本发明属于饲料添加剂技术领域，具体涉及一种用于动物饲料的富锌酵母产品及其生产方法。
背景技术：
锌是动物机体所必需的微量元素，被称为“生命元素”。锌能促进动物生长发育，影响骨骼形成，维持免疫机能，在哺乳动物和禽类体内含量平均为30mg/kg。锌参与调控了机体几乎所有免疫细胞的功能和生长发育，在体内代谢所需的200多种酶中均发现有锌的存在。例如，在畜牧生产中，日粮中锌不足或吸收不良，会影响动物体的蛋白质代谢并导致动物采食量减少，会引发腹泻、生长不良、单位增重饲料消耗增加、骨骼发育不健全等多种不利于养殖生产的情况发生。目前动物饲养补充锌的主要途径是在饲料中额外添加所需的锌，大部分以无机锌为主。无机锌吸收利用率较低，在饲料中添加过量的锌，不仅增加了生产成本而且还会增加粪便中锌的沉积，给生态环境造成环境污染。在畜禽养殖生产中，锌等微量元素的排放已逐渐成为困扰农业可持续发展的亟待解决的问题之一。
目前，国内大多采用高剂量氧化锌、硫酸锌等无机锌作为锌营养添加剂，但无机锌生物效价低、添加量大、易造成了严重的环境污染；而稳定性好、生物学效价较高的氨基酸络合锌盐(如蛋氨酸锌、葡萄糖酸锌等)由于其生产工艺复杂、价格较高限制其应用。而富锌酵母不仅可以满足动物机体对于锌的需要，而且酵母中有很丰富的营养成分，可以发挥协同作用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种富锌酵母产品及其生产方法，为动物提供安全、高效的补锌剂。
为达到上述目的，发明人必需解决两个关键性的问题，一是制备耐高锌的酵母菌种；二是高锌含量富锌酵母的生产工艺。
本发明富锌酵母产品的生产方法包括如下步骤：
1)制备耐高锌的酵母菌种
1.1)啤酒酵母菌种接种到含锌的麦芽糖培养基中培养，筛选出抗锌能力强的菌种，作为诱变菌种；
1.2)将抗锌能力强的酵母菌种接种到诱变培养基上进行诱变培养20～45h；
1.3)将诱变后的菌株进行分离筛选，接种到含锌的麦芽糖培养基中培养，筛选出抗锌能力强的菌种，即为耐高锌富锌酵母菌种；
2)高锌含量富锌酵母的生产工艺
2.1)斜面菌种培养：耐高锌富锌酵母菌种接种于糖含量5～20％，含锌量20～500μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁固体培养基上，培养温度25～36℃，培养20～45h，得到斜面酵母菌种；
2.2)一级液体种子培养：将斜面酵母菌种稀释至菌株数496万/ml，取2ml稀释液接种于装有250ml糖含量5～20％，含锌量20～500μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁培养基的三角瓶中，培养温度25～36℃，培养20～45h，得到一级液体种子培养液；
2.3)二级液体种子培养：将100ml一级液体种子培养液接种于装有50～100l糖含量5～20％，含锌量20～500μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度25～36℃，培养20～45h，得到二级液体种子培养液；
2.4)发酵罐培养：将1000ml二级液体种子培养液接种于装有1000～2000l糖含量5～20％，含锌量20～500μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度25～36℃，培养20～45h，得到富锌酵母培养液；
2.5)分离干燥：分离机分离，60～90℃烘干；
2.6)粉碎：粉碎机粉碎后既得到富锌酵母产品，锌含量为每千克酵母1000～5000毫克。
所述的步骤1.1)和步骤1.3)中的含锌的麦芽糖培养基的总糖含量5～20％，含锌量20～1000μg/ml，ph值4.0～7.0，培养温度25～36℃，培养20～45h。
所述的步骤1.3)中的含锌的麦芽糖培养基的含锌量高于步骤1.1)中的含锌的麦芽糖培养基。
所述的步骤1.2)中的诱变培养基中的诱变剂为n-甲基-n-硝基-n-亚硝基胍，浓度1.8～3.2mg/ml，总糖含量5～20％，ph值4.0～7.0。
所述含锌的麦芽糖培养基所含锌为无机锌，所述的无机锌包括氧化锌、硫酸盐、碳酸盐或氯化物盐；所述麦芽糖培养基和诱变培养基的氮源为尿素、硝酸铵、硫酸铵和磷酸氢氨中的一种或几种；所述麦芽糖培养基和诱变培养基的磷源为植酸钙、磷酸氢氨、磷酸氢二氨、磷酸氢二钾中的一种或几种。
所述的筛选出抗锌能力强的菌种的方法为本领域的常规手段，也可以采用如下方法：分别配置不同锌浓度的的麦芽糖培养基，将啤酒酵母菌种分别接种不同锌浓度的的麦芽糖培养基中培养；培养后选定菌种部分存活的含锌溶度最高的麦芽糖培养基；该麦芽糖培养基中存活菌种作为抗锌能力强的酵母菌种，作为诱变菌种。
具体实施方式
实施例1
1)依据不同生化特性的酵母菌种接种到不同锌浓度的培养基中培养，筛选出抗锌能力强的酵母菌种，作为诱变菌种。
2)将抗锌能力强的酵母菌种接种到不同剂量的亚硝基的培养基上进行诱变；
3)将诱变的菌株进行分离筛选，接种到不同锌浓度的培养基中培养，筛选出生物量较高和抗锌能力强的菌种，即为耐高锌富锌酵母菌种；
4)筛选培养基及培养条件
麦芽糖培养基，总糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量20～500μg/ml，ph值4.0～7.0，培养温度25～36℃，培养20～45h。
实施例2
富锌酵母生产工艺：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐培养→分离干燥→粉碎→富锌酵母产品。
1)斜面菌种培养：富锌酵母菌种接种于糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量20μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁固体培养基上，培养温度25～36℃，培养20～45h。
2)一级液体种子培养：将斜面酵母菌种接种于50个装有250ml糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量20μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁培养基的三角瓶中，培养温度25～36℃，培养20～45h。
3)二级液体种子培养：将一级液体种子培养液接种于装有50～100l糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量20μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度25～36℃，培养20～45h。
4)发酵罐培养：将二级液体种子培养液接种于装有1000～2000l糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量20μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度25～36℃，锌分批次加入，培养20～45h。
5)分离干燥：分离机分离，60～90℃烘干。
6)粉碎：粉碎机粉碎后既得到高锌含量富锌酵母，锌含量为每千克酵母1050毫克。
实施例3
富锌酵母生产工艺：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐培养→分离干燥→粉碎→富锌酵母产品。
1)斜面菌种培养：富锌酵母菌种接种于糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量500μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁固体培养基上，培养温度25～36℃，培养20～45h。
2)一级液体种子培养：将斜面酵母菌种接种于50个装有250ml糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量500μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁培养基的三角瓶中，培养温度25～36℃，培养20～45h。
3)二级液体种子培养：将一级液体种子培养液接种于装有50～100l糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量200μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度25～36℃，培养20～45h。
4)发酵罐培养：将二级液体种子培养液接种于装有1000～2000l糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量500μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度25～36℃，锌分批次加入，培养20～45h。
5)分离干燥：分离机分离，60～90℃烘干。
6)粉碎：粉碎机粉碎后既得到高锌含量富锌酵母，锌含量为每千克酵母5000毫克。
实施例4
富锌酵母生产工艺：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐培养→分离干燥→粉碎→富锌酵母产品。
1)斜面菌种培养：富锌酵母菌种接种于糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量80μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁固体培养基上，培养温度25～36℃，培养20～45h。
2)一级液体种子培养：将斜面酵母菌种接种于50个装有250ml糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量80μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁培养基的三角瓶中，培养温度25～36℃，培养20～45h。
3)二级液体种子培养：将一级液体种子培养液接种于装有50～100l糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量80μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度25～36℃，培养20～45h。
4)发酵罐培养：将二级液体种子培养液接种于装有1000～2000l糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量80μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度25～36℃，锌分批次加入，培养20～45h。
5)分离干燥：分离机分离，60～90℃烘干。
6)粉碎：粉碎机粉碎后既得到高锌含量富锌酵母，锌含量为每千克酵母2000毫克。
实施例5
富锌酵母生产工艺：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐培养→分离干燥→粉碎→富锌酵母产品。
1)斜面菌种培养：富锌酵母菌种接种于糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量200μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁固体培养基上，培养温度25～36℃，培养20～45h。
2)一级液体种子培养：将斜面酵母菌种接种于50个装有250ml糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量200μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁培养基的三角瓶中，培养温度25～36℃，培养20～45h。
3)二级液体种子培养：将一级液体种子培养液接种于装有50～100l糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量200μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度25～36℃，培养20～45h。
4)发酵罐培养：将二级液体种子培养液接种于装有1000～2000l糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量200μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度25～36℃，锌分批次加入，培养20～45h。
5)分离干燥：分离机分离，60～90℃烘干。
6)粉碎：粉碎机粉碎后既得到高锌含量富锌酵母，锌含量为每千克酵母3000毫克。
实施例6
富锌酵母生产工艺：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐培养→分离干燥→粉碎→富锌酵母产品。
1)斜面菌种培养：富锌酵母菌种接种于糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量20～500μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁固体培养基上，培养温度25～36℃，培养20～45h。
2)一级液体种子培养：将斜面酵母菌种接种于50个装有250ml糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量20～500μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁培养基的三角瓶中，培养温度25～36℃，培养20～45h。
3)二级液体种子培养：将一级液体种子培养液接种于装有50～100l糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量20～500μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度25～36℃，培养20～45h。
4)发酵罐培养：将二级液体种子培养液接种于装有1000～2000l糖含量5～20％，含锌(无机锌盐)量20～500μg/ml，ph值4.0～7.0的麦芽汁培养基的发酵罐中，培养温度25～36℃，锌分批次加入，培养20～45h。
5)分离干燥：分离机分离，60～90℃烘干。
6)粉碎：粉碎机粉碎后既得到高锌含量富锌酵母，锌含量为每千克酵母4000毫克。
实施例7
1试验动物
试验动物：选取体重约20kg的“杜×长×大”三元杂交猪120头，按照遗传背景相同、体重相近、窝别相同的原则随机分为3组，每组4重复，每个重复10头。
2试验材料
2.1富锌酵母产品
由实施例6方法制备富锌酵母产品，锌含量为4000mg/kg。
2.2试验日粮
试验组日粮按照本发明配方进行配制，其饲料配方具体为：玉米51.40％；大麦6％；小麦6％；膨化大豆6.75％；脱皮豆粕19.10％；次粉5％；棉粕5％；豆油0.50％；食盐0.25％；所述的预混料中还包含维生素类和微量元素，其中每千克日粮中zn元素的添加剂量分别为：100mg/kg。试验组日粮中锌元素的添加形式为酵母锌，而对照组日粮中zn元素的添加形式为硫酸锌。
3试验方法
3.1动物饲养试验
选取体重约20kg的“杜×长×大”三元杂交猪120头，随机分为2组，每组4重复，每个重复10头。对照组饲喂常规日粮，试验组按本配方配制日粮饲喂。试验按照猪的生长阶段分为前期(20～35kg)、中期(35～70kg)和后期(70～110kg)3个阶段。
在实验开始、第26天(20～35kg)、第72天(35～70kg)及实验结束(70～110kg)前1天20:00断料供水，次日08:00以重复为单位对所有试验猪进行空腹称体重，结算相应试验期的耗料情况，计算平均日增重(adg)、日采食量(adfi)和饲料利用率(f/g)。
试验期内提供适宜的温度湿度，地面饲养，通风，自由采食，饮水。免疫消毒程序按照猪场常规方法进行。
3.2屠宰试验
3.2.1组织中锌元素含量
屠宰后，取左肝内叶、左肾皮质、左心室心肌、左侧脾脏及背最长肌同一位置各约60g分装于样品袋中，-80℃保存。测定时准确称取0.5g左右组织样品，置于聚四氟乙烯消化罐中，加入5ml硝酸和2mlh202，于微波消解仪中消解，消解结束后赶酸冷却，用超纯水定容至50ml，同时做试剂空白测定。
3.2.2锌元素利用率
从试验开始，每隔10天，以重复为单位，均匀收集粪便，将其烘干(65℃)、回潮、制成风干样。同时对饲料进行取样，所采集的饲料和粪便都需粉碎、过孔径40目筛(0.45mm)，密封保存。用agilienticp-ms7500a电感耦合等离子体光谱仪测定矿物元素含量。
3.3数据统计分析
试验数据采用spss20.0统计分析软件处理数据，采用单因素方差分析onewayanova进行显著性检验，并采用duncan氏法经行多重比较，以p<0.05作为差异显著判断标准，试验结果以“平均数±标准差”表示。
4结果与分析
4.1本发明富锌酵母产品对生长肥育猪生长性能的影响
本发明富锌酵母产品对生长肥育猪生长性能的影响如表1和2所示，试验各组间体重、日增重、日采食量和料重比均无显著差异(p>0.05)。相比较而言，试验组其日采食量和料重比均优于对照组。说明本发富锌酵母产品方对育肥猪生长性能无影响，且还有一定促生长作用。
表1本发明富锌酵母对生长肥育猪体重的影响(n＝4)(kg)
表2本发明富锌酵母产品对生长肥育猪生长性能的影响(n＝4)
4.2本发明富锌酵母产品对生长肥育猪组织锌元素沉积的影响
本发明富锌酵母产品对生长肥育猪血清、组织中锌元素含量的影响如表3所示，血清及组织中锌元素含量基本趋于一致，其中对照组组织中锌元素含量略高于试验组，但两者无显著差异(p>0.05)。
表3本发明配方对生长肥育猪血清、组织锌元素含量的影响(n＝3)
4.3本发明富锌酵母产品对生长肥育猪粪便中锌元素排泄的影响
本发明富锌酵母产品对生长肥育猪锌元素排泄的影响如表4所示。各阶段锌元素排泄量组间差异显著(p<0.05)，试验组锌元素排泄量显著低于对照组。以20～35kg阶段锌的排泄量为例，试验组和对照组组组间差异显著(p<0.05)，试验组比对照组分别降低了25.87％。这说明本发明富锌酵母产品可显著降低了生长肥育猪的粪便中锌元素的排泄量。
表4本发明富锌酵母对生长肥育猪锌元素排泄的影响(n＝4)
5.结论
本发明富锌酵母产品对生长肥育猪生长性能及组织中锌元素沉积没有影响，且可以显著降低生长肥育猪粪便中锌元素排泄量，从而证明富锌酵母产品对于猪只健康生长及保护环境的有效性。