本发明涉及杂萜类化合物，具体涉及从真菌中提取的杂萜类化合物及其作为醛糖还原酶抑制剂的用途。
背景技术：
灵芝(ganodermalucidum(leyss.exfr.)karst.)隶属于真菌门(eumycota)、担子菌亚门(basidiomycotina)、层菌纲(hymenomycetes)、非褶菌目(aphyllophorales)、灵芝科(gamodermataceae)、灵芝属(ganoderma)。《中华本草》中记录“其性甘；味平；无毒；归肺、心、脾、肾经。益气血；安心神；健脾胃。主治虚劳、心悸、失眠、头晕、神疲乏力、久咳气喘、冠心病、矽肺、肿瘤。”《中国药典》中将灵芝收录为中药材，其中的灵芝多糖、三萜、核苷、生物碱、氨基酸多肽、微量元素等成分是其药效物质的主要基础，以三萜和多糖为其中主要活性成分。现代药理研究表明，灵芝三萜类化合物具有保肝、抗肿瘤、抗hiv-4及hiv-4蛋白酶活性、抗组织胺释放、抑制血管紧张素、抗氧化等作用。最近研究表明，灵芝中存在一类对羟基苯酚的法尼基取代物类的杂萜类化合物，其在治疗代谢综合症方面具有较好的作用。
代谢综合征主要表现为胰岛素抵抗，中心肥胖，提高血压和血脂，并已经成为世界性的疾病。目前虽然有一些临床治疗代谢综合征的药物比如胰岛素、他汀类以及贝特类药物，但是由于其副作用以及治疗功效不够理想等仍然是这类治疗药物面临很多问题。醛糖还原酶(aldosereductase，ar)存在于人体神经、红细胞、晶状体、视网膜等组织器官中，在多元醇通路中催化血液中的葡萄糖生成山梨醇，是多元醇通路的关键限速酶。当血糖浓度维持在正常生理水平时，它并不激活，对葡萄糖的亲和力较低，此时葡萄糖很少转化为山梨醇。在高血糖状况下(如糖尿病)，己糖激酶被饱和，这时醛糖还原酶激活，促使体内的葡萄糖转化为山梨醇。然而，山梨醇脱氢酶(sorbitoldehydrogenase，sdh)的活力并未相应地成比例增加，山梨醇转化为果糖的效率没有提高。山梨醇本身由于极性强不易通过细胞膜，在细胞内会形成蓄积，使细胞膜的通透性发生改变，并使细胞中na+-k+-atp酶活性下降，造成肌醇丧失，导致细胞代谢与功能的损害。由于眼睛和神经细胞等组织内醛糖还原酶的含量较高，糖尿病病人体内高血糖的环境使这一通路很容易被打开，造成对这些组织的病理损害，如白内障、神经病变、肾脏病变、视网膜病变、动脉粥样硬化等糖尿病并发症(diabetescontrolandcomplications，dcc)。糖尿病并发症严重威胁着糖尿病患者的生存质量，阻断或减弱醛糖还原酶活性的药物可以用来预防或推迟糖尿病并发症的发生。1970年以来，醛糖还原酶抑制剂的研究成为治疗糖尿病药物研究的热点，已有一些种类进入临床试验或上市销售，但是好多药物有已经由于临床试验存在问题而退出。目前可供临床使用的醛糖还原酶抑制剂依然很少在我们的长期研究中，从峨眉山赤芝的子实体乙酸乙酯粗提物中分离到具有醛糖还原酶抑制活性的化合物。这些化合物表现出了和阳性药依帕司他相似的活性，为醛糖还原酶抑制剂药物开发提供先导化合物。
技术实现要素：
本发明以灵芝为研究对象，对其提取物进行了分离纯化，得到杂萜类化合物，对这些化合物进行了结构鉴定和生物活性研究，发现这些化合物具有很好的醛糖还原酶抑制活性，有潜在的药用价值。
为此，本发明的第一方面，提供一种通式(i)所示的化合物或其药用盐
式(i)中，
r1为–h、r2为-oh、r3为-oh、r4为-oh；
或r1和r2成醚键、r3和r4成双键；
或r1为-h、r2为-oh、r3和r4成双键。
优选地，所述通式(i)化合物可为如下式1-3所示的化合物
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
hplc分析仪为agilent1200分析型液相色谱仪。hplc的条件如下：以色谱甲醇将样品配制为10mg/ml的溶液，上样量为每次15ul，色谱柱为kromasil10×250mmc18半制备柱，柱温为25℃，210nm波长进行hplc制备。
实施例1制备灵芝的提取物
将灵芝子实体剪碎，称重2500克。用10l体积百分含量95％乙醇的水溶液回流提取3次，每次1小时。合并提取液，减压浓缩干燥得到170克提取物。
进一步将提取物用蒸馏水600ml溶解，用等体积的正己烷萃取三次，弃去有机相。再用等体积乙酸乙酯萃取水相三次，弃去水相，合并乙酸乙酯萃取液。用旋转蒸发仪蒸干乙酸乙酯获得浸膏49g，记作gs。
实施例2化合物的制备
灵芝粗提物乙酸乙酯层gs通过硅胶柱色谱分离，以正己烷:乙酸乙酯体系(正己烷:乙酸乙酯的体积比为1:0，50:1，30:1，20:1，15:1，10:1，4:1，2:1)，二氯甲烷:甲醇体系(二氯甲烷:甲醇的体积比为1:0,100:1,50:1,30:1,10:1,5:1)依次进行梯度洗脱，每个梯度洗涤4个保留体积，每个保留体积一个馏分。根据薄层层析色谱行为分析，合并相似流分，在正己烷:乙酸乙酯(体积比为1:0)体系得到馏分gs-1；在正己烷:乙酸乙酯(体积比为100:1～30:1)中得到馏分gs-2～5；在正己烷:乙酸乙酯(体积比为20:1)中得到馏分gs-6，gs-7；在正己烷:乙酸乙酯(体积比为10:1)中得到馏分gs-8；在二氯甲烷:甲醇(体积比为1:0)中得到馏分gs-9～10；在二氯甲烷:甲醇(体积比为50:1)中得到馏分gs-11～13；在二氯甲烷:甲醇(体积比为20:1)中得到馏分gs-14在二氯甲烷:甲醇(体积比为30:1)中得到馏分gs-15；在二氯甲烷:甲醇(体积比为20:1,10:1,1:0)中得到馏分gs-16。共得到16个馏分，将各馏分冷冻干燥。
通过薄层色谱分析还发现gs-9中活性物质含量较高，因此对gs-9利用ods反相硅胶柱分离。用体积百分含量为20％，40％，50％，70％，90％甲醇的水溶液依次进行洗脱，每个洗脱体系洗1500ml。根据薄层层析色谱行为，照射254nm紫外灯判断不同馏分，在体积百分含量为20％的甲醇水溶液中得到馏分gs-9-1～3；在体积百分含量为40％的甲醇水溶液系统中得到馏分gs-9-4～6；在体积百分含量为50％的甲醇水溶液系统中得到馏分gs-9-7～8；在体积百分含量为70％的甲醇水溶液系统中得到馏分gs-9-9～10；在体积百分含量为90％的甲醇水溶液系统中得到馏分gs-9-11。得到11个子馏分并进行冷冻干燥。
通过薄层色谱分析发现gs-9-7中活性物质含量较高，对gs-9-7进一步进行hplc制备。以体积百分含量52％乙腈的酸水(此处的酸水为体积百分含量为0.01％三氟乙酸的水溶液)溶液为洗脱剂进行hplc制备，流速为2ml/min，收集23min的色谱峰，得到化合物1；收集30min的色谱峰，得到化合物2；收集33min的色谱峰得到化合物3。
实施例3化合物1-3的确认
对制备得到的3个化合物分别进行核磁共振、红外、质谱检测，确定各化合物的结构。
其中所使用的核磁共振仪为varianmercury-500和-600兆赫，红外色谱仪为nicoletis5ft-ir，质谱仪为brukerapexiii7.0t和apexiift-icr。
经确认，化合物1为新的天然产物，为对羟基苯酚的法尼基取代物类杂萜化合物含骨架ⅰ。
化合物1(ganomycinj)
化合物1的结构式如下：
(r,2z,5e)-2-(2-(2,5-二羟基苯基)亚乙基)-9,10-二羟基-6,10-二甲基十一-5-烯酸
(r,2z,5e)-2-(2-(2,5-dihydroxyphenyl)ethylidene)-9,10-dihydroxy-6,10-dimethylundec-5-enoicacid
化合物1的nmr的碳谱和氢谱确认数据如表1所示
表11h(500mhz)and13c(125mhz)nmr(dmso-d6)
化合物2(ganomycinb)
化合物2的结构式如下：
(2z,5e)-2-(2-(2,5-二羟基苯基)亚乙基)-6,10-二甲基十一-5,9-二烯酸
(2z,5e)-2-(2-(2,5-dihydroxyphenyl)ethylidene)-6,10-dimethylundeca-5,9-dienoicacid
化合物3(ganomycini)
化合物3的结构式如下：
(r,e)-5-(2,5-二羟基苯基)-3-(4,8-二甲基九-3,7-二烯-1-基)呋喃-2(5h)-烷
(r,e)-5-(2,5-dihydroxyphenyl)-3-(4,8-dimethylnona-3,7-dien-1-yl)furan-2(5h)-one
化合物1-3的理化性质如下：
化合物1
ganomycinj(1):黄色油状液体，[α]25d+67.99(c0.1,meoh)；uv(meoh)λmax(logε)216(3.14),308(1.06)nm；cd(c1.35×10-3m,meoh)λmax(δε)249(+2.84),350(-0.29)nm；ir(neat)νmax3275,2975,1749,1638,1456,1202,789cm-1；正离子模式hrtofmsm/z[m+h]+379.2117(计算值c21h31o6,379.2121)。
化合物2
ganomycinb(2):黄色油状液体；uv(meoh)λmax(logε)214(4.30),297(3.53)nm；ir(kbr)νmax3272,2968,2855,2355,2341,1683,1630,1459,1380,1248,1200,961,813cm-1；1hnmr(methanol-d4,500mhz)δh6.61(d,j＝2.8,h-3′),6.52(dd,j＝8.5,2.8,h-5′),6.64(d,j＝8.51,h-6′),3.69(d,j＝7.7,h-1),5.98(t,j＝7.8,h-2),2.33(t,j＝7.2(br),h-4),2.19(dt,j＝7.2,7.3(br),h-5),5.1(tq,j＝7.3,0.9,h-6),2(t,j＝7.8(br),h-8),2.05(dd,j＝7.1,7.8(br),h-9),5.39(tq,j＝7.1,1.0,h-10),1.62(s,,h-12),1.68(s,,h-13),1.61(d,j＝1.0,h-14)；13cnmr(methanol-d4,125mhz)δc149.3(c-1′),128.04(c-2′),117.76(c-3′),151.17(c-4′),114.78(c-5′),116.91(c-6′),31.75(c-1),140.52(c-2),133.32(c-3),35.88(c-4),28.49(c-5),124.61(c-6),136.73(c-7),40.38(c-8),27.7(c-9),125.5(c-10),132(c-11),17.8(c-12),25.9(c-13),16.15(c-14),172.32(c-15)。正离子模式hrtofmsm/z[m+h]+345.2069(计算值c21h39o4,345.2066)。
化合物3
ganomycini(3)：淡黄色油状液体,[α]25d+36(c0.1,meoh)；uvλmax(logε)212(3.50),297(3.65)nm；cdλmaxnm(δε)(meoh)212(-0.099),240(+0.028)；ir(kbr)νmax3425,2923,1752,1501,1241,1136,1049cm-1,hrfabms343.18748(calcdforc21h26o4,343.18311)；1hnmr(methanol-d4,400mhz)δh7.32(1h,d,j＝1.4hz,h-2′),6.66(1h,d,j＝8.4hz,h-6),6.58(1h,dd,j＝2.8,8.4hz,h-5),6.46(1h,d,j＝2.8hz,h-3),6.21(1h,d,j＝1.4hz,h-1′),5.10(1h,brt,h-10′),5.03(1h,brt,h-6′),2.30(2h,m,h-4′),2.27(2h,m,h-5′),1.99(2h,m,h-9′),1.95(2h,m,h-8′),1.63(3h,s,h-12′),1.55(6h,s,h-13′,h-15′)；13cnmr(cd3od,125mhz)δc176.7(c-14′),151.4(c-4),151.1(c-21),148.8(c-1),137.7(c-7′),132.9(c-3′),132.1(c-11′),125.3(c-10′),123.9(c-6′),123.4(c-2),117.14(c-6),117.11(c-3),113.1(c-5),79.8(c-1′),40.7(c-8′),27.6(c-9′),26.8(c-4′),26.1(c-5′),25.8(c-12′),17.7(c-13′),16.2(c-15′)；正离子模式hrtofmsm/z[m+h]+343.1909(计算值c21h39o4,343.1920)。
实施例4、式1-3所示化合物的体外抑制醛糖还原酶活性试验
准确称取实施例3所制备的式1-3所示3个化合物，用dmso配制成20mm，供活性测试(终浓度范围在1-100μm，配制时溶于少量dmso后，用蒸馏水稀释至相应浓度，控制dmso的最终体积分数<0.1％)；依帕司他作为阳性对照(终浓度分别为20μm、10μm、5μm、2μm、1μm，配制时溶于少量dmso后，用蒸馏水稀释至相应浓度，控制dmso的最终体积分数<0.1％)。
实验步骤：在96孔板中依次加入以下试剂，不同组别的配比如下：
测试组：10μl化合物溶液+25μl浓度(0.1mm)的nadph溶液+25μlpbs缓冲液+15μl醛糖还原酶稀释液
阳性对照组：10μl依帕司他溶液+25μl浓度(0.1mm)的nadph溶液+25μlpbs缓冲液+15μl醛糖还原酶稀释液
空白组：25μl浓度(0.1mm)的nadph溶液+35μlpbs缓冲液+15μl醛糖还原酶稀释液
背景组：25μl浓度(0.1mm)的nadph溶液+60μlpbs缓冲液+15μl醛糖还原酶稀释液
将加完试剂的96孔板在室温放置10min使化合物和酶充分反应，之后除背景组外，其他三组各加入25μl10mmd,l甘油醛溶液作为底物，在37℃恒温箱中反应30分钟，测定各孔在340nm的光密度。
对实验数据统计分析，计算各供试样品的ic50值结果如表2所示。可见，所示化合物均有一定的醛糖还原酶酶抑制活性，式3所示化合物与阳性药依帕司他强度相当。
表21-3的醛糖还原酶抑制活性检测结果