一种产气荚膜梭菌的多重PCR分型方法与流程

本发明属于细菌检测领域，具体涉及细菌性传染病的检测方法，特别是涉及产气荚膜梭菌的检测方法及应用领域。

背景技术：

产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)，在自然界分布极广，在一定条件下可引起多种严重疾病。该菌能产生多种外毒素，但起主要致病作用有α、β、ε、ι4种毒素，根据细菌产毒素的不同，将此菌分为a、b、c、d、e5个型。a型菌主要产生α毒素，引起人和动物气性坏疽和食物中毒，还可引起牛、羔羊、山羊、驯鹿、仔猪和家兔等的肠毒血症;b型菌主要产生α、β、ε毒素，引起羔羊痢疾，还可引起驹、犊牛、羔羊、绵羊和山羊的肠毒血症或坏死性肠炎;c型菌主要产生α、β毒素，是绵羊猝狙的病原，也能引起羔羊、犊牛、仔猪和绵羊的肠毒血症，坏死性肠炎以及人的坏死性肠炎;d型菌主要产生α、ε毒素，引起羔羊、绵羊、山羊、牛以及灰鼠的肠毒血症;e型菌主要产生α、ι毒素，可致犊牛、羔羊肠毒血症，但很少发生。

本研究以产气荚膜梭菌α、β、ε毒素的cap、cpb、etx基因为靶序列，建立了检测产气荚膜梭菌的多重pcr方法。为产气荚膜梭菌的检测和分型提供切实有效的方法。

技术实现要素：

根据genbank中登录的产气荚膜梭菌α、β、ε毒素的基因序列，设计3对特异性引物。建立了检测和分型产气荚膜梭菌的多重pcr方法，从而实现对产气荚膜梭菌的灵敏、高效、快速、准确检测和分型。

本发明的目的在于通过多重pcr方法对动物体内的产气荚膜梭菌进行分型鉴定。

本发明的目的在于提供一组多重pcr检测产气荚膜梭菌的引物，所述引物如seqidno:1和seqidno:2所示。

本发明的目的在于提供产气荚膜梭菌多重pcr分型的试剂盒，所述试剂盒包括检测检测产气荚膜梭菌α、β、ε毒素的引物。

本发明具体提供了一种多重pcr检测和分型产气荚膜梭菌的方法，具体步骤如下：

1.引物的设计与合成：

根据genbank中发表的产气荚膜梭菌编码α、β、ε3种毒素的基因序列（cap、cpb、etx）保守区设计3对引物，并由华大基因公司合成。

2.目标dna模板的制备

取菌液1.0ml，根据天根细菌基因组dna提取试剂盒的说明书提取。

50μl体系中加入25.0μlmix，11.0μlddh2o，模板，上下游引物各2μl。循环参数为：94℃预变性5min；94℃45s，55℃45s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸2min；目的片段长度分别为288bp、151bp、678bp。

本发明中，参照基因库（genbank）中登录号为x17300的α毒素基因序列，登录号为l13198的β毒素基因序列，登录号为x60694的ε毒素设计引物，本领域普通技术人员可以通过公众的渠道获知。

本发明进一步对产气荚膜梭菌检测方法的特异性和敏感性进行了确证。

用本发明提供的扩增体系分别扩增了腐败梭菌、巴氏杆菌、牛、羊布鲁氏菌、大肠杆菌等核酸样品，被测样品均没有阳性扩增条带，表明该方法具有较好的特异性。

选取稀释度为1×10⁵copies/μl的dna模板，进行4次10倍倍比稀释，建立组内敏感性试验。结果显示敏感性在1×10²copies/μl，表明该方法具有良好的敏感性。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果。

本方法检测时间短，传统的毒素中和实验法对产气荚膜梭菌的分型时间至少要在7天以上，该发明检测时间包括样品前处理到获得检测结果在3天之内，比传统的中和实验方法至少也要缩短4天左右。检测灵敏度高，该方法可检测到1×10²copies/µl个拷贝的dna，。特异性好，通过对产气荚膜梭菌、腐败梭菌、巴氏杆菌等dna样品检测，只有产气荚膜梭菌检测为阳性。本方法流程简单，操作性强，易于掌握，只要具备分子生物学基础知识，无需良特别的训练便能很好完成。通过该方法的使用可实现对试验过程实施监测，有效的解决了传统检测方法中存在的假阴性结果，可以对实验室进行质量监控，确保检测结果的准确性。用该发明方法对11株分离的产气荚膜梭菌进行分型，均得到预期结果。

本方法能同时鉴别检测产气荚膜梭菌产生的α、β、ε3种毒素基因或进行单基因鉴定。该方法的建立为相关细菌检验检疫技术的研究提供了较好的借鉴意义，并为规范检测试剂向标准化水平的发展具有指导借鉴意义。该方法能够广泛应用于出入境检验检疫部门、畜牧兽医部门和养殖单位，为疫病的有效防控具有重要意义。

附图说明

图1：产气荚膜梭菌参考株多重pcr扩增α、β、ε结果：其中1、2、3、4分别为产气荚膜梭菌a型（α毒素）扩增产物，产气荚膜梭菌b型（α、β、ε毒素）扩增产物，产气荚膜梭菌c型（α、β毒素）扩增产物，产气荚膜梭菌d型（α、ε毒素）扩增产物，m为dl2000marker，5为空白对照。

图2：产气荚膜梭菌b型参考菌毒素基因pcr敏感性扩增结果：其中1～6泳道分别为1×10⁵～1×10⁰copies/μl为模板的进行的多重pcr扩增，7为空白对照，m为dl2000marker。

图3：产气荚膜梭菌参考菌a、b、c、d型多重pcr特异性扩增结果：其中1为a型参考菌2为b型参考菌，3为c型参考菌，4为d型参考菌，5为腐败梭菌，6为大肠杆菌，7为巴氏杆菌，m为dl2000marker。

图4：多重pcr扩增临床分离到的产气荚膜梭菌结果：其中m为dl2000maker，1为a型参考菌，2为b型参考菌，3为c型参考菌，4为d型参考菌，5~15为临床分离的产气荚膜梭菌，16为空白对照，m为dl2000marker。

具体实施方式

实施例一．引物设计与合成

根据genbank中发表的产气荚膜梭菌编码α、β、ε3种毒素的基因序列（cap、cpb、etx）保守区设计3对引物，并由华大基因公司合成。

本发明中的引物代号序列见表1

实施例二：目标模板的获得

无菌条件下取牛、羊肠道内容和其他组织，用接种环蘸取，划线接种于经胰蛋白胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂（tsc）上，37℃厌氧培养18h。挑取tsc平板上的黑色菌落，接种到厌气肉肝汤中培养18h，用天根细菌基因组试剂盒提取dna作为模版。

实施例三：多重pcr扩增体系的建立

pcr反应体系为50µl，取pcr管依次加入premixextap25µl、3对引物(10pmol/µl)各2µl、dna模版2µl、ddh2o11µl。于pcr仪进行如下反应：95℃预变性5min，95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min进行30个循环，然后再72℃延伸10min。pcr完成后取7µlpcr产物在1%琼脂糖凝胶中以110v的电压电泳30min，用凝胶成像仪观察并拍照。

多重pcr扩增参考菌毒素基因图参见附图1

实施例四：敏感性试验和特异性试验

用260nm分光光度计测定b型参考菌dna模版的浓度，并用公式计算拷贝数，取1×10⁵~1×10⁰copies/µl共6个稀释度，每个稀释度分别取2µl作为多重pcr反应模板，进行多重pcr扩增以检测其敏感性。

敏感性pcr图参见附图2

用腐败梭菌dna、巴氏杆菌dna和大肠杆菌dna按反应体系和反应参数，进行pcr特异性试验。取产气梭菌a、b、c、d型参考菌株dna作为阳性对照，同时设立阴性对照。

特异性pcr图参见附图3

实施例五：对样品的检测与分型

对11份牛、羊小肠分离的产气荚膜梭菌进行检测。由图可知，阳性对照出现相应扩增条带，阴性对照未出现扩增条带。其中有3份为产气荚膜梭菌a型，3份为产气荚膜梭菌c型，5份为产气荚膜梭菌d型。

样品检测分型pcr图参见附图4

以上实施例进一步说明了本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范畴。