本发明涉及一种测定纤溶酶纯度的方法，具体是一种测定重组枯草杆菌纤溶酶纯度的方法，属于生物医药和分析检测领域。
背景技术：
：重组枯草杆菌纤溶酶是一种超高活性的溶栓蛋白酶，具有高效的溶栓效用，具有药理作用直接且多元化、体内作用时间长、分子量较小，可直接通过胃肠系统直接被人体吸收、抗氧化、防止血管内皮损伤、延缓血管老化、安全性高等诸多优点。因此，重组枯草杆菌纤溶酶具有开发成新一代高效溶栓药物的潜力。现有技术中存在的重组枯草杆菌纤溶酶的纯度测定方法为电泳法，该方法无法进行定量测定，也无法测定产品的具体纯度，为枯草杆菌纤溶酶精制及其药物的工业化生产带来很大障碍。目前，还没有关于重组枯草杆菌纤溶酶纯度测定的有效方法，而重组枯草杆菌纤溶酶广阔的药用前景亟待开发成药物用于治疗血栓等疾病。高效液相色谱法(hplc)分离效果好、选择性好、灵敏度高、应用范围广和分析速度快，不仅适用于各种多元组分复杂混合物的分析，而且能分析其中微量成分，定量分析目标物含量，为药物成分的定量和定性提供了迅速可靠的途径。但是常规的普通hplc方法很难准确测定重组枯草杆菌纤溶酶的纯度。技术实现要素：针对上述现有技术存在的技术问题，本发明提供一种测定重组枯草杆菌纤溶酶纯度的方法，该方法能够快速、高效的测定重组枯草杆菌的纯度，为重组枯草杆菌纤溶酶药物研发和质量控制提供可靠的检测方法。本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种测定重组枯草杆菌纤溶酶纯度的方法，该方法包括如下步骤：1)选用适合蛋白分析的色谱柱，并预设柱温温度；2)利用二极管阵列检测器检测色谱柱；3)采用三氟乙酸乙腈溶液和三氟乙酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱分析；4)通过面积归一法将色谱柱定量。所述步骤1)中的色谱柱为agilentzorbax300sb-c18色谱柱。所述步骤1)中的预设柱温温度为50℃。所述步骤3)中的三氟乙酸(tfa)乙腈溶液和三氟乙酸水溶液的量均为1％。本发明的有益效果是：与现有技术相比，该方法基于高效液相色谱检测方法，不仅可以准确对重组枯草杆菌纤溶酶纯度进行定量，为其开发成药物提供可靠的原材料，而且还可以分离纯化过程中的分离效率计算提供可靠依据，重组枯草杆菌纤溶酶hplc纯度标准方法的建立为客观的表述重组枯草杆菌纤溶酶的纯度提供可靠依据。附图说明图1为本发明实施例检测结果示意图。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。一种测定重组枯草杆菌纤溶酶纯度的方法，该方法包括如下步骤：1)选用适合蛋白分析的色谱柱，并预设柱温温度；2)利用二极管阵列检测器检测色谱柱；3)采用三氟乙酸乙腈溶液和三氟乙酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱分析；4)通过面积归一法将色谱柱定量。所述步骤1)中的色谱柱为agilentzorbax300sb-c18色谱柱。所述步骤1)中的预设柱温温度为50℃。所述步骤3)中的三氟乙酸(tfa)乙腈溶液和三氟乙酸水溶液的量均为1％。目前重组枯草杆菌纤溶酶的纯度检测技术指标和检测标准，本发明对其深入研究，制定检测方法的相关标准，为重组枯草杆菌纤溶酶开发成药物提供技术服务，具体如下：采用适合蛋白分析的agilentzorbax300sb-c18色谱柱，0.1％tfa乙腈和0.1％tfa作为流动相，采用梯度洗脱的方法进行分析，面积归一化法进行定量，建立能够快速测定重组枯草杆菌纤溶酶的纯度的hplc方法。高效液相色谱法对重组枯草杆菌纤溶酶的纯度进行测定，使用agilent1260液相色谱仪，配dad检测器。具体检测条件为：色谱柱：agilentzorbax300sb-c18色谱柱250*4.6mm(5μm)流动相a：0.1％三氟乙酸水溶液流动相b：0.1％三氟乙酸乙腈溶液时间(min)流动相a(％)流动相b(％)09551559515.195521955进样量：20μl流速：1ml/min柱温：50℃检测波长：280nm样品制备将发酵液先离心处理，经过疏水纯化和脱盐纯化后及冷冻干燥后得到的重组枯草杆菌纤溶酶进行高效液相色谱法检测纯度。供试品：疏水纯化后的重组枯草杆菌纤溶酶(简称疏水蛋白)、脱盐纯化后的重组枯草杆菌纤溶酶(简称脱盐蛋白)及冷冻干燥后的冻干粉。实施例一1、仪器agilent1260液相色谱仪2、试剂水：超纯水乙腈：sigmahplc乙腈tfa(三氟乙酸)：上海麦克林生物科技有限公司流动相a：0.1％tfa溶液，过0.22μm的水系滤膜流动相b：0.1％tfa乙腈溶液，过0.22μm的有机系滤膜3、检测方法样品的制备：若为疏水蛋白或脱盐蛋白溶液则直接稀释到1mg/ml，过0.22μm水系滤膜，若为冻干粉则加水溶解后稀释至1mg/ml。色谱柱：德国迈克c8色谱柱，5μm，250*4.6mm德国迈克c18色谱柱，5μm，250*4.6mm月旭科技c18色谱柱，5μm，250*4.6mmagilentzorbax300sb-c18色谱柱，5μm，250*4.6mm梯度洗脱方法：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)09551559515.195521955进样量：20μl流速：1ml/min柱温：25℃检测波长：280nm4、检测结果用超纯水作为空白对照，检测样品为1mg/ml的疏水蛋白。通过对比检测纯度、杂峰及分离度来看，采用agilentzorbax300sb-c18色谱柱的效果最好。实施例二1、仪器agilent1260液相色谱仪2、试剂水：超纯水乙腈：sigmahplc级乙腈甲醇：sigmahplc级甲醇tfa(三氟乙酸)：上海麦克林生物科技有限公司乙酸：国药集团化学试剂有限公司(ar)tea(三乙胺)：国药集团化学试剂有限公司(ar)磷酸：国药集团化学试剂有限公司(ar)二水合磷酸二氢钠：国药集团化学试剂有限公司(ar)十二水合磷酸氢二钠：国药集团化学试剂有限公司(ar)流动相a：流动相a①：0.1％tfa的50mmol磷酸缓冲液流动相a②：0.1％tea的50mmol磷酸缓冲液流动相a③：1％乙酸的50mmol磷酸缓冲液流动相a④：0.1％tfa溶液流动相a⑤：0.1％tea溶液流动相a⑥：1％乙酸溶液流动相b:流动相b①：乙腈流动相b②：甲醇3、检测方法色谱柱：agilentzorbax300sb-c18色谱柱，5μm，250*4.6mm梯度洗脱方法：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)09551559515.195521955进样量：20μl流速：1ml/min柱温：25℃检测波长：280nm4、检测结果用超纯水作为空白对照，检测样品为1mg/ml的疏水蛋白。通过12种流动相的组合对比来看，采用0.1％tfa溶液与乙腈的组合最为适合分析重组枯草杆菌纤溶酶。实施例三1、仪器agilent1260液相色谱仪2、试剂水：超纯水乙腈：sigmahplc乙腈tfa(三氟乙酸)：上海麦克林生物科技有限公司流动相a：0.1％tfa溶液，过0.22μm的水系滤膜流动相b：0.1％tfa乙腈溶液，过0.22μm的有机系滤膜3、检测方法色谱柱：agilentzorbax300sb-c18色谱柱，5μm，250*4.6mm梯度洗脱方法：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)09551559515.195521955进样量：20μl流速：1ml/min检测波长：280nm柱温分别为：25℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃及70℃4、检测结果用超纯水作为空白对照，检测样品为1mg/ml的疏水蛋白。通过实施例一、实施例二和实施例三可得，如图1所示：采用不同的柱温来检测，发现在柱温为50℃，枯草杆菌纤溶酶的分离度最高、峰不拖尾、纯度最高。以上所举实施例为本发明的较佳实施方式，仅用来方便说明本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，任何所属
技术领域：
中具有通常知识者，若在不脱离本发明所提技术特征的范围内，利用本发明所揭示技术内容所做出局部更动或修饰的等效实施例，并且未脱离本发明的技术特征内容，均仍属于本发明技术特征的范围内。当前第1页12