所配制的荧光探针溶液中取出36组30μl且依次加入到36支试管当中，其中1个试管作为空白对照，不再添加任何组分，余下35个试管中再依次加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.17、2.33、2.5、2.67、3、3.33、3.67、4、4.33、4.67、5、5.33、6、7当量的浓度为1.00×10^-3mol·l^-1的半胱氨酸(简称为cys)标准溶液，然后用乙醇稀释至3ml，测量其荧光性质(ex＝615nm，em＝625-850nm，ex.slit/em.slit＝5/10)，荧光光谱如图6所示，由图6可见，随着加入的半胱氨酸cys当量的增加，荧光强度逐渐增强，且在一定范围内，荧光强度与半胱氨酸cys当量存在线性关系，由此可实现一定范围内的定量检测，具体的定量检测方法为本领域技术人员所公知，此处不再赘述。

从步骤a所配制的荧光探针溶液中取出17组30μl且分别加入到17个试管当中，其中1个试管作为空白对照，不再添加任何组分，余下16个试管中再依次加入步骤b配制的10当量的浓度为1.00×10^-3mol·l^-1的以下标准溶液：gsh、hcy、cys、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、f^-、cl^-、br^-、i^-、ch3coo^-、co3^2-、hco3^-、hso3^-、so3^2-、no2^-，然后用乙醇稀释至3ml，120min后检测溶液的荧光发射光谱(ex＝615nm，em＝625-850nm，ex.slit/em.slit＝5/10)，由图7和图8可以发现，其他离子和氨基酸与本发明所述荧光探针几乎没有荧光响应，而半胱氨酸cys溶液与本发明所述荧光探针存在显著的荧光响应，说明本发明所述荧光探针对半胱氨酸的检测有较高的选择性，能够用于半胱氨酸的检测。

从步骤a所配制的荧光探针溶液中取出30μl加入到试管当中，再向试管中加入浓度为1.00×10^-2mol·l^-1的半胱氨酸标准溶液，然后用乙醇稀释至3ml，如图9所示，日光灯下，肉眼可见，半胱氨酸可以使荧光探针的乙醇溶液发生明显的颜色变化，溶液颜色从淡黄色变成蓝色，再如图10所示，紫外灯下，肉眼可视，半胱氨酸诱导荧光探针发出红色荧光，说明本发明所述荧光探针是一种具有生色传感功能的荧光探针，可用于半胱氨酸的目视定性检测，极大地方便了半胱氨酸的快速定性检测。

最后所应说明的是：上述实施例仅用于说明而非限制本发明的技术方案，任何对本发明进行的等同替换及不脱离本发明精神和范围的修改或局部替换，其均应涵盖在本发明权利要求保护的范围之内。