一种重组人源III型胶原蛋白的纯化方法和制备方法与流程

本发明涉及蛋白质提取技术领域，具体而言，涉及一种重组人源iii型胶原蛋白的纯化方法和制备方法。

背景技术：

目前，胶原蛋白的来源主要分为：

动物源胶原蛋白传统提取法：通过用酸、碱水解法从动物结缔组织(猪皮、牛皮、驴、皮、鱼等)中提取但所得到的产品成分复杂。

类胶原蛋白的化学合成法：化学合成法提供了一条快速、高效的蛋白质制备途径，同时它能方便地引入非天然氨基酸，改变碳链骨架以及进行其它化学修饰来提高蛋白质活性，构建新蛋白。此项技术应用于类胶原蛋白的合成中，并利用其技术特点赋予类胶原蛋白新的生理功能。

胶原蛋白的重组表达：充分利用胶原蛋白的优良特性，避免动物来源产品的高风险，利用基因工程技术，选用各种宿主细胞，如转基因动物、转基因植物、昆虫细胞、细菌、酵母等生产重组人胶原蛋白和明胶，产品具有安全性好、重现性好、质量稳定等优点，解决了传统提取方法存在的诸如疯牛病病毒隐患等缺点，同时也改善了胶原蛋白的亲水性、免疫排异性等性能。

国内胶原蛋白厂商大多采用大肠杆菌发酵表达胶原蛋白，但是细菌表达系统普遍存在以下缺点：产生的致热源(例如内毒素)致使表达产物难以应用于临床；目的蛋白常以包涵体形式表达，致使产物纯化困难；原核表达系统的翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低等。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种重组人源iii型胶原蛋白的纯化方法，该纯化方法可防止蛋白降解、降低内毒素的产生，提高重组人源iii型胶原蛋白的含量。

本发明的另一目的在于提供一种重组人源iii型胶原蛋白的制备方法，该纯化方法可防止蛋白降解、降低内毒素的产生，提高重组人源iii型胶原蛋白的含量。

本发明是这样实现的：

一种重组人源iii型胶原蛋白的纯化方法，其包括：将由具有表达出重组人源iii型胶原蛋白能力的重组酵母菌发酵得到的发酵液进行第一次热处理，得到变性液，上述第一次热处理的温度为65-75℃。

一种重组人源iii型胶原蛋白的制备方法，其包括：培养具有表达出重组人源iii型胶原蛋白能力的重组酵母菌，获取发酵液；上述发酵液按上述重组人源iii型胶原蛋白的纯化方法进行纯化，得到重组人源iii型胶原蛋白。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供的重组人源iii型胶原蛋白的纯化方法，通过在温度为65-75℃条件下热处理由具有表达出重组人源iii型胶原蛋白能力的重组酵母菌发酵得到的发酵液，有效地防止了发酵液中的重组人源iii型胶原蛋白降解成小分子肽，并降低发酵液中内毒素的产生，大大地提高了重组人源iii型胶原蛋白纯度，达到符合化妆品原料、医疗器械以及医用级的高纯度胶原蛋白。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的重组人源iii型胶原蛋白工程菌的生物保藏信息；

图2为本发明实施例1提供的重组人源iii型胶原蛋白原液的sds-page电泳检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种重组人源iii型胶原蛋白的纯化方法和制备方法进行具体说明。

一方面，本发明提供的重组人源iii型胶原蛋白的纯化方法，包括如下步骤：

s1过滤

取由具有表达出重组人源iii型胶原蛋白能力的重组酵母菌发酵得到的发酵液，离心，上清液过滤，取过滤液。

所用重组酵母菌例如是保藏编号为cgmccno.12491的重组酵母菌株。该重组人源iii型胶原蛋白工程菌生物保藏信息：分类命名为巴斯德毕氏酵母(pichiapastoris)，于2016年5月23日在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmccno.12491。本实施例所用重组人源iii型胶原蛋白工程菌的生物保藏信息以及存活证明可参见图1。

s2热处理

将过滤液进行第一次热处理(即将过滤液加热至预设温度，保温预设的时间)，得到变性液。

优选地，上述第一次热处理的温度为65-75℃。更优选地，第一次热处理的温度为68-72℃；再优选地，第一次热处理的温度为70℃。

优选地，上述第一次热处理的时间为8-12min。更优选地，上述第一次热处理的时间为10min。

本发明的发明人在长期的研究过程中，惊奇地发现，通过上述热处理步骤的作用，既能防止重组人源iii型胶原蛋白被蛋白酶降解，又能在没有酸、碱、水解酶的作用下保持胶原蛋白的结构稳定不被水解。

s3盐析

往上述变性液中加入硫酸铵至饱和度为28-30％，室温静置，离心，收集沉淀。

优选地，加入饱和硫酸铵溶液至饱和度为30％。

通过盐析步骤，可使胶原蛋白(130kd)沉淀并去除绝大部分小分子杂质，提高蛋白纯度。

向某些蛋白质溶液中加入某些无机盐溶液后，可以降低蛋白质的溶解度，使蛋白质凝聚而从溶液中析出,这种作用叫作盐析，这个过程是物理变化，可复原并能保证蛋白质的活性，该方法在实验室研究和工业化生产都有应用。阳离子交换层析是利用不同分子在所设计的条件(如ph、离子强度等)下，携带电荷情况不同，与阳离子交换剂结合的强度不同，可以用不同的条件洗脱出不同的组分的一种层析法；该方法的特点是处理量大，条件可控，易获得高纯度的蛋白，可放大生产。

在本发明中，利用盐析的方法对发酵液进行初提，结合后后续的阳离子交换柱可进一步纯化得到高纯度的胶原蛋白。

s4溶解

溶解上述沉淀，用0.65μm滤膜过滤后，用含18-22mm柠檬酸盐、48-52mm氯化钠、ph为5.8-6.2的第一缓冲液(即柠檬酸缓冲液)换液，得到粗蛋白液。

优选地，第一缓冲液含20mm柠檬酸盐和50mm氯化钠，ph6.0。

s5低盐洗脱

将上述粗蛋白液加入至层析柱，并用含18-22mm柠檬酸盐、145-155mm氯化钠、ph为5.8-6.2的第二缓冲液换液进行低盐洗脱。

优选地，第二缓冲液换液含20mm柠檬酸盐和150mm氯化钠，ph6.0。有利于去除杂质，提高后续胶原蛋白的纯度。

s6高盐洗脱

用含18mm柠檬酸盐、245-255mm氯化钠、ph为5.8-6.2的第三缓冲液换液进行高盐洗脱，收集洗脱液。

优选地，第三缓冲液换液含20mm柠檬酸盐和250mm氯化钠，ph6.0。

s7超滤脱盐

用30kd超滤膜包18-22mmol/lph为5.8-6.2的柠檬酸盐缓冲液对上述洗脱液进行脱盐换液，得到重组人源iii型胶原蛋白的胶原蛋白溶液。

优选地，用20mmol/lph为6.0的柠檬酸盐缓冲液对上述洗脱液进行脱盐换液。

s8热处理

对上述胶原蛋白溶液进行第二热处理，上述第二次热处理的温度为65-75℃，时间为8-12min。得到重组人源iii型胶原蛋白原液。

优选地，上述第二次热处理的温度为70℃，时间为10min。

通过第二次热处理的作用，可再次制约蛋白酶对胶原蛋白的降解，提高胶原蛋白纯度。

综上，本发明提供的重组人源iii型胶原蛋白的纯化方法，采用采用热变性方法防止胶原蛋白降解成小分子肽，并利用硫酸铵沉淀去除胶原蛋白(130kd)以下分子量的杂质，再结合阳离子交换层析技术纯化，使得所纯化得到重组人源iii型胶原蛋白达到符合化妆品原料、医疗器械以及医用级的高纯度胶原蛋白；

该纯化方法是一种全新的纯化方法，是首次以加热防止降解和利用阳离子离子交换结合的方式来进行纯化的胶原蛋白，有效地防止了发酵液中的重组人源iii型胶原蛋白降解成小分子肽，并降低发酵液中内毒素的产生，大大地提高了重组人源iii型胶原蛋白纯度。并相对于现有的采用镍亲和柱进行纯化存在重金属镍的脱落成为隐患的纯化方式，本发明的纯化方法更环保、安全。

另一方面，本发明提供了一种重组人源iii型胶原蛋白的制备方法，其包括：

培养具有表达出重组人源iii型胶原蛋白能力的重组酵母菌，获取发酵液；

上述发酵液按上述重组人源iii型胶原蛋白的纯化方法进行纯化，得到重组人源iii型胶原蛋白。

上述制备方法所制得的重组人源iii型胶原蛋白纯度高、活性高，达到符合化妆品原料、医疗器械以及医用级的高纯度胶原蛋白的级别。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的重组人源iii型胶原蛋白的纯化方法，包括如下步骤。

1.1过滤步骤：

取由具有表达出重组人源iii型胶原蛋白能力的重组酵母菌(保藏编号为cgmccno.12491)发酵得到的发酵液，5000rpm，离心10min；取上清液用滤纸(一般的实验室定性滤纸)过滤，收集过滤液。

cgmccno.12491的重组酵母菌的培养方法参考申请号为2016111191228，名称为“一种重组人源iii型胶原蛋白工程菌的发酵方法与发酵培养基”的中国专利申请中的培养方法进行培养，得到发酵液。

该重组人源iii型胶原蛋白工程菌生物保藏信息：分类命名为巴斯德毕氏酵母(pichiapastoris)，于2016年5月23日在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为cgmccno.12491。

本发明本实施例所用重组人源iii型胶原蛋白工程菌的生物保藏信息以及存活证明可参见图1。

1.2第一次热处理步骤：

将过滤液加热至70℃，保温10min，进行第一次热处理，得到变性液。

防止重组人源iii型胶原蛋白被蛋白酶降解，以维持其在没有酸、碱、水解酶的作用下保持胶原蛋白的结构稳定性，并降低内毒素的产生，有利于提高后续胶原蛋白的纯度。

需要说明的是，在其他的实施例中，第一次热处理的温度可以是65、66、67、68、69、71、72、73、74、75℃中的任意一种，只要在65-75℃的范围内即可。第一次热处理的时间可以是8、9、11、12min中的任意一种，只要在8-12min的范围内即可。

1.3盐析步骤：

往上述变性液中加入饱和硫酸铵溶液至饱和度为30％，室温静置10min，5000rpm，离心10min，收集沉淀，直接用于后续纯化或冻存于-80℃备用。

需要说明的是，在其他的实施例中，硫酸铵在变性液中的饱和度可以是28％、29％、31％、32％中的任意一种，只要是在28-32％的范围内即可。

1.4溶解步骤：

1.4.1用超纯水溶解上述沉淀，再用0.65μm滤膜过滤，收集滤液；

1.4.2上述滤液用含20mm柠檬酸盐、50mm氯化钠、ph6.0的柠檬酸缓冲液(第一缓冲液)换液，得到粗蛋白液。

需要说明的是，在其他的实施例中，第一缓冲液可以是含18mm柠檬酸盐、48mm氯化钠、ph5.8的柠檬酸缓冲液，或者是含22mm柠檬酸盐、52mm氯化钠、ph6.2的柠檬酸缓冲液，均可。

1.5低盐洗脱步骤：

1.5.1用sphp填料(ge公司)填充层析柱进行纯化，用3-5倍柱床体积20mm柠檬酸盐、50mm氯化钠、ph6.0的柠檬酸缓冲液平衡层析柱，控制流速为1ml/3min，直至uv280基线平缓。

1.5.2将上述粗蛋白液加入至层析柱，用含20mm柠檬酸盐和50mm氯化钠，ph6.0的柠檬酸缓冲液过柱，洗出未被吸附物质。收集流穿液。

1.5.3用2-3倍柱床体积含20mm柠檬酸盐和150mm氯化钠，ph6.0的柠檬酸缓冲液(第二缓冲液)进行低盐洗脱，以去除杂质，提高后续胶原蛋白的纯度。收集洗涤液。

需要说明的是，在其他的实施例中，第二缓冲液可以是含18mm柠檬酸盐、145mm氯化钠、ph5.8的柠檬酸缓冲液，或者是含22mm柠檬酸盐、155mm氯化钠、ph6.2的柠檬酸缓冲液，均可。

1.6高盐洗脱步骤：

用含20mm柠檬酸盐和250mm氯化钠，ph6.0的柠檬酸缓冲液(第三缓冲液)进行高盐洗脱，收集洗脱液。

需要说明的是，在其他的实施例中，第三缓冲液可以是含18mm柠檬酸盐、245mm氯化钠、ph5.8的柠檬酸缓冲液，或者是含22mm柠檬酸盐、255mm氯化钠、ph6.2的柠檬酸缓冲液，均可。

1.7超滤脱盐步骤：

用30kd超滤膜包20mmol/lph为6.0的柠檬酸盐缓冲液对上述洗脱液进行脱盐换液，得到重组人源iii型胶原蛋白溶液。

需要说明的是，在其他的实施例中，该步骤可以用18mmol/lph为5.8的柠檬酸盐缓冲液，或者是22mmol/lph为6.2的柠檬酸盐缓冲液进行脱盐换液。

1.8第二次热处理步骤：

将上述胶原蛋白溶液加热至70℃，保温10min，并以0.2μm的滤膜除菌过滤，得到重组人源iii型胶原蛋白原液。通过第二次热处理的作用，可再次制约蛋白酶对胶原蛋白的降解，提高胶原蛋白纯度，降低内毒素的产生。

经sds-page电泳检测，结果如图2所示(图中：m为蛋白maker，1为粗蛋白液，2为流穿液，3为洗涤液，4为重组人源iii型胶原蛋白原液)，相较于粗蛋白液和流穿液，纯化后的胶原蛋白溶液的在130kd的位置有条带(符合预期)，且条带单一，说明纯度高，已达到电泳纯。

需要说明的是，在其他的实施例中，第二次热处理的温度可以是65、66、67、68、69、71、72、73、74、75℃中的任意一种，只要在65-75℃的范围内即可。第二次热处理的时间可以是8、9、11、12min中的任意一种，只要在8-12min的范围内即可。

实施例2

本实施例提供了重组人源iii型胶原蛋白的制备方法，其包括：

培养具有表达出重组人源iii型胶原蛋白能力的重组酵母菌(cgmccno.12491)，获取发酵液；培养方法参考申请号为2016111191228，名称为“一种重组人源iii型胶原蛋白工程菌的发酵方法与发酵培养基”的中国专利申请中的培养方法进行培养，得到发酵液。

按实施例1提供的重组人源iii型胶原蛋白的纯化方法进行纯化，得到胶原蛋白原液。

综上，本发明提供的重组人源iii型胶原蛋白的纯化方法，采用采用热变性方法防止胶原蛋白降解成小分子肽，并利用硫酸铵沉淀去除胶原蛋白(130kd)以下分子量的杂质，再结合阳离子交换层析技术纯化，使得所纯化得到重组人源iii型胶原蛋白达到符合化妆品原料、医疗器械以及医用级的高纯度胶原蛋白；

该纯化方法是一种全新的纯化方法，是首次以加热防止降解和利用阳离子离子交换结合的方式来进行纯化的胶原蛋白，有效地防止了发酵液中的重组人源iii型胶原蛋白降解成小分子肽，并降低发酵液中内毒素的产生，大大地提高了重组人源iii型胶原蛋白纯度。并相对于现有的采用镍亲和柱进行纯化存在重金属镍的脱落成为隐患的纯化方式，本发明的纯化方法更环保、安全。

本发明提供的重组人源iii型胶原蛋白的制备方法所制得的重组人源iii型胶原蛋白纯度高、活性高，达到符合化妆品原料、医疗器械以及医用级的高纯度胶原蛋白的级别。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。