桑假尾孢菌rDNA及其在桑假尾孢菌分子检测中的应用的制作方法

本发明属于病原分子检测
技术领域：
。更具体地，涉及桑假尾孢菌rdna及其在桑假尾孢菌分子检测中的应用。
背景技术：
：桑污叶病是我国发病最广的病害(张月季，1975)。发病危害较严重，且发病范围具一定规模，夏秋开始发生，持续至入冬落叶，多发生于成熟老化的叶片上，嫩叶偶有发生，该病可使桑叶叶片叶质变劣，提早硬化，容易萎凋，不能用作食用桑，也不适于饲养蚕(王向东，2009)。桑污叶病的传播主要为在病叶组织内越冬的菌丝，在自然环境中越冬的分生孢子活力很差，不足以引起感染；次年越冬菌丝上产生分生孢子，传播引起初侵染，后在新病斑上又产生分生孢子进行再侵染，造成大面积发病(张月季，1975；王卫芳等，1994)。而且由于桑园病原菌积累等因素，发病率会逐年上升(黄章玉等，2013)。根据《中华人民共和国年鉴》气候卷(2015)对气候和温度带的划分可知，我国疆域广阔，南北跨纬度广，复杂的地形与降雨量、气候等共同造成了不同地区的生态环境多样性。由于各地区气候环境的差异，桑树病害的种类分布、危害程度、发病规律等存在较大差别(夏志松，2005)。部分地区较独特的气候环境可能使本地区的桑树以及桑树病害发作规律存在一些当地独有的特征(林寿康等，1983；陈赞华，2010；杜伟，2011)。如广东地区在气候区划上属于夏热冬暖地区，冬季温度不会如中国北方或中部长时间降至零度以下，可以假定在环境中越冬的桑污叶病分生孢子不会因寒冷而完全丧失侵染活力(伍红雨等，2014)。而夏秋季有台风过境，可能会扩大分生孢子的传播范围(唐晓春等，2003)。另外，该地区的桑树栽培方式多为灌木形式，这样种植的桑树桑叶密度较大，下层叶片不易见光，且空气流通较小，便于桑污叶病的发作；加上地气湿暖，温度与湿度均较适合病原真菌的生长(姚小英等，2015)。而桑污叶病的病原菌较为单一。目前没有桑假尾孢菌与同属的其他菌交叉感染，或跨寄主侵染的报道，基本可以确定桑污叶病的病原菌为单一的真菌，即桑假尾孢菌。桑污叶病的病征为叶片背面存在灰黑色病斑，而有病斑存在的叶片已不可用于生产使用。因此，在病害出现明显症状、大规模爆发前，检测叶片中病原菌的存在及其含量，对于实际工作具有重要的意义。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有桑污叶病的预测监控技术的缺陷和不足，提供一种在桑污叶病出现明显病症、病害大规模爆发前，检测叶片中病原菌的存在及其含量的技术，进而对桑园叶片等进行及时相应的处理。具体是在获得了桑假尾孢菌rdna全长的基础上，以18srrna基因和its1区段为靶基因，设计了桑假尾孢菌的特异检测引物，可以以病叶、菌丝体、病斑叶片、土壤、枝条等多种样本的总dna为模板，并且检测结果可靠、易于操作(简单快速)、特异性强、灵敏度高，可用于桑假尾孢菌的快速检测，尤其是侵染早期检测和土壤中、枝条上病原菌的快速检测，在桑假尾孢菌的实际检测应用中具有广泛的应用价值和意义。本发明的目的是提供一种桑假尾孢菌rdna。本发明另一目的是提供所述桑假尾孢菌rdna的18srrna序列和its1序列。本发明再一目的是提供所述桑假尾孢菌rdna、18srrna和its1在桑假尾孢菌分子检测中的应用。本发明再一目的是提供一组桑假尾孢菌特异性检测引物及检测试剂盒。本发明上述目的通过以下技术方案实现：一种桑假尾孢菌rdna，其核苷酸序列如seqidno.1所示。所述桑假尾孢菌rdna的18srrna，序列如seqidno.2所示。所述桑假尾孢菌rdna的its1，序列如seqidno.3所示。所述桑假尾孢菌rdna、所述18srrna或所述its1在桑假尾孢菌分子检测中的应用，或在制备桑假尾孢菌分子检测试剂方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。基于本发明人对桑假尾孢菌rdna的研究实验和针对性分析总结，选择该区段序列作为检测的靶基因，设计出一组桑假尾孢菌的特异检测引物，包括上游引物w1724f和下游引物w2196r，核苷酸序列分别如seqidno.4和seqidno.5所示。所述引物灵敏、快速、特异性高，依据本引物可有效地检测桑假尾孢菌，尤其是对侵染早期的检测和蚕卵中家蚕微孢子虫的快速检测，具有重要的意义。因此，所述桑假尾孢菌特异性检测引物在桑假尾孢菌分子检测中的应用或在制备桑假尾孢菌分子检测产品方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。一种包含有上述桑假尾孢菌特异性检测引物的桑假尾孢菌特异性检测试剂盒，也在本发明的保护范围之内。优选地，还包括dna提取所需试剂或pcr扩增反应所需试剂。所述试剂盒的使用方法为：以待测样本dna为模板，利用上游引物w1724f和下游引物w2196r进行pcr反应，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增dna片段的大小判定结果；所述判定结果的标准为：琼脂糖凝胶上出现特异性地473bp的dna片段产物，即样品中存在有桑假尾孢菌。其中，所述待测样本可以为桑叶、菌丝体、土壤、桑枝条等，适用范围广。优选地，所述pcr反应的反应体系为：其中，2×反应缓冲液的组分为taqdna聚合酶，160mmtris-hcl，40mm(nh4)2so4，3.0mmmgcl2，400μmdntp；优选地，所述pcr反应的程序为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，32个循环；72℃10min。本发明具有以下有益效果：本发明首次获得了桑污叶病病原菌——桑假尾孢菌的rdna全长序列，并对其进行了注释，确定了桑假尾孢菌的rdna各基因区段与转录间隔区(its)的核苷酸序列及其在rdna上的位置。并在此基础上，设计获得了一组特异性、灵敏性较好的快速检测桑假尾孢菌的引物组，该引物可用于桑污叶病的pcr检测，能够准确地判断样品是否含有桑假尾孢菌，且可为桑叶的健康生产与资源利用提供保证。另外，本发明引物及相关试剂可组装成试剂盒，使用方便。而且适用的pcr扩增模板非常多样，适用范围广，可以是多种样品的dna，病叶、菌丝体、病斑叶片、土壤、枝条等提取的总dna为模板，大大增加了检测对象的范围。重要的是，本发明的特异检测引物和试剂盒均能够在病原菌侵染早期就能够特异性的检测出来，为桑污叶病的早期检测提供了一种简单快速的方法，具有很好的实际推广应用前景。附图说明图1为引物its1/its4用于不同材料提取的总dna验证。注：m：takaradl2000marker；各泳道的dna模板提取材料分别为：1.实验组桑污叶病病叶病斑处的子实体；2病斑叶片；3.新鲜的发病病叶；4.老化的病叶；5.腐烂处理的病叶；6.风干的病叶；7.破损的病叶风干处理；8.破损叶片腐烂处理；泳道9.水(空白对照)。图2为引物p1-f/p1-r用于不同材料提取的桑污叶病病原菌dna验证。注：mtakaradl5000marker；各泳道的dna模板提取材料分别为：1.实验组桑污叶病病叶病斑处的子实体；2病斑叶片；3.新鲜的发病病叶；4.老化的病叶；5.腐烂处理的病叶；6.风干的病叶；7.破损的病叶风干处理；8.破损叶片风干处理；泳道9.菌丝体dna(阳性对照)；泳道10.桑叶dna(阴性对照)；泳道11.水(空白对照)。图3为引物w1724f/w2196r用于不同材料提取的桑污叶病病原菌dna验证。注：mtakaradl2000marker；各泳道的dna模板提取材料分别为：1.实验组桑污叶病病叶病斑处的子实体；2病斑叶片；3.新鲜的发病病叶；4.老化的病叶；5.风干的病叶；6.破损的病叶；泳道7.菌丝体dna(阳性对照)；泳道8.桑叶dna(阴性对照)；泳道9.水(空白对照)。图4为引物w1724f/w2196r的特异性验证。注：m：takaradl2000marker；泳道1-15为特异性测试；各泳道dna模版分别为：1为桑污叶病子实体dna；2为cladosporium属(枝孢霉)；3为penicilliumverruculosum(疣孢青霉)；4为aspergillus属(曲霉)；5为lecanicilliumpsalliotae(刀孢轮枝菌)；6为phanerinamellea(蜂蜜色蜡质菌)；7为.schizophyllumcommune(裂褶菌)；8为candidamucifera(假丝酵母)；9为lasiodiplodiatheobromae(桑根腐病病原菌)；10为pseudomonasaeruginosa(铜绿假单胞菌)；11为phyllactiniamoricola(桑里白粉病病原菌-桑球针壳)；12为ciboriacarunculoides(桑菌核病病原菌-肉阜状杯盘菌)；13为桑污叶病病原菌dna(阳性对照)；14为桑树dna(阴性对照)；15水(空白对照)。图5为引物w1724f/w2196r的灵敏度测试。注：m：takaradl2000marker；泳道1-6为敏感性测试；泳道1-6均为梯度稀释的病原菌dna；浓度分别为：1为30ng/μl；2为3ng/μl；3为3×10-1ng/μl；4为3×10-2ng/μl；5为3×10-3ng/μl；6为3×10-4ng/μl。图6为带明显病斑的桑污叶病桑叶。注：a.桑污叶病病叶叶面；b.桑污叶病病叶叶背；图中标尺为1cm。图7为回感叶片叶肉组织切片图。注：图为叶片横切面图，a为下表皮与海绵组织，b为下表皮、海绵组织、栅栏组织等部分，图中标尺为5μm，可见叶片内有菌丝生长。图8为桑园桑树枝条。注：a为有桑污叶病发作的桑树枝条；b为新生的桑树枝条；图中标尺为1cm。图9为患病桑树各部位病原菌存在性检测结果。注：m.takaradl1000marker；各泳道dna模板提取材料分别为：1、2.有病桑枝条；3.无病桑枝条；4、5.回感桑叶；6.有病斑桑叶；泳道7-11为不同梯度浓度的桑污叶病子实体dna(阳性对照)，浓度分别为：7为30ng/μl；8为3ng/μl；9为3×10-1ng/μl；10为3×10-2ng/μl；11为3×10-3ng/μl；12.桑树dna(阴性对照)；13.无菌水(空白对照)。图10为不同来源土壤中桑污叶病病原菌检测结果。注：m.takaradl1000marker；各泳道dna模板提取材料分别为：1.实验室桑树种植区泥土；2.回感实验区泥土；3-8为不同地区发病桑园的泥土；泳道9-13为不同梯度浓度的桑污叶病子实体dna(阳性对照)浓度分别为：9为30ng/μl；10为3ng/μl；11为3×10-1ng/μl；12为3×10-2ng/μl；13为3×10-3ng/μl；泳道14.桑树dna(阴性对照)；泳道15.无菌水(空白对照)。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1桑假尾孢菌的rdna全长序列获得1、利用高通量测序的方法，克隆获得了桑污叶病病原菌——桑假尾孢菌的rdna全长，如seqidno.1所示。2、根据测序结果的多次确认，对桑假尾孢菌的rdna全长进行了注释，如表所示，确定了桑假尾孢菌的rdna各基因区段与转录间隔区(its)的核苷酸序列及其在rdna上的位置。表1假尾孢属菌全rdna序列注释featurestart(bp)end(bp)length(bp)ets1133233218srrna33320591726its1206022251655.8srrna22262366140its22367251614928srrna251758153298ets258166084268实施例2检测引物设计及pcr扩增方法的建立1、引物设计在获得桑假尾孢菌rdna全长的基础上，设计了多对引物，通过大量的特异性和灵敏性检测，最终选取了2对有代表性的引物组，引物序列如下：p1-f/p1-r引物组上游引物p1-f：5’-gtttcaacgggtaacgggga-3’下游引物p1-r：5’-tccctacctgatccgaggtc-3’w1724f/w2196r引物组上游引物w1724f(seqidno.4)：5’gctacactgacagagccaacg3’下游引物w2196r(seqidno.5)：5’gctacactgacagagccaacg3’。2、pcr扩增方法的建立以病叶、枝条、土壤的总dna为模板，用实施例1所述的引物进行pcr扩增。所述pcr反应体系(总体积20μl)：其中，2×taqmastermix(反应缓冲液)的组分为taqdna聚合酶，160mmtris-hcl，40mm(nh4)2so4，3.0mmmgcl2，400μmdntp。pcr反应的程序为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。3、结果判断第一对引物its1/its4(已有的真菌通用检测引物)病叶样品检测：pcr反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据是否扩增到500-600bp的dna片段判定真菌dna是否提取成功。当能扩增出500-600bp的dna片段产物，即可判断总dna提取成功。第二对引物p1-f/p1-r：pcr反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据是否扩增到1935bp的dna片段判定样品中是否含有桑假尾孢菌存在。当能特异性地扩增出1935bp的dna片段产物，即可判断样品中存在桑假尾孢菌。第三对引物w1724f/w2196r：pcr反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据是否扩增到473bp的dna片段判定样品中是否含有桑假尾孢菌存在。当能特异性地扩增出473bp的dna片段产物，即可判断样品中是否含有桑假尾孢菌存在。4.不同材料中病原菌的检测。琼脂糖凝胶电泳检测结果分别如附图1～3所示，引物its1/its4能扩增植物与真菌的dna，得到结果均为两条带，而引物p1-f/p1-r和引物w1724f/w2196r均能够特异检测到桑假尾孢菌的存在。另外，按照检测引物的扩增产物大小适中的原则，引物w1724f/w2196r和建立的pcr方法可以更好的用于桑假尾孢菌的快速检测。实施例3引物w1724f/w2196r的特异性检测1、分别以多种从污叶病病斑菌丝体中分离到的真菌和细菌，以及同为桑树病原真菌的桑里白粉病病原菌(phyllactiniamoricola)和桑菌核病病原菌(ciboriacarunculoides)作为对照组，利用引物w1724f/w2196r，以实施例2的方法进行pcr扩增，扩增结束后琼脂糖凝胶电泳检测结果。2、引物的扩增结果分别如附图4所示。结果显示，只有桑污叶病病原菌(桑假尾孢菌)dna在目标位置(473bp)有条带。表明该引物组可以特异性的检测桑假尾孢菌。实施例4引物w1724f/w2196r的灵敏性检测1、提取桑假尾孢菌的dna，原始浓度为30ng/μl。将上述dna用1×te进行稀释，分别稀释10、102、103、104、105、106倍。即得到浓度梯度为3.0、3.0×10-1、3.0×10-2、3.0×10-3、3.0×10-4、3.0×10-5ng/μl。2、以上述各浓度的dna为模板，以引物w1724f/w2196r，以实施例2的方法进行pcr扩增，扩增结束后琼脂糖凝胶电泳检测结果。3、结果如图5所示，引物w1724f/w2196r能检测到3.0×10-2ng/μl浓度的病原菌dna，具有很好的检测灵敏性。因此，综上所述，从特异性和灵敏性的角度考虑，只有引物w1724f/w2196r既能够特异性的检测桑假尾孢菌，又具有很好的检测灵敏性。以下实施例进一步对引物w1724f/w2196r的检测适用性和灵敏性进行测试。实施例5感染桑假尾孢的桑叶与患病桑叶的病原菌检测1、材料的选定选择的实验材料，包括患病桑园的枝条，与无病的新鲜纸条；回感实验叶肉中有菌丝生长的叶片，以及带病斑的叶片等材料，如附图6-8所示。2、包含桑树成分的材料总dna提取使用鼎国植物基因组dna提取试剂盒(lot：69700110)进行dna的提取，步骤如下：选取含植物组织材料，使用液氮充分研磨至粉末；1.5ml离心管中加入800μl的lysisbuffer，并添加β-巯基乙醇至终浓度0.1％；加入液氮研磨后的粉末样品，65℃恒温金属浴30分钟至2小时；先使用500μl酚/氯仿/异戊醇振荡混匀5分钟，后12000r/min离心10分钟，取上清；加入500μl氯仿，振荡混匀5分钟，后12000r/min离心10分钟，取上清；加入700μl的bindingbuffer，混匀；吸取混合液于离心柱中，12000r/min离心1分钟，弃滤液；加入700μl的washingbuffera，12000r/min离心1分钟，弃滤液；加入700μl的washingbufferb，12000r/min离心1分钟，弃滤液；加入500μl的washingbufferb，12000r/min，离心1分钟，弃滤液；再次12000r/min离心2分钟，弃滤液弃收集管；将离心柱装入1.5ml离心管中，加入50μltebuffer，室温放置3分钟，12000r/min离心2分钟；重复上一步骤，即获得纯度较高的总dna。3、pcr检测以步骤2得到的各材料提取dna为模板，用特异性引物w1724f/w2196r进行pcr反应。反应结果如附图9所示，桑污叶病发作的桑园的桑枝条与回感实验叶片中存在菌丝的材料，均可检测出病原菌dna的存在。如图9所示，发作过桑污叶病的桑树枝条上检测到病原菌dna存在(泳道1、泳道2)，而用作对照的新鲜桑枝)则未检测出病原存在(泳道3)，证明有桑污叶病发作过的桑园，其桑树枝条上存在有病原菌。而通过条带亮度对比发现，提取dna时选用同样质量的材料(桑枝表皮与桑叶)，dna条带亮度差别不大，说明桑树枝条上病原菌(泳道1、2)含量不少于叶面带病斑的桑叶材料(泳道6)，dna浓度介于3ng/μl与30ng/μl之间(泳道7与泳道8)，表明桑枝条上的病原菌数量是较为可观的，引发病害再侵染的可能性接近带病斑较多的叶片。而回感实验中处于潜育期的桑叶(泳道4、5号)，条带亮度与阳性对照(泳道10)较接近，故猜测dna浓度应在3×10-2ng/μl左右，表明当叶片处于潜育期，病原菌数量较少时，仍能检测到病原菌存在，说明该引物可用于叶片的污叶病病害诊断。由图9结果可知，在桑树病害防控时，应考虑桑树枝条在病原菌传播循环中的作用，在桑园管理时，应做好桑枝条的处理工作。实施例6患病桑园泥土中的病原菌检测1、土壤总dna的提取土壤中真菌dna的提取理念参考林福呈等(2010)的方法，并做修改。步骤如下：采集自不同桑区的每份的泥土采集量超过10克，对采集的泥土样品进行充分研磨，去除不能研磨的石籽与沙砾，称取研磨后的泥土0.5克，采用试剂盒genview进行dna的提取，提取方法略作改动。所用于提取dna的泥土样品呈粉末状，不适合使用液氮研磨；且为保证提取dna的含量，使用的样品量远多于试剂盒要求的100mg或30mg，为避免浪费试剂盒材料，将对实验步骤略作改动。称取研磨后的泥土0.5克，加入试剂bufferp1体积为1ml，且加入蛋白酶k与rnasea，进行水浴消化处理，时间为65℃3小时左右，期间不断震荡混匀，后加入500μl氯仿，振荡混匀5分钟，后12000r/min离心10分钟，取上清；加入700μl的buffergf2(盐溶液使dna析出)，混匀；吸取混合液于离心柱中，静置2分钟，12000r/min离心1分钟，弃滤液；加入700μl的bufferwf1(高浓度乙醇洗去盐分)，静置2分钟，12000r/min离心1分钟，弃滤液；加入700μl的bufferwf2(75％乙醇)，12000r/min离心1分钟，弃滤液；加入500μl的bufferwf2，12000r/min，离心1分钟，弃滤液；再次12000r/min离心2分钟，弃滤液弃收集管；将离心柱装入1.5ml离心管中，加入50μl洗脱液elution(溶解dna)，室温放置5分钟，12000r/min离心2分钟；重复上一步骤，即获得纯度较高的总dna。2、pcr检测以步骤1得到的各材料提取dna为模板，用特异性引物w1724f/w2196r进行pcr反应。反应结果如附图10所示，桑污叶病发作的桑园泥土中，均可检测出病原菌dna的存在。土壤样品均为冬季收集，可知桑污叶病的发病区土壤中均可提取到桑污叶病病原菌的dna，浓度各有差别；泳道1样品条带亮度与泳道12相近，病原菌dna浓度应为3×10-2ng/μl左右；泳道2亮度远弱于阳性对照12号，猜测病原菌dna浓度应略大于3×10-3ng/μl；泳道3条带亮度与阳性对照11号相近，病原菌dna浓度应为3×10-1ng/μl左右；泳道4条带亮度介于阳性对照(泳道11与12)之间，病原菌dna浓度应为3×10-1ng/μl至3×10-2ng/μl之间；泳道5、泳道8条带稍亮，泳道6、泳道7条带极弱，表明土壤中分生孢子较少；条带亮度弱于阳性对照12号，病原菌dna浓度应低于3×10-2ng/μl，而高于3×10-3ng/μl。sequencelisting<110>华南农业大学<120>桑假尾孢菌rdna及其在桑假尾孢菌分子检测中的应用<130><160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>6084<212>dna<213>桑假尾孢菌的rdna全长<400>1cacctgtgtaccggtaaccgccttcgggcgtgactggcgacaggtagcctcctcttgcgg60tggatatgcctcagtattgatgactcgctcgtcaatttcttacgcggacttcactgtgag120gaattcggttgtggcaattggatggcgatttggttaatcgaagggctcacgccccgagag180gagccgttcgccgggtgagcgatcatcccgacctttaactaactctgacctctcgcttcg240gcgttggtcttcaaagatagttacctggttgattctgccagtagtcatatgcttgtctca300aagattaagccatgcatgtctaagtataagcaactatacggtgaaactgcgaatggctca360ttaaatcagttatcgtttatttgatagtaccttactacatggataaccgtggtaattcta420gagctaatacatgctaaaaaccccaacttcggaaggggtgtatttattagataaaaaacc480aatgcccttcggggctccttggtgaatcataataacttcacgaatcgcatggccttgcgc540cggcgatggttcattcaaatttctgccctatcaactttcgatggtaggatagaggcctac600catggtttcaacgggtaacggggaattagggttcgactccggagagggagcctgagaaac660ggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcccgacacggggagg720tagtgacaataaatactgatacagggctcttttgggtcttgtaattggaatgagtacaat780ttaaatcccttaacgaggaacaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaatt840ccagctccaatagcgtatattaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaaccttgg900gcctggctggccggtccgcctcaccgcgtgtactggtccggccgggcctttccttctggg960gagcctcatgcccttcactgggcgtgttggggaaccaggacttttactttgaaaaaatta1020gagtgttcaaagcaggcctttgctcgaatacattagcatggaataatagaataggacgtg1080tggttctattttgttggtttctaggaccaccgtaatgattaatagggacagtcgggggca1140tcagtattccgttgtcagaggtgaaattcttggatttacggaagactaactactgcgaaa1200gcatttgccaaggatgttttcattaatcaggaacgaaagttaggggatcgaagacgatca1260gataccgtcgtagtcttaaccataaactatgccgactagggatcggtggatgttatcttt1320ttgactccatcggcaccttacgagaaatcaaagtttttgggttctggggggagtatggtc1380gcaaggctgaaacttaaagaaattgacggaagggcaccaccaggcgtggagcctgcggct1440taatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacacaagtaggattgacagattg1500agagctctttcttgattttgtgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgat1560ttgtctgcttaattgcgataacgaacgagaccttaacctgctaaatagccaggcccgctt1620tggcgggtcgccggcttcttagagggactatcggctcaagccgatggaagtttgaggcaa1680taacaggtctgtgatgcccttagatgttctgggccgcacgcgcgctacactgacagagcc1740aacgagttcatcaccttggccggaaggtctgggtaatcttgttaaactctgtcgtgctgg1800ggatagagcattgcaattattgctcttcaacgaggaatgcctagtaagcgcatgtcatca1860gcatgcgttgattacgtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgctactaccgattgaa1920tggctcagtgaggcctccggactggcccagggaggtcggcaacgaccacccagggccgga1980aagttggtcaaactcggtcatttagaggaagtaaaagtcgtaacaaggtctccgtaggtg2040aacctgcggagggatcattactgagtgagggctcacgcccgacctccaaccctttgtgaa2100ccaaacttgttgcttcgggggcgaccctgccgacgactccgtcgccgggcgcccccggag2160gtcttctaaacactgcatctttgcgtcggagtttcaaacaaatgaaacaaaactttcaac2220aacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtga2280attgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgccctttggtattccg2340aagggcatgcctgttcgagcgtcatttcaccactcaagcctggcttggtattgggcgccg2400cggtgtttccgcgcgcctgaaagtcttccggctgagctgtccgtctctaagcgttgtgga2460tttttcaattcgcttcggagtgcgggcggccgcggccgttaaatctttattcaaaggttg2520acctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaaaaga2580aaccaacagggattgccctagtaacggcgagtgaagcggcaacagctcaaatttgaaatc2640tggcgtaagcccgagttgtaatttgtagaggatgcttctgggtagcggccggtctaagtt2700ccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtatgtgactggcttgcaccctcca2760cgtagctccttcgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctctaaatgggaggtaaattt2820cttctaaagctaaataccggccagagaccgatagcgcacaagtagagtgatcgaaagatg2880aaaagcactttggaaagagagttaaaaagcacgtgaaattgttgaaagggaagcgcccgc2940aaccagactttgcggcggtgttcggccggtcttctgaccggtttactcgccgccgtgagg3000ccatcatcgtctgggaccgctggataagacctgaggaatgtagctcccttcggggtgtgt3060tatagcctctggtgatgcagcgcgtctcgggcgaggtccgcgcttcggcaaggatgatgg3120cgtaatggttgtcggcggcccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacatctatgcga3180gtgttcgggtgtcaaacccctacgcgtaatgaaagtgaacggaggtgggaactttttgtg3240caccatcgaccgatcctgatgtcctcggatggatttgagtaagagcatagctgttgggac3300ccgaaagatggtgaactatgcctgaatagggtgaagccagaggaaactctggtggaggct3360cgcagcggttctgacgtgcaaatcgatcgtcaaatttgggtataggggcgaaagactaat3420cgaaccatctagtagctggttcctgccgaagtttccctcaggatagcagtaacgttttca3480gttttatgaggtaaagcgaatgattagaggccttggggttgaaacaaccttaacctattc3540tcaaactttaaatatgtaagaagtccttgttacttagttgaacgtggacatttgaatgta3600ccgttactagtgggccatttttggtaagcagaactggcgatgcgggatgaaccgaacgcg3660aggttaaggtgccggaatatacgctcatcagacaccacaaaaggtgttagttcatctaga3720cagcaggacggtggccatggaagtcggaatccgctaaggagtgtgtaacaactcacctgc3780cgaatgaactagccctgaaaatggatggcgcttaagcgtattacccatacctcgccgcca3840gggtagaaacgatgccctggcgagtaggcaggcgtggaggctcgtgacgaagccttcgga3900gtgatccggggtagaacagcctctagtgcagatcttggtggtagtagcaaatactcaaat3960gagaactttgaggactgaagtggggaaaggttccgtgtgaacagcagttggacacgggtt4020agtcgatcctaagccatagggaagttccgttttaaagtgtgcgctccgcaccgcctggcg4080aaagggaagccggttaacattccggcacctcgatgtggattatccgcggcaacgcaactg4140aaggtggagacgtcggcgggggccccgggaagagttctcttttcttcttaacggtccatc4200accctgaaatcggtttgtccggagctagggtttaacgaccggtagagcggcacacctttg4260tgccgtccggtgcgctcccgacgacccttgaaaatccgccggaaggaatgattttcacgc4320gaggtcgtactcataaccgcagcaggtctccaaggtgaacagcctctagttgatagaaca4380atgtagataagggaagtcggcaaaatagatccgtaacttcgggaaaaggattggctctaa4440gggttgggcgcgttgggccttgggcagattccccgggagcaggtcggcactagcttcacg4500gccggcgccttccagcacccggtggcggacgcccttggcaggcttcggccgtccggcgcg4560cgcttaacaaccaacttagaactggtacggacaaggggaatctgactgtctaattaaaac4620atagcattgcgatggtcagaaagtgatgttgacgcaatgtgatttctgcccagtgctctg4680aatgtcaaagtgaagaaattcaaccaagcgcgggtaaacggcgggagtaactatgactct4740cttaaggtagccaaatgcctcgtcatctaattagtgacgcgcatgaatggattaacgaga4800ttcccactgtccctatctactatctagcgaaaccacagccaagggaacgggcttggcaga4860atcagcggggaaagaagaccctgttgagcttgactctagtttgacattgtgaaaagacat4920agggggtgtagaataggtgggagcttcggcgccggtgaaataccactacccttatcgttt4980ttttacttaatcaatgaagcggaactggtcttcaccgaccattttctggcgttaaggtcc5040ttcgcgggccgatccgggttgatgacattgtcaggtggggagtttggctggggcggcaca5100tctgttaaaccataacgcaggtgtcctaagggggactcatggagaacagaaatctccagt5160agagcaaaagggcaaaagtccccttgattttgattttcagtgtgaatacaaaccatgaaa5220gtgtggcctatcgatccttta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