一种用重组大肠杆菌菌株制备麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法与流程

技术领域：
：本发明属于生物工程领域。
背景技术：
：：海藻糖是一种非还原性二糖，是细胞对环境变化形成的一种典型的应激代谢物。它的分子结构(旋光度和溶解性质)和化学性质特殊，是非常稳定的二糖。海藻糖在生物细胞中的作用是保护细胞抵抗不良环境的影响，其功能是保护细胞质膜，蛋白质、核酸等生物大分子空间结构和功能活性，维持渗透压和防止细胞内营养成分流失，维持生物体的正常生命活动，是一天然的生命保护者。海藻糖不具有还原性，不会发生美拉德反应，因此外源性的海藻糖具有良好的非特异性保护作用，因此有人把海藻糖称为“生命之糖”。海藻糖具有抗冷冻性、保湿性、耐高温性、干燥抗性，非还原性，良好的加工特性，化学稳定性，与其它糖类相比，更具安全性、非龋齿性及无异味性，优质甜味，低热值，防龋齿等特性，因此可用于医学生物制品中起到保护剂的作用；增强农作物抗逆性，通过转基因手段来培育耐盐碱型农作物，培育抗冻果蔬等；同时，可以作为稳定的添加剂应用于食品工业等。因此，海藻糖具有广泛的应用前景和较高的商业价值。目前国内外常见的生产海藻糖的方法有三种：一是生物细胞提取法；二是微生物发酵生产法；三是采用微生物发酵提取相关海藻糖合成酶，利用酶法合成海藻糖，这也是目前发酵生产海藻糖的主流方法。其中，酶法合成海藻糖主要指由麦芽寡糖基海藻糖合成酶(mtsase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(mthase)双酶共同作用于淀粉或麦芽糊精生成海藻糖，反应产物主要为海藻糖，以及少量副产物(如葡萄糖、麦芽糖等)。双酶法以淀粉为原料，生产成本低，且副产物少，易于产物的分离纯化，适合工业化生产。实验菌株大肠杆菌中的e.coli表达系统是基因工程中最常用的外源蛋白表达系统，但e.coli表达系统表达的外源蛋白常常容易形成无活性的包涵体，特别是胞内表达的蛋白。目前，提高外源蛋白在大肠杆菌内可溶性表达策略主要有降低蛋白质合成速率、培养基中加入一些添加剂、选择恰当的表达载体和表达宿主、与分子伴侣共表达以及与增溶标签融合表达等。但以上策略对本专利中使用的trh201菌株表达的mthase可溶性均无明显的提高作用。技术实现要素：本发明人为了实现trh201菌株能显著提高mthase可溶性，经过广泛的研究和实验，找到了一种提高麦芽寡糖基海藻糖水解酶(mthase)在大肠杆菌中可溶性表达的方法。本发明的主要方法包括：重组大肠杆菌高密度培养的培养基制备；重组大肠杆菌trh201种子液制备；trh201高密度培养的菌体增长阶段和诱导阶段的调控方法。本方法有如下优势：(1)所用的种子培养基和发酵培养基均为化学成分确定的培养基，该培养基成本低廉，不含有任何有机态氮源，如酵母浸提物、蛋白胨等。(2)本方法在菌体诱导期通过对特定参数的调整，使菌体表达的可溶性mthase含量大幅提高，克服了该酶在大肠杆菌中可溶性表达量低的技术障碍。(3)采用本方法制备得到的mthase酶活力是采用常规方法同等菌量的14.9倍，酶活力大幅提高。附图说明图1mthase优化前蛋白样品图。图2mthase优化后蛋白样品图。图3海藻糖出峰位置hplc图。图4海藻糖标准曲线图。图5mthase酶活测定曲线图。具体实施方式：下述实施方式中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施方式中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施方式中的种子培养基(lb培养基)组成：1％蛋白胨，0.5％酵母浸提粉，1％氯化钠，ph约7.0。下述实施方式中的zym自诱导培养基为无菌培养基，其成分如下：100mla+2mlb+2mlc+200μld+100μle；a为zy溶液，zy溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：1％(质量百分比浓度)胰蛋白胨和0.5％(质量百分比浓度)酵母粉；b为50×m溶液，50×m溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：1.25mna2hpo4，1.25mkh2po4，2.5mnh4cl和0.25mna2so4；c为50×5052溶液，50×5052溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：25％(质量百分比浓度)甘油，2.5％(质量百分比浓度)葡萄糖，10％(质量百分比浓度)l-阿拉伯糖；d为1mmgso4水溶液；e为1000×微量元素溶液，1000×微量元素溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：50mmfecl3，20mmcacl2，10mmmncl2，10mmznso4，2mmcocl2，2mmnicl2，2mmna2mo4，2mmna2seo3，2mmh3bo3。下述实施方式中的大肠杆菌bw25113在文献“tomoyababa,takeshiara,mikihasegawa,yukitakai,yoshikookumura,mikibaba,kirilladatsenko,masarutomita,barrylwanner,andhirotadamori1.constructionofescherichiacolik-12in-frame,single-geneknockoutmutants:thekeiocollection.molecularsystemsbiology(2006):1-11.”中公开过，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。本发明涉及重组大肠杆菌菌株trh201和trs101，其遗传学信息如下:菌株trh201、trh101分别是由pbad-mth载体、pbad-mts载体转化至大肠杆菌bw25113宿主菌中获得。pbad-mth载体为将序列1所示的麦芽寡糖基海藻糖水解酶(mthase)的编码基因的dna片段替换pbad载体(invitrogen，产品目录号：v430-01)的xhoi和ecori酶切位点间的片段，且保持pbad载体的其他序列不变得到的载体，该载体表达麦芽寡糖基海藻糖水解酶mthase。pbad-mts载体为将序列2所示的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(mtsase)的编码基因的dna片段替换pbad载体(invitrogen，产品目录号：v430-01)的xhoi和ecori酶切位点间的片段，且保持pbad载体的其他序列不变得到的载体，该载体表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶mtsase。分别将上述测序验证正确的表达载体转化至大肠杆菌bw25113感受态细胞中，得到重组菌pbad-mth/bw25113、pbad-mts/bw25113。对上述2株重组菌进行菌液pcr验证，结果表明2株菌均正确，扩增条带大小与目标条带大小相同。将重组菌pbad-mth/bw25113命名为trh201，将重组菌pbad-mts/bw25113命名为trs101。下述实施方式中的mthase酶活力测定，其步骤包括：(1)在冰浴条件下配制转化液，转化液中成分包括：de15麦芽糊精300g/l，ph7.0pbs缓冲液0.02m，普鲁兰酶(食品级杰能科，锐阳生物)5ml/l，mtsase粗酶6ml/l。待测mthase粗酶0.5ml/l。所述mtsase粗酶，指的是指由trs101经培养后的菌体，用高压匀质机破碎得到的液体。trs101菌体的培养方式可以是但不限于：在zym自诱导培养基中，30℃摇床培养18小时。(2)在40℃的条件下，搅拌或震荡反应1h。(3)将反应结束的反应液置于100℃水浴加热10min，使酶失活，终止反应；在离心机中12000rpm，离心10min，取上清，进行糖化，用hplc对海藻糖进行定量检测，计算mthase酶活。所述的糖化，包括糖化体系和糖化条件。所述的糖化体系，每升液体包括：100ml0.2mhac-naacph4.0缓冲液，10ml复合糖化酶(danisco公司p25型)，100ml反应结束后的转化液。糖化条件包括：将糖化体系置于三角瓶中，在水浴摇床中以40℃，200rpm反应3h；随后将反应结束的糖化体系置于100℃水浴加热10min，使酶失活，终止反应；在离心机中12000rpm，离心10min，取上清。所述的用hplc对海藻糖进行定量检测，其hplc的方法参数包括：hplc色谱柱为氨基柱(xbridgeamide3.5μm)；流动相为乙腈：0.02％氨水＝8:2；流速为1ml/min；柱温50℃；检测器为示差折光检测器(rid)，海藻糖出峰时间为17.8min左右，参见说明书附图3。海藻糖标准曲线的制作方法：分别配制浓度为30g/l，15g/l，7.5g/l，3.75g/l，1.875g/l，0.938g/l，0.469g/l，0.234g/l的海藻糖标准溶液，进行hplc检测，测得各个样品所对应的峰面积。以海藻糖浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立平面直角坐标系，将上述五个浓度及所对应的峰面积的点在图中标出，并拟合成正比例函数。海藻糖浓度与峰面积的标准曲线如说明书附图4所示。mthase酶活力定义：每1h转化de15淀粉生成1g海藻糖所需的mthase酶量为1u。待测样品酶活力＝(海藻糖浓度g/l-22.5g/l)÷0.5ml/l注：公式中的22.5g/l指的是，在无mthase酶参与的条件下，mtsase催化生成海藻糖的本底表达量，根据不同浓度mthase添加量的测算，海藻糖浓度应减去此值后才可正确反映mthase酶活力。见说明书附图5。本发明所述的高密度培养基，其中包括种子培养基、发酵培养基和补料培养基。所述的种子培养基为lb培养基。所述发酵培养基，包括：磷酸二氢钾1.5-15.2g/l；十二水合磷酸氢二钠8-10.2g/l；硫酸铵2-4g/l；七水合硫酸镁0.5-1.5g/l；葡萄糖5-25g/l；维生素b19mg/l；微量元素i10ml/l；聚醚类消泡剂1ml/l。所述发酵培养基中的微量元素i，包括：800-1000mg/l乙二胺四乙酸二钠，100-250mg/l六水合氯化钴，1500-2500mg/l四水合氯化亚锰，90-150mg/l二水合氯化铜，200-500mg/l硼酸，250-400mg/l二水合钼酸钠，1000-2500mg/l二水合乙酸锌，5-10g/l柠檬酸铁。所述发酵培养基中的七水合硫酸镁和葡萄糖需要分别单独灭菌后与其他成分混合。所述发酵培养基中的维生素b1，微量元素i，需分别单独用无菌滤膜过滤灭菌后与其他成分混合。所述补料培养基中，包括：葡萄糖400-600g/l；七水合硫酸镁1.0-2.0g/l；微量元素ii10ml/l。所述补料培养基中的微量元素ii，包括：900-1200mg/l乙二胺四乙酸二钠，400-600mg/l六水合氯化钴，1200-2400mg/l四水合氯化亚锰，100-300mg/l二水合氯化铜，200-500mg/l硼酸，300-250mg/l二水合钼酸钠，1500-2500mg/l二水合乙酸锌，1-4g/l柠檬酸铁。所述补料培养基中的葡萄糖和七水合硫酸镁需要分别单独灭菌后与其他成分混合。所述发酵培养基中的微量元素ii，需单独用无菌滤膜过滤灭菌后与其他成分混合。本发明提供的一种高密度培养菌株trh201制备麦芽寡糖基海藻糖水解酶(mthase)的方法，包括种子培养阶段，菌体增长阶段，诱导阶段。所述的种子培养阶段，是指将冻存的菌种以1％-5％的接种量，接种到装有50-100ml种子培养基的500ml三角瓶；于摇床30-37℃，180-280rpm的条件下培养5-12小时得到一级种子；再将一级种子以2％-10％的接种量，接种到装有50-100ml种子培养基的500ml三角瓶；于摇床30-37℃，180-280rpm的条件下培养5-12小时得到二级种子，二级种子的od600nm为1.5-4.0。所述的菌体增长阶段，是指将二级种子以2％-10％的接种量接种到发酵培养基装液量为30％-60％的发酵罐中，发酵罐通气量为1-6vvm，转速为200-1200rpm，溶氧偶联转速，或手动调节转速，使溶氧控制在10％-100％，优选的，30％-100％；ph为5.5-8.0，以浓度为5-10m氨水控制ph，培养温度为25-37℃；发酵液中初始葡萄糖耗尽后0-3h内启动补料培养基的流加，补料速率分布在7-28ml/(l·h)，补料速率恒定或不恒定。所述的诱导阶段，其特征在于：菌体的od600nm达到40后，调整发酵参数，并向发酵液中加入终浓度为0.002％-0.2％的l-阿拉伯糖，诱导mthase表达；发酵时间达到25-35h时，停止发酵，并收集菌体，用ph7.0的pbs缓冲液重悬菌体至od600nm＝400，用并破碎菌体，得到mthase粗酶。所述的调整发酵参数，其特征在于：将补料速率调整至9-30ml/(l·h)，补料速率恒定或不恒定；将发酵液ph调整至6.0-9.5(非常规)；将发酵液温度设定在18-30℃。所述的收集菌体所用的方法，可以是但不限于：采用离心机，采用陶瓷膜，采用中空纤维膜。所述的破碎菌体所采用的方法，可以是但不限于：采用高压匀质机，采用超声破碎仪。粗酶经过sds-page蛋白胶检测，将采用本方法得到的mthase蛋白量与未进行诱导期参数调整获得的mthase对比，可见本方法得到的可溶性mthase蛋白量明显高于对照组，且不可溶性mthase明显少于对照组，参见说明书附图1。结果证明采用本方法获得的mthase粗酶的可溶性远高于对照组，菌体表达的有效酶量得到了明显提高。将利用本方法获得的mthase粗酶(优化后)与未经过诱导期参数调整的mthase(对照)进行酶浓度测定，其结果如下表所示：对照优化后酶浓度u/ml16.8249.6结果表明，优化后的工艺所产mthase酶浓度为249.6u/ml，是优化前酶浓度的14.9倍，酶浓度显著提高。实施例1重组大肠杆菌高密度培养基制备高密度培养基，其中包括种子培养基、发酵培养基和补料培养基。所述的种子培养基为lb培养基。发酵培养基，包括：磷酸二氢钾1.6g/l；十二水合磷酸氢二钠8.6g/l；硫酸铵2g/l；七水合硫酸镁0.6g/l；葡萄糖20g/l；维生素b14.5mg/l；微量元素i10ml/l；聚醚类消泡剂1ml/l。所述发酵培养基中的微量元素i，包括：800mg/l乙二胺四乙酸二钠，100mg/l六水合氯化钴，1500mg/l四水合氯化亚锰，90mg/l二水合氯化铜，200mg/l硼酸，250mg/l二水合钼酸钠，1000mg/l二水合乙酸锌，5g/l柠檬酸铁。所述发酵培养基中的七水合硫酸镁和葡萄糖需要分别单独灭菌后与其他成分混合。所述发酵培养基中的维生素b1，微量元素i，需分别单独用无菌滤膜过滤灭菌后与其他成分混合。所述补料培养基中，包括：葡萄糖600g/l；七水合硫酸镁1.0g/l；微量元素ii10ml/l。所述补料培养基中的微量元素ii，包括：900mg/l乙二胺四乙酸二钠，400mg/l六水合氯化钴，1200mg/l四水合氯化亚锰，100mg/l二水合氯化铜，200mg/l硼酸，300mg/l二水合钼酸钠，1500mg/l二水合乙酸锌，1g/l柠檬酸铁。所述补料培养基中的葡萄糖和七水合硫酸镁需要分别单独灭菌后与其他成分混合。所述发酵培养基中的微量元素ii，需单独用无菌滤膜过滤灭菌后与其他成分混合。实施例2重组大肠杆菌trh201种子液制备高密度培养中的种子培养阶段，是指将冻存的菌种以1％的接种量，接种到装有50ml种子培养基的500ml三角瓶；于摇床37℃，280rpm的条件下培养8小时得到一级种子；再将一级种子以4％的接种量，接种到装有100ml种子培养基的500ml三角瓶；于摇床37℃，280rpm的条件下培养6小时得到二级种子，二级种子的od600nm为1.5-2.5。发酵培养基，包括：磷酸二氢钾1.6g/l；十二水合磷酸氢二钠8.6g/l；硫酸铵2g/l；七水合硫酸镁0.6g/l；葡萄糖20g/l；维生素b14.5mg/l；微量元素i10ml/l；聚醚类消泡剂1ml/l。所述发酵培养基中的微量元素i，包括：800mg/l乙二胺四乙酸二钠，100mg/l六水合氯化钴，1500mg/l四水合氯化亚锰，90mg/l二水合氯化铜，200mg/l硼酸，250mg/l二水合钼酸钠，1000mg/l二水合乙酸锌，5g/l柠檬酸铁。所述发酵培养基中的七水合硫酸镁和葡萄糖需要分别单独灭菌后与其他成分混合。所述发酵培养基中的维生素b1，微量元素i，需分别单独用无菌滤膜过滤灭菌后与其他成分混合。所述补料培养基中，包括：葡萄糖600g/l；七水合硫酸镁1.0g/l；微量元素ii10ml/l。所述补料培养基中的微量元素ii，包括：900mg/l乙二胺四乙酸二钠，400mg/l六水合氯化钴，1200mg/l四水合氯化亚锰，100mg/l二水合氯化铜，200mg/l硼酸，300mg/l二水合钼酸钠，1500mg/l二水合乙酸锌，1g/l柠檬酸铁。所述补料培养基中的葡萄糖和七水合硫酸镁需要分别单独灭菌后与其他成分混合。所述发酵培养基中的微量元素ii，需单独用无菌滤膜过滤灭菌后与其他成分混合。实施例3trh201高密度培养的菌体增长阶段和诱导阶段的调控方法将二级种子以10％的接种量接种到发酵培养基装液量为40％的发酵罐中，发酵罐通气量为1-3vvm，转速为300-1200rpm，溶氧控制在20-30％，溶氧偶联转速，ph为6.8-7.2，以浓度为5m氨水控制ph，培养温度为37℃；当发酵时间为8h时，发酵液溶氧瞬间上升，即发酵液中初始葡萄糖耗尽，立即启动补料培养基的补料，补料速率为10ml/(l·h)。当菌体的od600nm达到40，将温度于30min内缓慢调整至28℃，并将ph于30min内缓慢调整至8.2(非常规)。待上述两项参数稳定后，加入终浓度为0.02％的l-阿拉伯糖启动诱导。同时，将补料速率调整至8ml/(l·h)。发酵时间达到24h-28h时，停止发酵，并收集菌体，用ph7.0的0.05mpbs缓冲液重悬至od600nm＝400，用高压匀质机破碎菌体，得到mthase破碎液。将本实施例得到的mthase破碎液与未经过诱导期参数调整得到的mthase进行蛋白电泳测定以及酶浓度测定。蛋白电泳结果见实施例附图1，结果表明，本实施例所得到的mthase可溶性远远高于对照组。酶浓度测定数据如下表：对照本实施例酶浓度u/ml20.9237.7由酶浓度测定数据可见，本实施例所制备的酶浓度远远高于对照组，说明本方法可以显著提高mthase的表达活性。序列表<110>中国科学院微生物研究所<120>一种提高麦芽寡糖基海藻糖水解酶在大肠杆菌中可溶性的方法<160>2<210>1<211>1796<212>dna<213>麦芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyl-trehalosetrehalohydrolase）<400>1gtgttaattatcgaaaccctgccgctgctgcgtcagcaaattcgccgcctgcgtatggaa60atgacgcacactacccgcgggaagccgcgaaacccgtcctgggccccgcacgctacgacg60tctgggcgcccaacgctgaatccgtgacgctgctggccggcggggagcgctacgccatgc120agcgccgggccgagaccgggccggaggacgccggctggtggaccgccgccggcgcgccta180cggatggcaacgtggactacgggtaccttctggacggcgacgaaacaccgcttccggatc240cacggacccgccgccagcccgacggcgtccacgccctgtcccgcacgttcgacccgtccg300cgtacagctggcaggacgacgcctggcagggcagggaactgcagggcgccgtcatctacg360agctccacctcggaacattcacgcccgaagggacgctggaggcggccgccggaaagctgg420actacctcgccggcttgggcgtcgacttcatcgagctgctgccggtgaacgctttcaacg480gcacgcacaactggggttacgacggtgtccagtggttcgctgtgcacgaggcatacggcg540ggccggaagcgtaccagcggttcgtcgacgccgcccacgccgcaggccttggcgtgatcc600aggacgtggtctacaaccacctcggccccagcgggaactacctgccgcggttcgggccgt660acctcaagcagggcgagggtaacacgtggggcgactcggtgaacctggacgggcccggct720ccgaccatgtgcgccggtacatcctggacaacctggccatgtggctgcgtgactaccggg780tggacggcctgcggctggacgccgtccacgccctgaaggatgagcgggcggtgcacatcc840tggaggacttcggggcgctggccgatcagatctccgccgaggtgggacggccgctgacgc900tcatcgccgagtccgacctcaacaacccgcggctgctgtacccgcgggacgtcaacgggt960acgggctggaagggcagtggagcgacgacttccaccacgccgtccacgtcaacgtcaccg1020gcgaaaccaccggctactacagtgacttcgactcgctggccgccctcgccaaggtgctcc1080gggacggcttcttccacgacggcagctactccagcttccgggaacgccaccacggacggc1140cgattaatttcagcgccgtacacccagccgccctggtggtctgttcgcagaaccacgacc1200agatcggcaaccgtgccacgggggaccggctctcccagaccctgccgtacggaagcctgg1260ccctcgctgcggtgctgaccctgacgggacccttcacgcccatgctgctcatgggcgagg1320agtacggcgccagcacgccgtggcagtttttcacctcgcacccggagccggagctcggca1380aggccaccgcggagggccggatcaaggagttcgagcgcatggggtgggatcccgccgtcg1440tgcccgatccccaggatcctgagacgttccgccggtccaagctggactgggcggaagccg1500ccgaaggcgaccatgcccggctgctggagctgtaccgttcgctcaccgccctgcgccgct1560ccacgccggacctcaccaagctgggcttcgaggacacgcaggtggcgttcgacgaggacg1620cccgctggctgcggttccgccggggtggcgtgcaggtgctgctcaacttctcggaacagc1680ccgtgagcctggacggggcgggcacggccctgctgctggccaccgacgacgccgtccggc1740tagaaggtgagcgtgcggaactcggtccgctgagcgccgccgtcgtcagcgactga1796<210>2<211>2333<212>dna<213>麦芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyl-trehalosetrehalohydrolase）<400>2atgagaacgccagtctccacgtacaggctgcagatcaggaagggattcacactcttcgac60gcggccaaaaccgttccgtacctgcactcgctcggcgtcgactgggtctacctttctccg120gtcctgactgccgagcagggctccgaccacgggtacgacgtcaccgatccctccgcc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