本发明涉及细胞的体外培养领域，具体地说，是一种裸鼹鼠肺泡ii型上皮细胞的分离培养方法。
背景技术：
裸鼹鼠是一种分布于东非部分地区的挖掘类啮齿目动物，在分类学上属于哺乳纲、啮齿目、豪猪亚目、滨鼠科、异头鼠亚科、裸鼹鼠属、裸鼹鼠种。裸鼹鼠终生在黑暗的地下生活，能够适应低氧、高二氧化碳浓度的环境。裸鼹鼠的寿命是啮齿类中最长的，可达近三十年；对癌症具有超级免疫力，至今仍没有发现裸鼹鼠自发癌症的例子。裸鼹鼠长寿、抗衰老、耐低氧、抗肿瘤等特性引起了科学家的广泛关注，针对这些特性的研究成果已发表在nature、pnas等著名刊物上。
肺泡ii型上皮细胞(alveolarepithelialcellstypeii，aecii)是肺的功能性细胞，作为渗透性屏障，具有阻止组织间隙的大分子物质流入肺泡腔的功能，可以分化成为肺泡i型上皮细胞和成纤维细胞，具有肺干细胞的特性，能分泌抗菌物质，在免疫方面起重要作用。大量研究表明，肺泡上皮ii型细胞是肺癌的主要来源细胞，针对肺泡上皮ii型细胞的深入研究有助于进一步了解肺癌发生机制和寻找有效的治疗方法。获得纯度较高的裸鼹鼠肺泡上皮ii型细胞对于裸鼹鼠的耐低氧机制及抗肺肿瘤特性的研究是十分必要的。
自dobbs等首次报道对成年大鼠肺泡ii型上皮细胞提取方法以来，有许多学者进行了这方面的研究，使得该分离培养技术也更加的完善，但体外培养的肺泡上皮ii型细胞很快失去表达表面活性质的情况仍然存在，并很快会分化为i型肺泡上皮细胞。现有的裸鼹鼠肺泡ii型上皮细胞分离培养方法是借鉴小鼠肺泡上皮ii型细胞分离方法，取成年动物肺组织，剪碎成约1mm3大小后，进入消化过滤步骤，然后进行差速贴壁培养及免疫筛选纯化获得肺泡ii型上皮细胞。现有的方法中，消化步骤采用的胰酶和胶原蛋白酶浓度不是裸鼹鼠细胞分离最佳浓度，对肺泡上皮ii细胞损伤较大。目前裸鼹鼠igg还没有商品化的产品，采用小鼠的igg进行筛选，对裸鼹鼠细胞表面的iggfc片段受体的亲和性不高，并且igg针对裸鼹鼠细胞分选的包被浓度还需要进一步摸索。
裸鼹鼠肺泡上皮ii型细胞原代分离纯度不高，不利于通过该细胞对裸鼹鼠进行耐低氧抗肿瘤等方面的研究，国外尚未见这方面研究的报道。为了研究裸鼹鼠肺泡上皮ii型细胞在裸鼹鼠耐低氧抗肿瘤等方面发挥的作用，分离纯化、体外培养出较纯度的裸鼹鼠肺泡上皮ii型细胞是十分必要的。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种裸鼹鼠的肺泡ii型上皮细胞的分离培养方法，采用胰酶联合弹性蛋白酶消化分离，经过滤、差速贴壁、igg抗体筛选纯化获得裸鼹鼠肺泡ii型上皮细胞。
本发明的第一方面，提供一种裸鼹鼠肺泡ii型上皮细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
a、将成年裸鼹鼠肺组织，在预冷的洗涤液冲洗至清亮后剪碎备用；所述洗涤液的组成为：pbs溶液，0.005％-0.02％(w/v)dnasei；
b、按每只动物2ml的量加入组织消化液，33-37℃消化5min；所述组织消化液的组成为：d-hanks溶液，0.03％-0.08％(w/v)胰酶，0.001％-0.01％(w/v)ii型胶原酶，0.005％-0.02％(w/v)dnasei。
c、移出消化好的细胞悬液，加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化；所述抑制液的组成为：低糖dmem培养基、5％-15％(v/v)fbs、0.5％-2％(v/v)ps双抗、0.005％-0.02％(w/v)dnasei；
d、将步骤b和步骤c重复5到8次，至组织块基本消失；合并细胞悬液，经细胞筛过滤，收取滤液，离心收集细胞；
e、采用33-37℃预热的粘附培养基重悬细胞，接入包被igg的培养皿中，置于33-37℃、3-5％co2的环境下培养30-60min，轻柔收取未粘附的细胞再次接入包被igg的培养皿中培养30-60min；所述粘附培养基的组成为：低糖dmem培养基、5％-15％(v/v)fbs、0.5％-2％(v/v)ps双抗、0.005％-0.02％(w/v)dnasei；
f、吸取未黏附细胞，离心收集细胞，采用粘附培养基重悬细胞，吹打均匀后加入培养皿中，在33-37℃、3-5％co2的环境中培养20-30h换培养基，去除未贴壁细胞，以后隔天换液一次，直到上层没有悬浮细胞，即得裸鼹鼠肺泡ii型上皮细胞。
其中，步骤a具体还包括：将裸鼹鼠脱颈处死后，置于75％乙醇中浸泡5min，在超净台中尽快完整取下肺组织，在预冷的洗涤液冲洗至清亮后将肺组织剪成1mm3小块，移入青霉素小瓶。
在本发明的一个优选实施例中，步骤a中，所述洗涤液的组成为：pbs溶液、0.01％(w/v)dnasei。
在本发明的一个优选实施例中，步骤b中，所述组织消化液的组成为：d-hanks溶液、0.05％(w/v)胰酶、0.005％(w/v)ii型胶原酶、0.01％(w/v)dnasei。本发明采用胰酶联合胶原酶消化的方法，一方面降低胰酶浓度，另一方面采用对细胞基质有消化作用而对上皮细胞无影响的ii型胶原酶，从而在保证细胞消化效率的同时减少胰酶对细胞的损伤。
在本发明的一个优选实施例中，步骤c中，所述抑制液的组成为：低糖dmem培养基、10％(v/v)fbs、1％(v/v)ps双抗、0.01％(w/v)dnasei。
在本发明的一个优选实施例中，步骤d中，所述细胞筛为200目细胞筛。
在本发明的一个优选实施例中，步骤d中，100g离心5min收集细胞。
在本发明的一个优选实施例中，步骤e中，所述裸鼹鼠igg包被浓度为：0.1mg/cm2；两次黏附的时间为：40min。
在本发明的一个优选实施例中，步骤e中，所述粘附培养基的组成为：低糖dmem培养基、10％(v/v)fbs、1％(v/v)ps双抗、0.01％(w/v)dnasei。
在本发明的一个优选实施例中，步骤f中，在35℃、5％co2的环境中培养24h后更换培养基。
在细胞分离过程中，由于酶的作用，细胞受损释放出dna，与细胞外基质形成dna蛋白复合物，聚集细胞成团。因此，本发明在细胞分离全程各种溶液都加入了dnasei，防止细胞聚团。
本发明优点在于：
1、本发明的裸鼹鼠肺泡ii型上皮细胞的分离培养方法在已有方法上作了重要改进，以成年裸鼹鼠肺组织作为细胞提取的组织来源，一方面降低胰酶浓度，另一方面采用对细胞基质有消化作用而对上皮细胞无影响的ii型胶原酶，从而在保证细胞消化效率的同时减少胰酶对细胞的损伤。应用裸鼹鼠igg免疫筛选去除含有iggfc片段受体的成纤维细胞，肺泡巨噬细胞，淋巴细胞和中性粒细胞，而裸鼹鼠肺泡ii型上皮细胞没有iggfc片段受体，因此免疫筛选后去除了大部分细胞。差速贴壁的时间也是成功分离肺泡上皮细胞的关键，成纤维细胞贴壁时间短，免疫吸附的时间由差速贴壁的时间需求来决定。将细胞悬液反复短时贴壁，本发明采取两次各40min贴壁。
2、本发明建立了一套分离、培养裸鼹鼠肺泡ii型上皮细胞的方法，并对用该方法培养的细胞的生物学特性维持情况进行了评估，证实该培养方法能够获得纯度很高的裸鼹鼠肺泡ii型上皮细胞，从而为进一步深入研究裸鼹鼠肺泡ii型上皮细胞的增殖、分化、液体转运、合成分泌及其在肺损伤、修复等病理生理情况下的功能变化提供了可能。
附图说明
图1为倒置显微镜观察原代培养的裸鼹鼠肺泡ii型上皮细胞图；
图2为透射电镜鉴定裸鼹鼠肺泡ii型上皮细胞图；
图3为免疫荧光染色法在荧光显微镜下鉴定裸鼹鼠肺泡ii型上皮细胞图(a、细胞sftpc荧光染色；b、细胞dapi染色；c、a与b融合图)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
以下实施例所使用的主要材料及来源分别如下：
裸鼹鼠(第二军医大学实验动物中心)；
胰酶(gibco)；胶原蛋白酶(solarbio)；dmem低糖培养基(gibco)；fbs(gibco)；dnasei(solarbio)；双抗(gibco)；裸鼹鼠igg(裸鼹鼠血清经proteina亲和柱层析纯化获得)；sftpc抗体(proteintech)
洗涤液(pbs、0.01％dnasei)
组织消化液(d-hanks溶液、0.05％胰酶、0.005％ii型胶原酶、0.01％dnasei)
抑制液(低糖dmem培养基、10％fbs、1％ps双抗、0.01％dnasei)
黏附培养基(低糖dmem培养基、10％fbs、1％ps双抗、0.01％dnasei)
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1裸鼹鼠肺泡ii型上皮细胞分离培养方法
(1)将一只成年裸鼹鼠脱颈处死后，置于75％乙醇中浸泡5min，在超净台中尽快完整取下整个肺组织，在预冷的洗涤液冲洗至清亮后将肺组织剪成1mm3小块，移入一个青霉素小瓶。
(2)加入2ml组织消化液，35℃消化5min。移出消化好的细胞悬液，加入与组织消化液相等体积的抑制液终止消化；
(3)将步骤(2)重复5次，至组织块基本消失。合并细胞悬液20ml，经200目细胞筛过滤，收取滤液，100g离心5min收集细胞；
(4)采用35℃预热的5ml粘附培养基重悬细胞，接入包被igg的10cm培养皿中(包被浓度0.1mg/cm2)，置于35℃、5％co2的环境下培养40min，轻柔收取未粘附的细胞再次接入包被igg的10cm培养皿中培养40min；
(5)吸取未黏附细胞，100g离心5min收集细胞，采用8ml粘附培养基重悬细胞，吹打均匀后加入10cm培养皿中，在35℃、5％co2的环境中培养24h换培养基，去除未贴壁细胞，以后隔天换液一次，直到上层没有悬浮细胞，即得裸鼹鼠肺泡ii型上皮细胞。
实施例2实施例1的肺泡ii型上皮细胞的细胞鉴定及纯度与活力评估
1、细胞鉴定
①pro-sp-c免疫荧光染色鉴定
sp-c是肺泡ii型上皮细胞特异表达的肺泡表面活性蛋白，而其他3种表面活性蛋白sp-a、sp-b、sp-d在其它细胞中也有表达，故选用表面活性蛋白中的sp-c才能用来鉴定肺泡ii型上皮细胞。
待肺泡ii型上皮细胞爬片达理想密度，4％(w/v)多聚甲醛固定样本10min；pbs洗5min，0.1％(v/v)tritonx-100处理10min，增加细胞膜的通透性；山羊血清封闭1h；孵育一抗(sftpc用含0.1％(v/v)tritonx-100的pbs1：1000稀释)稀释，4℃过夜；另外用pbs代替一抗作阴性对照；pbs洗3遍，每次10min，孵育二抗(goatanti-rabbitigg(h+l))(用含0.1％tritonx-100的pbs1：200稀释)4℃过夜或37℃避光1h；加入dapi(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)室温3min-5min染核pbs洗3次，10min/次。抗淬灭剂封片。-20℃避光保存，直到荧光显微镜观察成像。
免疫荧光细胞化学染色可见sftpc经荧光二抗显色后，呈绿色颗粒状分布于胞浆中，细胞核被dapi染成蓝色(见图1.pro-sp-c)。
②透射电镜观察细胞超微结构鉴定
电镜是鉴定肺泡ii型上皮细胞的最可靠的方法，因为它可以清晰直观地观察到特征性的板层小体。
在10cm培养皿中培养的裸鼹鼠肺泡上皮ii细胞，长满80％～90％(7天)后，用细胞刮刀将其轻轻刮下，置于1.5mlep管中800rpm离心5min；去除上清，沿壁缓慢加入3％(v/v)戊二醛固定20min，再次2000rpm离心10min。再经2％(w/v)四氧化锇后固定、丙酮梯度脱水、环氧树脂包埋、超薄切片、锇酸染色后在透射电镜下，80kv观察拍片。
见图2，透射电镜能够清晰地观察到肺胞ii型上皮细胞特有的板层小体结构(呈同心圆、片层状分布)，同时也能观察到与表面活性物质分泌有关的绒毛结构。透射电镜下见到了呈同心圆排列的板层小体和微绒毛。
2、裸鼹鼠肺泡ii上皮细胞细胞纯度与活力评估
用sftpc免疫荧光法，随机多次计数五个不同视野中阳性着色细胞数评估细胞的纯度；
台盼蓝染色评估细胞的活力：取对数生长期细胞，调整细胞密度为104/ml，接种于96孔培养板，每孔180μl，培养24h后加0.4％(w/v)台盼蓝，每孔20μl。用细胞全自动计数仪计数，拒染的为活细胞，计算活细胞的百分比，以判断细胞存活状况。
肺泡ii上皮细胞产量为3×105～7×105/克肺组织，sftpc染色评估细胞纯度可达(87±5)％。0.4％台盼蓝染色评估细胞的活力为(95±2)％。刚分离纯化得到的肺泡ii上皮细胞生长缓慢，在接种后48h才开始延展，60h能初步判断出呈圆形或立方形(ii上皮细胞形态特征)，胞浆中可见大量颗粒状物质，且具有呈小岛状生长的特点(图3)。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。