一种从植物中制备蛇床子素的方法及在制备化妆品中的应用与流程

本发明属于医药与化妆品领域，特别涉及一种从植物中制备蛇床子素的方法及在制备化妆品中的应用。
背景技术：
：蛇床子素又名甲氧基欧芹酚，或欧芹酚甲醚，或喔斯脑(osthole，ost)，主要存在于伞形科和芸香科植物中，是伞形科植物蛇床cnidiummonnieri(l.)cuss.或cnidiumformosanumyabe的干燥成熟果实中的主要活性成分，其化学名称为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素(7-methoxy-8-[3-methylpent-2-eny1]coumarin)，是蛇床子中含量最高的一种烃基香豆素类有效化学成分，为无色柱状结晶，分子式:c15h16o3，相对分子质量为244.29，熔点为82～84℃。蛇床子素的药理实验研究表明：蛇床子素具有抗高血压、抗心律失常、抗衰老、抗肿瘤、抗骨质疏松症、抗炎及抗变态、增强免疫功能等作用。在日化外用方面，蛇床子素有抗变态反应作用，有较强的抗组胺作用，能明显拮抗组胺、慢性反应物质，有较强的抗过敏作用；对各种变态反应、皮肤瘙痒、牛皮癣、带状疮疹、湿疹具有较好的治疗和保健效果；此外，蛇床子素有较强的抗病原微生物作用，对絮状表皮癣菌、石膏样小芽胞菌、羊毛状小芽胞菌及广谱菌均有抑制作用，对阴道滴虫有较强的杀灭作用，能抑制各种炎症因子的形成，具有很好地抑菌抗炎、杀虫止痒，去粉刺作用。为了适应蛇床子素日益增长的需要，蛇床子素的制备研究有了较快的发展，但均有明显的不足。如发明专利cn201110151743.5公开了一种从蛇床子中制备蛇床子素和异茴芹内酯的工艺方法；方法是蛇床子粉末先经超临界co2萃取，得到蛇床子提取物，然后经聚酰胺树脂分离纯化，得粗品，最后经高速逆流色谱进一步提纯，得蛇床子素和异茴芹内酯纯品；该工艺设备费用大、生产成本高，不适宜进行大规模的工业化生产。又如发明专利cn201010182729.7公开了“一种提取蛇床子素的工艺”方法，该工艺方法中采用了微滤、超滤、纳滤石油醚结晶、无水乙醇多次重结晶的方法，该工艺方法不仅相对复杂、成本高，而且石油醚用于大工业生产易产生安全隐患。再又如发明专利cn201010531931.6公开了“一种蛇床子素的制备方法”，该工艺方法中使用了naoh、koh等强碱处理，强碱易改变其蛇床子素的结构产生副反应。还又如发明专利cn201010527673.4公开了“一种从中药蛇床子中提取蛇床子素的方法”，该工艺方法方法虽简单，也适合大规模工业化生产；但工艺方法中使用了浓度大于90％的乙醇溶液进行结晶与重结晶，由于90％的乙醇溶液对蛇床子素与杂质的溶解性都很强，所以，不仅需要重结晶的次数多，而且对产品的得率的影响也较大。本发明提取分离蛇床子素的方法可克服上述不足，采用该方法生产，收率高，操作简单，能耗低，易实现产业化放大，目前还未见有报道。技术实现要素：本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种从植物中制备蛇床子素的方法。本发明的另一目的在于提供通过上述方法制备得到的蛇床子素。本发明的再一目的在于提供上述方法和蛇床子素在制备化妆品中的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种从植物中制备蛇床子素的方法，包括如下步骤：(1)蛇床子素的提取：以伞形科植物的果实为原料，进行净选、干燥、粉碎，得到粗粉；用体积百分比65％～95％的乙醇溶液加热提取或加热温浸超声提取；提取完后，固液分离，得到含蛇床子素的提取液；(2)蛇床子素粗体的分离：取含蛇床子素的提取液，回收乙醇至完全，得到浓缩液；在浓缩液中加入温度为40～80℃的热水进行溶解，接着冷却，再于1～25℃静置24小时以上，固液分离，弃去液体，收集固体，得到含蛇床子素的粗提物；(3)蛇床子素单体成分的精制纯化：通过步骤①或步骤①和②进行精制纯化；①第一次结晶：在蛇床子素粗提物中加入浓度为体积百分比50～60％的乙醇水溶液，加热溶解，冷却至室温，第一次静置，固液分离，取液体，弃去固体；固液分离所得液体于0～10℃环境中第二次静置静置至晶体充分析出，再固液分离，弃去液体，收集结晶；②重结晶；将得到的结晶再按照步骤①重结晶，得到蛇床子素的精制纯化结晶。步骤(1)中所述的伞形科植物优选为蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.或cnidiumformosanumyabe。步骤(1)中所述的粗粉优选为15～20目的粗粉。步骤(1)中所述的乙醇溶液优选浓度为体积百分比85～90％的乙醇溶液。步骤(1)中所述的加热提取的次数优选为2～3次；具体步骤优选如下：提取次数为2次时：第一次加入相当于粗粉质量(kg)10倍体积量(l)的乙醇溶液，充分搅拌混匀，于70～100℃回流提取1～3小时；第二次加入相当于粗粉质量8倍体积量的乙醇溶液，于70～100℃回流提取0.5～2小时；提取次数为3次时：前两次同提取次数为2次时的步骤，第三次加入相当于粗粉质量8倍体积量的乙醇溶液，于70～100℃回流提取0.5～2小时；提取完后，固液分离，合并2～3次分离得到的液体，得到含蛇床子素的提取液；具体步骤更优选如下：提取次数为2次时：第一次加入相当于粗粉质量(kg)10倍体积量(l)的乙醇溶液，充分搅拌混匀，于80℃回流提取2小时；第二次加入相当于粗粉质量8倍体积量的乙醇溶液，于80℃回流提取1.5小时；提取次数为3次时：前两次同提取次数为2次时的步骤，第三次加入相当于粗粉质量8倍体积量的乙醇溶液，于80℃回流提取1.5小时；提取完后，固液分离，合并2～3次分离得到的液体，得到含蛇床子素的提取液。步骤(1)中所述的加热温浸超声提取中的超声条件优选为200～300hz；更优选为250hz。步骤(1)中所述的加热温浸超声提取的次数优选为2～3次；具体步骤优选如下：提取次数为2次时：第一次加入相当于粗粉质量(kg)10倍体积量(l)的乙醇溶液，充分搅拌混匀，于60～80℃温浸超声提取0.5～2小时；第二次加入相当于粗粉质量8倍体积量的乙醇溶液，于60～80℃温浸超声提取0.5～1.5小时；提取次数为3次时：前两次同提取次数为2次时的步骤，第三次加入相当于粗粉质量8倍体积量的乙醇溶液，于60～80℃温浸超声提取0.5～1.5小时；提取完后，固液分离，合并2～3次分离得到的液体，得到含蛇床子素的提取液；具体步骤更优选如下：提取次数为2次时：第一次加入相当于粗粉质量(kg)10倍体积量(l)的乙醇溶液，充分搅拌混匀，于60℃温浸超声提取1.5小时；第二次加入相当于粗粉质量8倍体积量的乙醇溶液，于60℃温浸超声提取1小时；提取次数为3次时：前两次同提取次数为2次时的步骤，第三次加入相当于粗粉质量8倍体积量的乙醇溶液，于60℃温浸超声提取1小时；提取完后，固液分离，合并2～3次分离得到的液体，得到含蛇床子素的提取液。步骤(2)中所述的热水优选温度为50～70℃的热水；更优选为60℃的热水。步骤(2)中所述的热水的添加量优选为按1kg原料(伞形科植物的果实)得到的提取浓缩液加入热水后的体积为1～2l计算；更优选为加入热水后的体积为1.5～1.8l计算。步骤(2)中所述的冷却优选为自然冷却。步骤(2)中所述的冷却的程度优选为冷却至30℃以下；更优选为冷却至25℃以下。步骤(2)中所述的静置的条件优选为于2～8℃静置24～30h；更优选为3～6℃静置26～28h。步骤(3)①中所述的乙醇水溶液的浓度优选为体积百分比53～57％；更优选为体积百分比55～56％。步骤(3)①中所述的乙醇水溶液的添加量优选为按1kg原料(伞形科植物的果实)得到的粗提物配比1～3l乙醇水溶液计算；更优选为配比2l乙醇水溶液计算。步骤(3)①中所述的室温指的是5～35℃；优选为10～30℃；更优选为20～28℃；最优选为25℃。步骤(3)①中所述的第一次静置的时间优选为7～8小时。步骤(3)①中所述的第二次静置的时间优选为48小时以上；更优选为72小时。步骤(3)①中所述的第二次静置的温度优选为0～8℃；更优选为1～2℃。步骤(3)②中所述的重结晶的次数优选为1次，得到的蛇床子素的精制纯化结晶的纯度含量≥98％(w/w)。本发明中所述的固液分离可通过离心方式进行分离或是通过过滤方式进行分离。所述的方法在制备化妆品中的应用。一种精制的蛇床子素，通过上述方法制备得到，纯度含量≥98％(w/w)。所述的精制的蛇床子素在制备化妆品中的应用。所述的化妆品为具有抗过敏、抑菌抗炎、去粉刺作用的化妆品。抗过敏是指蛇床子素制备的化妆品可抑制组胺的释放，能较强地抑制被动皮肤过敏反应，能明显抑制迟发性超敏反应，具有抗变态反应、止痒作用；抑菌抗炎、去粉刺是指蛇床子素制备的化妆品有较强的抗菌消炎作用，能抑制金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌耐药菌、大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌等细菌；能显著抑制各种急性和慢性炎症，具有很好地抑菌抗炎、去粉刺作用。所述的精制的蛇床子素在制备化妆品中的应用，包括如下步骤：将所述的蛇床子素先溶解或加热溶解于制备化妆品允许的药物赋形剂或载体中，再与其他成分混合。所述的精制的蛇床子素在所述的化妆品中的含量是治疗有效量。所述的制备化妆品允许的药物赋形剂或载体可以选自：溶剂、增溶剂、防腐剂、抗氧剂、ph调节剂、促渗剂、脂质体、保湿剂、增稠剂、螯合剂、肤感调节剂、表面活性剂、乳化剂、推进/抛射剂、香精、色素，以及其他功效添加剂。所述的化妆品的形式是乳化体系、表面活性剂体系、外用搽剂、软膏剂。为了说明从植物中制备蛇床子素及其在化妆品中的应用的有益效果，本发明以金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌耐药菌、大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌为研究对象，通过药敏纸片法、二倍稀释法实验证明本发明的制备的蛇床子素具有显著的抗菌消炎作用；以雄性小鼠为研究对象，通过小鼠耳壳致炎法实验，证明本发明的蛇床子素具有显著的消炎止痛作用；以小鼠及大鼠为研究对象，通过抑制小鼠被动皮肤过敏(pca)反应，证明本发明的蛇床子素具有显著的抗过敏作用；本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本发明从植物蛇床子中制备蛇床子素的方法，克服了蛇床子素制备的现已有co2超临界流体萃取法、酸碱处理法、石油醚处理结晶法、高浓度醇处理结晶法等方法的缺点，根据蛇床子素的性质与特点，发明了50～60％中等浓度醇处理去杂结晶的新方法，最大限度地保留了蛇床子素的含量与活性。(2)本发明从植物蛇床子中制备蛇床子素的方法中，蛇床子素单体成分的精制纯化，首次发明了通过加入中等浓度乙醇水溶液热溶、室温除杂、冷藏析晶的方法，不仅可将杂质有效祛除，而且蛇床子素的转移率高(约88％)。(3)由于蛇床子素水溶性差，不利于直接应用于化妆品，常采用包合的方式对其进行处理，否则其制备的化妆品易产生撮泥感及活性成分难被皮肤吸收。本发明巧妙利用了蛇床子素的特性及化妆品制备的多相组成，将蛇床子素先溶解或加热溶解于制备化妆品允许的脂溶性的赋形剂或载体中，其蛇床子素无需包合，即能达到克服上述不足，大大地节约了成本。(4)采用本发明所提供的方法，工艺流程简单，操作方便，产品质量控制方便，有可操作性，是适合于工业生产的安全可靠的制备方法。附图说明图1是实施例1从蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果实中制备的蛇床子素照片图。图2是实施例1从蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果实中制备得到的蛇床子素hplc色谱图；其中，图a为蛇床子素对照品，图b为蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果实中制备的蛇床子素样品。图3是实施例2从蛇床cnidiumformosanumyabe中制备得到的蛇床子素照片图。图4是实施例2从蛇床cnidiumformosanumyabe中制备得到的蛇床子素hplc色谱图；其中，图a为蛇床子素对照品，图b为蛇床cnidiumformosanumyabe中制备的蛇床子素样品。图5是实施例1从蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果实中制备的蛇床子素照片图。图6是实施例1从蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果实中制备得到的蛇床子素hplc色谱图；其中，图a为蛇床子素对照品，图b为蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果实中制备的蛇床子素样品。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1从植物蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果实中提取制备蛇床子素一(1)蛇床子素的提取以植物蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果实为原料，进行净选，经过干燥，粉碎成约20目的粗粉。取蛇床子粗粉1000g，加入10倍量(10l)的浓度为体积百分比为85％的乙醇水溶液，充分搅拌混匀，加热至80℃回流提取2小时，过滤，滤液待用；滤渣继续加入8倍量(8l)的85％(v/v)乙醇水溶液，充分搅拌混匀，加热至80℃回流提取1.5小时，过滤，滤液待用；滤渣继续加入8倍量(8l)的85％(v/v)乙醇水溶液，充分搅拌混匀，加热至80℃回流提取1.5小时，过滤，滤液与前二次的滤液合并得蛇床子素的提取液，待用；滤渣弃去。(2)蛇床子素粗体的分离取上述蛇床子素的提取液，减压回收乙醇至尽，得浓缩液(约800ml)，加60℃的热水调整至1500ml的溶液，充分搅拌混匀，放冷至室温，置约5℃冷藏室中，静置28小时，4000r/min离心分离20min，弃去上清液，收集沉淀，得蛇床子素的粗提物沉淀约185g。(3)蛇床子素单体成分的精制纯化取上述蛇床子素的粗提物沉淀，加入浓度为55％(v/v)的乙醇水溶液2000ml，60℃加热，搅拌溶解后，过滤，弃去沉淀，滤液放至室温(约25℃)，静置8小时，过滤，弃去沉淀；滤液置2℃冷藏室中，静置72小时析晶，再过滤分离，弃去滤液，收集结晶得蛇床子素粗晶22.8g；所得结晶按上述方法再处理重结晶一次，得蛇床子素的精制纯化结晶20.3g。按药典蛇床子中蛇床子素的含量测定方法测定，测得蛇床子素的纯度含量为98.9％，其蛇床子素照片图及测定色谱图分别见图1与图2。原料蛇床子(果)中蛇床子素含量为2.31％，蛇床子素转移率为87.9％。对比例1以植物蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果实为原料，按发明专利cn201010527673.4“一种从中药蛇床子中提取蛇床子素的方法”的实施例3的方法，取蛇床子粗粉1000g，提取制备蛇床子素，得蛇床子素的精制纯化结晶10.2g，测得蛇床子素的纯度含量为99.1％，蛇床子素转移率为44.2％。实施例2从蛇床cnidiumformosanumyabe的果实中提取制备蛇床子素(1)蛇床子素的提取以植物蛇床cnidiumformosanumyabe的果实为原料，进行净选，经过干燥，粉碎成约18目的粗粉。取蛇床子粗粉1000g，加入10倍量(10l)的85％(v/v)乙醇水溶液，充分搅拌混匀，加热至80℃回流提取2小时，过滤，滤液待用；滤渣继续加入8倍量(8l)的85％(v/v)乙醇水溶液，充分搅拌混匀，加热至80℃回流提取1.5小时，过滤，滤液待用；滤渣继续加入8倍量(8l)的85％(v/v)乙醇水溶液，充分搅拌混匀，加热至80℃回流提取1.5小时，过滤，滤液与前二次的滤液合并得蛇床子素的提取液，待用；滤渣弃去。(2)蛇床子素粗体的分离取上述蛇床子素的提取液，减压回收乙醇至尽，得浓缩液(约750ml)，加60℃热水调整至1500ml的溶液，充分搅拌混匀，放冷至室温，置约5℃冷藏室中，静置26小时，4000r/min离心分离20min，弃去上清液，收集沉淀，得蛇床子素的粗提物沉淀约181g。(3)蛇床子素单体成分的精制纯化取上述蛇床子素的粗提物沉淀，加入浓度为55％(v/v)的乙醇水溶液2000ml，60℃加热，搅拌溶解后，过滤，弃去沉淀，滤液放至室温(约25℃)，静置7小时，过滤，弃去沉淀；滤液置1℃冷藏室中，静置72小时析晶，再过滤分离，弃去滤液，收集结晶得蛇床子素粗晶21.3g；所得结晶按上述方法再处理重结晶一次，得蛇床子素的精制纯化结晶19.7g。按药典蛇床子中蛇床子素的含量测定方法测定，测得蛇床子素的纯度含量为99.1％，其蛇床子素照片图及测定色谱图分别见图3与图4。原料蛇床子(果)中蛇床子素含量为2.27％，蛇床子素转移率为86.8％。其蛇床子素照片图及测定色谱图分别见图3与图4。对比例2以植物蛇床cnidiumformosanumyabe的果实为原料，按发明专利cn201010527673.4“一种从中药蛇床子中提取蛇床子素的方法”的实施例3的方法，取蛇床子粗粉1000g，提取制备蛇床子素，得蛇床子素的精制纯化结晶10.8g，测得蛇床子素的纯度含量为98.8％，蛇床子素转移率为47.6％。实施例3从植物蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果实中提取制备蛇床子素二(1)蛇床子素的提取以植物蛇床cnidiummonnieric(l.)cusson.的果实为原料，进行净选，经过干燥，粉碎成约15目的粗粉。取蛇床子粗粉1000g，加入10倍量(10l)的90％(v/v)乙醇水溶液，充分搅拌混匀，加热至60℃超声(250hz)提取1.5小时，过滤，滤液待用；滤渣继续加入8倍量(8l)的90％(v/v)乙醇水溶液，充分搅拌混匀，加热至60℃超声(250hz)提取1.0小时，过滤，滤液待用；滤渣继续加入8倍量(8l)的90％(v/v)乙醇水溶液，充分搅拌混匀，加热至60℃超声(250hz)提取1.0小时，过滤，滤液与前二次的滤液合并得蛇床子素的提取液，待用；滤渣弃去。(2)蛇床子素粗体的分离取上述蛇床子素的提取液，减压回收乙醇至尽，得浓缩液(约700ml)，加60℃热水调整至1800ml的溶液，充分搅拌混匀，放冷至室温，置约5℃冷藏室中，静置28小时，4000r/min离心20min分离，弃去上清液，收集沉淀，得蛇床子素的粗提物沉淀约173g。(3)蛇床子素单体成分的精制纯化取上述蛇床子素的粗提物沉淀，加入浓度为56％(v/v)的乙醇水溶液2000ml，60℃加热，搅拌溶解后，过滤，弃去沉淀，滤液放至室温(约25℃)，静置8小时，过滤，弃去沉淀；滤液置1℃冷藏室中，静置72小时析晶，再过滤分离，弃去滤液，收集结晶得蛇床子素粗晶22.4g；所得结晶按上述方法再处理重结晶一次，得蛇床子素的精制纯化结晶20.1g。按药典蛇床子中蛇床子素的含量测定方法测定，测得蛇床子素的纯度含量为99.4％，其蛇床子素照片图及测定色谱图分别见图5与图6。原料蛇床子(果)中蛇床子素含量为2.31％，蛇床子素转移率为87.0％。实施例4：本发明方法提取分离的蛇床子素体外抑菌作用研究蛇床子系伞形科蛇床属植物蛇床(cnidiummonnieric(l.)cusson.)的果实，中药蛇床子常常指的就是这一种。另一种为cnidiumformosanumyabe。两种蛇床子在我国各地均有生长，但以前一种居多。江苏、安徽两省是蛇床子的主产地。蛇床子自古以来多作为外用药使用.我国古代医药著作中有关它的用途记载很少，主要外用于治疗皮肤病.如《神农本草经》中有“主治湿癣，恶疮”；《集简方》有“妇人阴痒，以蛇床子许末和猪油涂之”的记载；《本草纲目》记载有去阴汗、湿癣等作用，主治阴道滴虫、皮肤湿疹等作用。蛇床子素有较好的抗菌消炎作用，能抑制金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌耐药菌、大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌等细菌，抗菌谱广，实验方法和结果如下:1材料与方法1.1仪器dy6000ⅱ电热恒温培养箱(天津泰斯特仪器有限公司)；ht-20-5mt双人超净台(苏州安泰空气技术有限公司)；微量移液器(上海热电仪器有限公司)；ldzx-50k高压灭菌器(上海三申医疗器械有限公司)。1.2试药蛇床子素按本发明方法由实施例1从植物蛇床cnidiummonnieric(l.)cus-son.的果实中提取制备而得，经蛇床子素对照品的hplc对照，并按药典蛇床子中蛇床子素的含量测定方法测定，测得蛇床子素的纯度含量为98.9％，其蛇床子素照片图及测定色谱图分别见图1与图2。1.3菌种金黄色葡萄球菌(cmcc26003)、金黄色葡萄球菌耐药菌(s4050)、大肠杆菌(jm110)、痢疾志贺氏菌(cmcc51252)、鼠伤寒沙门氏菌(cmcc50115)、绿脓杆菌(cmcc10104)均从广东省微生物菌种保藏中心购买。2方法与结果2.1蛇床子素脂肪乳溶液及空白脂肪乳溶液的制备2.1.1蛇床子素脂肪乳溶液的制备将实施例1制备的蛇床子素1.5g加入15ml的大豆油，60℃水浴中加热至蛇床子素完全容解，在通氮气的条件下，将大豆磷脂1.5g加入到大豆油中，高速捣碎至大豆磷脂完全溶解，保持温度60℃得油相；取纯化水50ml置容器中，搅拌状态下缓缓加入甘油15g，加热升温至60℃，搅拌均匀制得水相；在60℃恒温和高速分散乳化12000rpm的条件下，将油相缓缓加入水相中，至混合均匀，加纯化水调整至100ml，投入匀质机中，调节均质压力60mpa、均质温度60℃、均质10次，350目滤器过滤，得15mg·ml-1蛇床子素脂肪乳溶液，备用。2.1.2空白脂肪乳溶液的制备取15ml的大豆油，在通氮气的条件下，将大豆磷脂1.5g加入到大豆油中，高速12000rpm捣碎至大豆磷脂完全溶解，保持温度60℃得油相；取纯化水50ml置容器中，搅拌状态下缓缓加入甘油15g，加热升温至60℃，搅拌均匀制得水相；在60℃恒温和高速分散乳化12000rpm的条件下，将油相缓缓加入水相中，至混合均匀，加纯化水调整至100ml，投入匀质机中，调节均质压力60mpa、均质温度60℃、均质10次，350目滤器过滤，得空白脂肪乳溶液，备用。2.2菌液的制备将不同菌种的单个菌落分别接种于lb培养液中，37℃恒温摇床增菌培养18～24h。再取出少量菌液，用灭菌0.9％氯化钠溶液稀释至107～108cfu·ml-12.3抑菌实验2.3.1药敏纸片法制作含有不同浓度蛇床子素且直径为5mm的药敏纸片。将不同的菌种100μl涂布于lb培养基上，当培养基表面干燥后，将纸片贴于培养基表面，37℃培养24h后，观察并测定抑菌环直径，重复3次，阴性对照组用空白脂肪乳溶液纸片。2.3.2二倍稀释法在5ml带塞灭菌试管中分别加入各菌种所需培养基2.0ml，每种菌种各8管。按1～8编号，分别在第1管中加入蛇床子素脂肪乳溶液2ml，混匀后取出2.0ml放入第2管，采用二倍稀释法，依次将药液吸收成1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64系列溶液，即含药量分别为7.50，3.75，1.88，0.94，0.47，0.24mg·ml－1。各管均加入浓度约为5×105cfu·ml－1的各病原指示菌菌液0.2ml，同时分别设阴性对照管(含药液不含菌液)，阳性对照管(含菌液不含药物)。37℃培养箱中培养24h后观察菌种生长情况。病原菌浓度计算方法:观察平板上的菌落形成的单位(cfu)。cfu≤5的浓度为抑菌浓度，标记“-”号，cfu≥5的浓度为无抑菌浓度，标记“+”，产生抑菌作用的最小浓度表示该管药量即是受试药的最低抑菌浓度(mic)。2.4结果与讨论2.4.1结果纸片法测定蛇床子素对6种菌的抑菌活性见表1；二倍稀释法测定蛇床子素对6种菌的mic值见表2。表1蛇床子素对6种菌的平均抑菌环直径mm表2蛇床子素对6种菌的mic值n＝3，mg·ml-1由表1，2可知，蛇床子素对6种菌均有明显的抑菌作用，并随着浓度的增加抑菌作用增强。其中对金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌耐药菌、绿脓杆菌和大肠杆菌的抑菌作用最强，mic均为0.94mg·ml-1；对鼠伤寒沙门氏菌抑菌作用其次，mic为1.88mg·ml-1；对痢疾志贺氏菌抑菌作用最弱，mic为3.75mg·ml-1。2.4.2讨论本发明用药敏纸片法和试管二倍稀释法考察了蛇床子素对黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌耐药菌、大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌抑菌作用。研结果显示蛇床子素对金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌耐药菌、绿脓杆菌和大肠杆菌抑菌作用最强，其次是鼠伤寒沙门氏菌，对痢疾志贺氏菌作用较弱。结果提示：蛇床子素及其化妆品制剂在临床有较强的抗菌消炎作用，能抑制黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌耐药菌、大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌等细菌；有显著的抗菌消炎，去粉刺作用。实施例5：本发明方法提取分离的蛇床子素消炎止痛作用实验蛇床子素脂肪乳溶液有较好的抗菌作用，能抑制黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌耐药菌、大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌等细菌；此外，蛇床子素具有消炎止痛作用，实验方法和结果如下:1试药1.1蛇床子素脂肪乳溶液及空白脂肪乳溶液的制备:如上实施例4中2.1所制，供腹腔注射用。1.2消炎痛:上海医药公司产品，临用前，制成5mg/ml，供腹腔注射用。2实验动物与环境昆明小鼠，雄性，体重20±2g，广东省医学实验动物中心提供，动物质量合格证明编号：no.44411600000901。实验动物使用许可证号：syxk(粤)2013-0002。实验环境条件:温度23℃±2℃，相对湿度60％±10％，室内以自然光照明为主，通风良好，且环境保持安静，spf级实验动物环境设施。将120只小鼠分为2个大组，每个大组60只；每个大组又分为空白脂肪乳溶液对照组、消炎痛作阳性对照组、蛇床子素脂肪乳溶液小、中、大三个剂量给药组，各组12只。3实验方法参照中华人民共和国卫生部药政局主编《新药临床前研究指导原则汇编》的方法二3.1小鼠扭体实验小鼠分组后，以空白脂肪乳溶液作阴性对照，消炎痛作阳性对照，腹腔注射给药，40～60分钟后，腹腔注射0.6％醋酸0.2m1，在其后15分钟内观察小鼠扭体次数。比较组间显著性差异(说明:小鼠扭体反应指小鼠因受到疼痛刺徽而产生的腹部内凹，躯干与后腿伸张，臀部高起的现象)。3.2小鼠耳壳致炎法小鼠分组后，用空白脂肪乳溶液作阴性对照，消炎痛作阳性对照，药物注射剂腹腔注射，给药30分钟后，二甲苯0.03-0.05ml清抹在小鼠右耳耳壳内外。3小时后处死小鼠并取下右耳壳，同时取下左耳壳对照，8mm的打孔器分别在左、右耳打下圆耳片后，于分析天平上称量，计算出肿胀度。(肿胀度＝右耳耳壳重量-左耳耳壳重量)。比较组间显著性差异。4实验结果表3蛇床子素对醋酸诱导小民扭体的抑制作用(n＝12)*p<0.05，**p<0.o1与空白脂肪乳溶液组相比。表4蛇床子素对二甲苯诱导的小鼠耳壳肿胀的抑制作用(n＝12)*p<0.05，**p<0.01与空白脂肪乳溶液组相比。实验结果表明，蛇床子素对醋酸诱导的小鼠扭体有显著的抑制作用，且作用强度与剂量相关。且大、中2个剂量组优于消炎痛。结果见表3。实验结果又表明：蛇床子素对小鼠耳壳肿胀有显著的抑制作用，抑制作用随剂量的增加而增加.且大、中2个剂量作用强度强于消炎痛组。结果见表4。5结论本实验结果表明，本发明的蛇床子素具有显著的消炎止痛作用。作用强于消炎痛。可以用于制备天然化妆品或消炎止痛药物。实施例6：本发明方法提取分离的蛇床子素抗变态反应作用实验蛇床子素可用于化妆品的另一重要作用是其抗变态反应，本文以小鼠及大鼠为研究对象，通过抑制小鼠被动皮肤过敏(pca)反应、抑制大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒，证明本发明的蛇床子素具有显著的抗过敏作用，现将结果总结如下：1试药1.1蛇床子素脂肪乳溶液及空白脂肪乳溶液的制备:如上实施例4中2.1所制，供口服及腹腔注射用。1.2天花粉注射液：上海生化制药厂产品，用0.5％伊文思蓝、生理盐水配成1.00mg/ml、1.25mg/ml，供注射用；氢氧化铝凝胶为市场购买。1.3抗血清：按徐叔云等主编《药理实验方法学》(第1版，北京:人民卫生出版社，1982:923)的方法制取。1.4色甘酸钠注射液：上海生化制药厂产品，用生理盐水配成5.8mg/ml，供注射用。2实验动物昆明小鼠(体重20±2g)、wister大鼠(体重200g±20g)，广东省医学实验动物中心提供，动物质量合格证明编号：no.44411600000901。实验动物使用许可证号：syxk(粤)2013-0002。3实验方法3.1小鼠被动皮肤过敏(pca)试验取健康小鼠，将腹部脱毛后于皮内注射抗血清0.03ml(血清稀释10倍)，48h后尾静脉注射天花粉注射液(1.25mg/ml)0.2ml，进行攻击30min后断头处死动物，翻转腹部皮肤，测量蓝斑直径并剪下色斑皮片，分别浸于5ml丙酮生理盐水(7:3)，24h后洗脱，用分光光度计在610nm波长比色，读出光密度。3.2大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒试验取健康大鼠，脚掌注射天花粉-氢氧化铝凝胶混悬液，4个脚掌共注射0.4ml，即每鼠注射天花粉1mg，注射后15d，腹腔注射被试药物，0.5h后乙醚麻醉，股动脉放血处死动物，剪开腹部皮肤，向腹腔内注入ph6.9的hank氏液(不含酚红)10ml，内含肝素0.005％，轻轻按摩腹部2min，然后打开腹腔，以滴管将腹腔液收集于试管中，放冰浴冷却后以1000r/min离心15min，弃上清液，将沉淀物悬于2mlhank氏液中，放冰箱备用。取上述肥大细胞悬液0.5ml，加人等量抗原液(含天花粉1mg/ml)，37℃保温15min，0.125％中性红染色，高倍镜下观察100个肥大细胞，按(1-a/q)×100％公式计算药物对肥大细胞脱颗粒的抑制百分率。式中a和q分别表示给药组和对照组脱颗粒细胞数。4实验结果4.1蛇床子素对小鼠pca反应的抑制作用取小鼠30只，腹部皮内注射抗血清后均分为三组，对照组灌服空白脂肪乳溶液，另两组分别一次灌服蛇床子素100mg/kg和200mg/kg的脂肪乳溶液。三组动物的蓝斑直径及光密度见表5。结果表明蛇床子素对小鼠pca反应有较强抑制作用。表5蛇床子素对小鼠被动皮肤过敏(pca)抑制率的影响(n＝10)蛇床子素mg/kg蓝斑直径(mm)光密度01.21±0.230.167±0.071000.51±0.25*0.074±0.04*2000.43±0.28**0.051±0.02***p<0.05，**p<0.01与空白脂肪乳溶液组相比。4.2蛇床子素对肥大细胞脱颗粒的抑制作用取大鼠40只，均分为四组，对照组分别腹腔注射生理盐水0.7ml/只和色甘酸钠0.7ml/只，给药组分别腹腔注射蛇床子素脂肪乳溶液0.7ml/只和1.4ml/只。对天花粉抗原所引起的大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒，色甘酸钠的抑制率为64.0％，蛇床子素的抑制率分别为57.7％和79.1％，与对照组比较均有显著差异，表明蛇床子素对大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒有较显著的抑制作用。其实验结果见表6。表6蛇床子素对肥大细胞脱颗粒的抑制作用(n＝10)5讨论实验证明：蛇床子素对小鼠48h的pca反应有较强的抑制作用，表明其能明显抑制ige抗体的形成，对变态反应中的肥大细胞脱颗粒有抑制作用。蛇床子素用于制备抗变态反应的化妆品具有重要作用。实施例7：蛇床子素化妆品制备实例⑴面霜的制备组方：制备工艺:取蛇床子素、鲸蜡硬脂基葡糖苷、十六-十八醇、辛酸/癸酸三甘油酯、霍霍巴油、棕榈酸异丙酯、甘油混合加热至60℃，作为a相，保温备用；取甘草酸二钾、加入汉生胶、卡波940、透明质酸钠、去离子水，混合加热至60℃，分散均匀，作为b相，保温备用；将a相在均质下慢慢加入到预先分散均匀并加热至80℃的b相中，加入环二甲基硅油345均质3分钟，加入氢氧化钠调节ph6-7，搅拌冷却到50℃，加入香精，搅拌、冷却到35℃即得。⑵乳液的制备组方：制备工艺:取蛇床子素、环戊硅氧烷995、凡士林、吐温-80、维生素e醋酸酯、甘油混合加热至60℃，作为a相，保温备用；取甘草酸二钾，加入汉生胶、carbopolultrez10、1,3-丁二醇、去离子水，混合加热至60℃，分散均匀，作为b相，保温备用；将a相在均质下慢慢加入到预先分散均匀并加热至80℃的b相中，均质3分钟，加入三乙醇胺调节ph6-7，搅拌冷却到50℃，加入香精、防腐剂，搅拌、冷却到35℃即得。⑶眼霜的制备组方：制备工艺:取甘草酸二钾，加入1,3-丁二醇、绿茶提取物、乙二胺四乙酸二钠、去离子水，分散均匀，加热至50℃，搅拌直至清澈；在搅拌下缓慢加入有机硅弹性体，作为a相，备用；取蛇床子素、dc245、霍霍巴油、维生素e醋酸酯、维生素a棕榈酸酯混合加热至60℃，作为b相，保温备用；将a相在均质下慢慢加入到预先分散均匀并加热至60℃的b相中，均质3分钟，冷却到35℃即得。⑷啫喱的制备组方：制备工艺:取蛇床子素、甘草酸二钾，加入聚丙烯酸、甘油、1,3-丁二醇、岩藻聚糖硫酸酯、透明质酸钠，搅拌分散均匀，作为a相，备用；取去离子水加入a相、分散均匀，加热至60℃，加入三乙醇胺调节ph6-7，搅拌，冷却到50℃加入香精、甲基异噻唑琳酮，搅拌、冷却到35℃即得。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12