本发明属于医药领域，具体涉及红色诺卡氏菌细胞壁骨架作为nk细胞增殖促进剂的用途。
背景技术
诺卡氏菌为多形态，有诺卡氏菌属球状、杆状、丝状，菌体大小0.6×(3～4)微米，无运动性，有些菌种呈弱抗酸性，专性需氧，营养要求一般。在普通琼脂平板上培养3天后有可见菌落，7～10天后菌落凸起，气生菌丝形成后，表面呈绒毛状。不同种的菌落有黄、橙、红或这些色素的混合色。dna中的g+c克分子含量为60～72％。大多为腐生菌，存在于土壤中。红色诺卡氏菌(nocardiarubra)是其中的一种放线菌。红色诺卡氏菌菌体经发酵、细胞破碎、蛋白酶降解后可制得红色诺卡氏菌细胞壁骨架(以下简称nr-cws或n-cws)。
技术实现要素：
本发明发现红色诺卡氏菌细胞壁骨架能够促进自然杀伤细胞(以下简称nk细胞)增殖、促进nk细胞表面功能分子cd69、trail和fasl的表达、促进nk细胞胞内颗粒酶b和穿孔素的表达、以及促进nk细胞tnf-α的表达，进而完成了本发明。
根据本发明的一个方面，本发明提供红色诺卡氏菌细胞壁骨架在制备用于促进nk细胞增殖的药物中的用途。根据本发明，所述药物能够通过促进nk细胞增殖治疗与nk细胞相关的疾病，包括但不限于：例如病毒等的病原微生物引起的机体局部组织感染或病变，以及自身免疫性疾病。
根据本发明的另一个方面，本发明提供红色诺卡氏菌细胞壁骨架作为非治疗目的的nk细胞增殖促进剂的用途。根据本发明，所述“非治疗目的”例如在体外促进nk细胞增殖。
根据本发明的另一个方面，本发明提供一种体外促进nk细胞增殖的方法，其中，给予体外培养的nk细胞红色诺卡氏菌细胞壁骨架。优选，红色诺卡氏菌细胞壁骨架的浓度为1-60μg/ml，进一步优选10-60μg/ml，更优选20-40μg/ml。
根据本发明的另一个方面，本发明提供红色诺卡氏菌细胞壁骨架在制备用于促进nk细胞表面功能分子cd69、nk细胞表面功能分子trail、nk细胞表面功能分子fasl、nk细胞胞内颗粒酶b或nk细胞胞内穿孔素表达的药物中的用途。根据本发明，所述药物能够通过促进nk细胞表面功能分子cd69、nk细胞表面功能分子trail、nk细胞表面功能分子fasl、nk细胞胞内颗粒酶b或nk细胞胞内穿孔素表达治疗与nk细胞相关的疾病，包括但不限于：例如病毒等的病原微生物引起的机体局部组织感染或病变，以及自身免疫性疾病。
根据本发明的另一个方面，本发明提供红色诺卡氏菌细胞壁骨架作为非治疗目的的nk细胞表面功能分子cd69、nk细胞表面功能分子trail、nk细胞表面功能分子fasl、nk细胞胞内颗粒酶b或nk细胞胞内穿孔素表达促进剂的用途。根据本发明，所述“非治疗目的”例如在体外促进nk细胞表面功能分子cd69、nk细胞表面功能分子trail、nk细胞表面功能分子fasl、nk细胞胞内颗粒酶b或nk细胞胞内穿孔素表达。
根据本发明的另一个方面，本发明提供一种体外促进nk细胞表面功能分子cd69、nk细胞表面功能分子trail、nk细胞表面功能分子fasl、nk细胞胞内颗粒酶b或nk细胞胞内穿孔素表达的方法，其中，给予体外培养的nk细胞红色诺卡氏菌细胞壁骨架。优选，红色诺卡氏菌细胞壁骨架的浓度为1-60μg/ml，进一步优选10-60μg/ml，更优选20-40μg/ml。
根据本发明的另一个方面，本发明提供红色诺卡氏菌细胞壁骨架在制备用于促进nk细胞tnf-α表达的药物中的用途。根据本发明，所述药物能够通过促进nk细胞tnf-α表达治疗与nk细胞相关的疾病，包括但不限于：例如病毒等的病原微生物引起的机体局部组织感染或病变，以及自身免疫性疾病。
根据本发明的另一个方面，本发明提供红色诺卡氏菌细胞壁骨架作为非治疗目的的nk细胞tnf-α表达促进剂的用途。根据本发明，所述“非治疗目的”例如在体外促进nk细胞tnf-α表达。
根据本发明的另一个方面，本发明提供一种体外促进nk细胞tnf-α表达的方法，其中，给予体外培养的nk细胞红色诺卡氏菌细胞壁骨架。优选，红色诺卡氏菌细胞壁骨架的浓度为1-60μg/ml，进一步优选10-60μg/ml，更优选20-40μg/ml。
本领域技术人员可以理解，红色诺卡氏菌细胞壁骨架可以商购或者按照本领域已知的各种方法制备得到。优选，红色诺卡氏菌为nr-8206(其于2002年2月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.0712)。例如，可以通过将红色诺卡氏菌发酵后去除dna、dna、rna、蛋白质、类脂，制备得到红色诺卡氏菌细胞壁骨架，其主要有效成分为胞壁酸、多聚糖和粘肽，分子量约为2-20kd。
本发明通过实验首次证实了红色诺卡氏菌细胞壁骨架能够促进nk增殖、促进nk细胞表面功能分子cd69、trail和fasl的表达、促进nk细胞胞内颗粒酶b和穿孔素的表达、以及促进nk细胞tnf-α的表达，从而使得红色诺卡氏菌细胞壁骨架能够在体内用于治疗与nk细胞有关的疾病，而且能够在体外用于促进nk细胞增殖、促进nk细胞表面功能分子cd69、trail和fasl的表达、促进nk细胞胞内颗粒酶b和穿孔素的表达、以及促进nk细胞tnf-α的表达。
附图说明
图1.红色诺卡氏菌细胞壁骨架促进nk细胞增殖
图2.红色诺卡氏菌细胞壁骨架促进nk细胞表面功能分子cd69、trail和fasl的表达：图2a1为24小时流式图；图2a2为24小时cd69、trail和fasl表达对比；图2b1为48小时流式图；图2b2为48小时cd69、trail和fasl表达对比
图3.红色诺卡氏菌细胞壁骨架促进nk细胞胞内颗粒酶b和穿孔素的表达：图3a1为24小时流式图；图3a2为24小时颗粒酶b和穿孔素表达对比；图3b1为48小时流式图；图3b2为48小时颗粒酶b和穿孔素表达对比
图4.红色诺卡氏菌细胞壁骨架促进nk细胞tnf-α的表达：图4a为24小时tnf-α表达对比；图4b为48小时tnf-α表达对比
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
实施例1.nr-cws促进nk细胞增殖
1.小鼠nk细胞的分离纯化、培养
(1)无菌分离小鼠(清洁级c57bl/6小鼠，6-8周龄，雌性，体重18-20克，购于上海斯莱克实验动物有限公司)脾脏，制备单细胞悬液；1000rpm/min离心10min后弃去上清得细胞沉淀；所得脾脏细胞沉淀用2ml红细胞裂解液悬浮，冰上裂解红细胞5min，加入10ml冷pbs缓冲液，1000rpm/min离心5min后弃去上清得细胞沉淀；重悬于2ml磁珠分选缓冲液中，调整细胞浓度为1×108/ml。
(2)按照stemcelleasyseptmmousenkcellisolationkit磁珠分离使用说明书操作步骤，无菌分选nk细胞并用流式检测分选纯度为81.97±3.40％。
(3)用添加10％热灭活胎牛血清(fbs)的完全rpmi1640培养基(2mml-谷氨酰胺、50μmβ-巯基乙醇、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、100μg/ml卡那霉素)悬浮新鲜分离的nk细胞，按5×105/ml细胞密度接种96孔板，每孔100μl，并且在培养基里添加il-2；在37℃、5％co2的培养箱中培养。
2.nr-cws促进nk细胞增殖
nk细胞按2×105/ml细胞密度接种96孔板，每孔100μl。将nk细胞在37℃、5％co2的培养箱中培养2小时后，实验组加入用培养液溶解的浓度分别为0.01μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、120μg/ml的nr-cws(辽宁格瑞仕特生物制药有限公司，下同)，每孔100μl，每个浓度设3个复孔。调零孔即对照组加入rpmi1640培养液，每孔100μl，设3个复孔。在37℃、5％co2的培养箱中培养12小时和24小时，倒置显微镜下观察细胞数量。终止培养后，在酶联免疫检测仪od450nm处测定各孔的吸光度，参比波长600nm。
结果(见图1)显示，nr-cws在浓度为40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、120μg/ml时，处理nk细胞24小时后，nk细胞增殖与对照组相比显著升高(**p<0.01)，且在浓度为60μg/ml时升高最为显著。
实施例2.nr-cws促进nk细胞表面功能分子cd69、trail和fasl的表达
nk细胞按2×105/ml细胞密度接种96孔板，每孔100μl。将nk细胞在37℃、5％co2的培养箱中培养2小时后，实验组加入用培养液溶解的浓度为15μg/ml的nr-cws，每孔100μl，设3个复孔。对照组加入rpmi1640培养液，每孔100μl，设3个复孔。在37℃、5％co2的培养箱中培养24小时和48小时。收集各组nk细胞，分别标记anti-nk1.1、anti-cd3e、anti-cd69、anti-trail和anti-fasl流式荧光抗体，然后洗去未结合染料，制备500μl的细胞悬液。采用流式检测nk细胞表面功能分子cd69、fasl和trail的表达情况。其中，采用bdfacsdiva软件收集至少10000个细胞。
结果(见图2，其中图2a1和图2a2为24小时，图2b1和图2b2为48小时)显示，nr-cws处理nk细胞24小时后，nk细胞表面功能分子cd69、fasl和trail的表达与对照组相比均显著升高(*p<0.05)；处理48小时后，nk细胞表面功能分子cd69表达与对照组相比显著升高(*p<0.05)。
实施例3.nr-cws促进nk细胞胞内颗粒酶b和穿孔素的表达
nk细胞按2×105/ml细胞密度接种96孔板，每孔100μl。将nk细胞在37℃、5％co2的培养箱中培养2小时后，实验组加入用培养液溶解的浓度为30μg/ml的nr-cws，每孔100μl，设3个复孔。对照组加入rpmi1640培养液，每孔100μl，设3个复孔。阴性组为基线。在37℃、5％co2的培养箱中培养24小时和48小时。在每个检测时间点的最后4小时，每孔加入monensin溶液。收集各组nk细胞，分别标记anti-nk1.1、anti-cd3e、anti-grzb、anti-prf流式荧光抗体，然后洗去未结合染料，制备500μl的细胞悬液。采用流式检测nk细胞胞内颗粒酶b和穿孔素的表达情况。其中，采用bdfacsdiva软件收集至少10000个细胞。
结果(见图3，其中图3a1和图3a2为24小时，图3b1和图3b2为48小时)显示，nr-cws处理nk细胞24小时后，nk细胞胞内颗粒酶b和穿孔素的表达与对照组相比均显著升高(*p<0.05或**p<0.01)；处理48小时后，nk细胞胞内颗粒酶b和穿孔素的表达与对照组相比也均显著升高(**p<0.01)。
实施例4.nr-cws促进nk细胞tnf-α的表达
nk细胞按2×105/ml细胞密度接种96孔板，每孔100μl。将nk细胞在37℃、5％co2的培养箱中培养2小时后，实验组加入用培养液溶解的浓度为30μg/ml的nr-cws，每孔100μl，设3个复孔。对照组加入rpmi1640培养液，每孔100μl，设3个复孔。在37℃、5％co2的培养箱中培养24小时和48小时。收集nr-cws组及对照组细胞培养上清液，采用biolegend公司的legendplextmmousethcytokinepanelkit检测细胞培养上清液内的细胞因子tnf-α、il-2、il-4、il-5和il-10。
结果(见图4，其中图4a为24小时，图4b为48小时)显示，无论是24小时还是48小时，对照组均未检测到tnf-α(即nd)，这表明对照组不表达tnf-α，但nr-cws处理nk细胞24小时和48小时后，nk细胞表达tnf-α与对照组相比均显著升高(*p<0.05)；对照组和nr-cws处理组均表达il-2，但两组无论是24小时还是48小时il-2的表达量均无显著差异；无论是24小时还是48小时，对照组和nr-cws处理组均未检测到il-4、il-5、il-10，这表明nk细胞不表达il-4、il-5、il-10。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。