一种快速鉴别重楼品种的试剂盒的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速鉴别重楼品种的试剂盒及鉴别方法。

背景技术：

重楼parisl.为百合科(liliaceae)多年生草本植物，《中国植物志》英文版中记载重楼属植物全世界约有40多个种及变种，主要分布在亚欧大陆的热带及温带地区，我国有22个种，主要分布在云南、贵州、四川等西南地区。重楼属植物经济价值显著，在我国民间具有悠久的药用历史，最早以“蚤休”之名始载于《神农本草经》，“治惊风，摇头弄舌，热气在腹中，癫疾，痈疮阴蚀，下三虫，去毒蛇”，其基源为重楼属多种植物。

重楼作为多基源药材，药用重楼的基源一直比较混乱，由于重楼属不同种植物的根茎形态、组织结构极近似，各品种特征性状交叉重叠，界限模糊不清，给重楼药用植物鉴定带来困难。鉴于重楼属不同种在药用成分甾体皂甙的种类、含量等方面存在显著的差异，疗效也有很大差异，不同品种的重楼混用将给中医产业的质量控制带来极大隐患。

四川地区分布的重楼品种也正是如此，其中，华重楼(parispolyphyllasmithvar.chinensis(franch).hara)是四川省的广布种，并被收载于2015年版中国药典作为重楼药材的正品基源植物之一，另外，球药隔重楼(parisfargesii)和黑籽重楼(p.thibetica)也被认为有显著的药用价值而被收载与2014版《四川省藏药材标准》。但考察发现，作为重楼药材的人工栽培品种还包括多叶重楼(p.polyphyllavar.polyphylla)、五指莲(p.axialis)、平伐重楼(p.vaniotii)，狭叶重楼(p.mairei)、毛重楼(p.mairei)、长药隔重楼(p.polyphyllavar.pseudothibetia)等混杂栽培种，品种十分混乱。因此，对重楼植物进行准确快速的鉴定迫在眉睫。

由于遗传基因具有相对稳定性，不宜受到环境的影响发生改变，且不受植物生长时期，生长部位的影响，因此近年来广泛使用分子生物学手段进行中药材鉴定。已有的报道中，研究者们均是通过dna条形码序列对重楼属品种进行鉴定(见朱英杰，方海南重楼属dna条形码筛选与鉴定方法的研究[d].西南交通大学.2010；姜藜等，基于its全序列分析的重楼常见混伪品鉴定研究[j].中国新药杂志,2013,22(20):2439～2444；方海兰等，基于dna条形码的中药材种子种苗鉴定研究—以重楼为例[j].中药材材,2016,35(5):986～990)，需要在pcr反应后进行产物回收测序等步骤，不仅操作繁琐费时，而且测序成本高，不利于推广应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速鉴别重楼品种的试剂盒及其鉴别方法。

本发明提供了一种鉴别重楼品种的试剂盒，它包含1-3对引物，引物对选自：seqidno：1～2所示的引物对1，seqidno：3～4所示的引物对2，seqidno：5～6所示的引物对3。

h-f(seqidno：1)：gcgcccgatgtcattcga

h-r(seqidno：2)：tttcaacccacaggcgtagtcc

qyg-f(seqidno：3)：ggaacgagtatgtgaatgtgacccat

qyg-r(seqidno：4)：ctacgttcttcatcgatacgggtt

hz-f(seqidno：5)：taggcgtggcacggcgt

hz-r(seqidno：6)：caacactttcgaccaacggga

本发明提供了一种快速鉴别重楼品种的方法，步骤如下：

a、提取样本dna：提取待检样本的dna；

b、基因扩增：用上述试剂盒对待检样本的dna进行pcr扩增；

c、结果检测：对dna扩增结果进行检测。

其中，所述重楼品种为华重楼、黑籽重楼、球药隔重楼和/或长药隔重楼。

其中，步骤a中，所述待检样本为华重楼、黑籽重楼、球药隔重楼、长药隔重楼、多叶重楼、五指莲、平伐重楼、狭叶重楼、毛重楼、南重楼。

其中，步骤b中，所述pcr扩增的条件为：

95℃预变性30s；

94℃变性30s，64～66℃退火30s，72℃延伸20s；27～29个循环；

72℃延伸1min；

优选地，所述退火的温度为66℃，循环的次数为28次。

其中，步骤b中，所述pcr扩增的体系为：

总体积为25μl时：

10×taqbuffer2.5ul，dntp0.5ul，模板30～50ng，

seqidno：1～6引物的用量分别为1μm、1μm、0.5μm、0.5μm、75nm、50nm，其余为ddh2o；

优选地，模板用量为30ng。

其中，步骤c中，所述检测采用的方法为凝胶电泳。

本发明还提供了上述试剂盒在鉴别重楼各品种中的用途。

其中，所述重楼品种为华重楼、黑籽重楼、球药隔重楼和/或长药隔重楼。

本发明还提供了上述试剂盒在鉴别华重楼、黑籽重楼、球药隔重楼及其混伪品中的用途；

其中，所述混伪品为长药隔重楼、多叶重楼、五指莲、平伐重楼、狭叶重楼、毛重楼、南重楼。

本发明提供的试剂盒和方法，可以准确、有效的鉴别川产重楼药材基源植物华重楼、球药隔重楼、黑籽重楼与其他同属近缘易混种，还可以鉴别长药隔重楼品种；实现了在单个反应管中一次性检测多个靶标的目的，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，操作简单，高效快速，成本低，为重楼属药材的鉴别及利用提供可靠依据，应用前景良好。

(有益效果部分层层递进)

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为重楼不同部位提取效率结果图(a)及通用引物its-4/its-l对样品模板扩增的结果图(b)；

其中，h.华重楼；qyg.球药隔重楼；hz.黑籽重楼；cgy.长药隔重楼；wzl.五指莲重楼；pf.平伐重楼；dy1,多叶重楼1；dy2.多叶重楼2；dy3.多叶重楼3；dy4.多叶重楼4；dy5.多叶重楼5；xy1狭叶重楼1；xy2.狭叶重楼2；m.毛重楼；n.南重楼。

图2为引物浓度考察电泳图；

图3为华重楼，球药隔重楼，黑籽重楼及其常见混杂栽培种多重pcr鉴别电泳图；其中，nc.阴性对照；h.华重楼；qyg.球药隔重楼；hz.黑籽重楼；cgy.长药隔重楼；wzl.五指莲重楼；pf.平伐重楼；dy1,多叶重楼1；dy2.多叶重楼2；dy3.多叶重楼3；dy4.多叶重楼4；dy5.多叶重楼5；xy1狭叶重楼1；xy2.狭叶重楼2；m.毛重楼；n.南重楼。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

实施例1本发明区分重楼品种的方法

一、实验材料

1.药材

本次实验采集来自16个产地的华重楼，球药隔重楼，黑籽重楼极其常见混杂栽培种共计62份，其中包括华重楼9份，黑籽重楼7份，球药隔重楼11份，多叶重楼5份，毛重楼3份，狭叶重楼4份，平伐重楼5份，五指莲重楼7份，长药隔重楼5份，南重楼2份。实验材料样本数及采集地见表1。样品经成都中医药大学尹鸿翔副教授鉴定。剩余样品保存于成都中医药大学民族医药学院实验室。

2.试剂

琼脂糖，goldviewi型核酸染色剂(北京索莱宝科技有限公司)；easytaqdnapolymerase，10×easytaqbuffer，dntpsmixture(北京全式金生物技术有限公司)；植物组dna提取试剂盒(成都福际生物技术有限公司)，α-高聚淀粉酶(思科生物科技有限公司)。

3.仪器

legendmicro21r离心机(美国thermo)；bsa124s分析天平(sartorius科学仪器有限公司)；mk-10干式恒温器(杭州奥盛仪器有限公司)；pcr仪(杭州博日科技有限公司)；ddy-12电泳系统(北京六一仪器厂)；激光成像仪typhoon7000(通用电气医疗集团生命科技部)。

表1实验样品信息

二、实验方法

1.dna基因组提取

叶片样品硅胶干燥，取20mg，用植物组dna提取试剂盒进行dna提取。根茎样品75℃烘干，打粉，过3号筛，取20mg粉末,按照植物组dna提取试剂盒说明书进行改进，加蛋白酶的同时添加20μl的75％α-高聚淀粉酶；

种子取1粒，烘干，磨成细粉，照植物组dna提取试剂盒说明书进行改进，加蛋白酶的同时添加30μl的75％α-高聚淀粉酶；由于种子较小，过柱纯化后加入50μl洗脱获得dna。

dna提取物用通用引物its-4/its-l进行pcr扩增，扩增产物取7.5μl，采用2％的琼脂糖凝胶，在电压150～180v下电泳5min，在凝胶成像仪下观察，验证提取质量。通用引物序列及pcr扩增方法见表2。

实验样品用变色硅胶干燥，密封袋密封存放于-20℃冰箱。

2.its测序及特异性引物设计及筛选

对提取的重楼样品dna模板用通用引物its-4/its-l进行its序列扩增，每个样品平行扩增3次，扩增产物送成都擎科梓熙生物科技有限公司进行测序，测序结果用megalign软件进行序列校对并分析，找出具有稳定差异的snp位点，用pirmerpermier5.0软件在华重楼，球药隔重楼，黑籽重楼的特有snp位点区域分别设计特异性引物，并用设计的引物对重楼样品dna模板进行pcr扩增，筛选出特异性好，能够准确区分三个法定品种并能有效鉴别其他常见伪品的3对引物。分别命名为h-f/h-r，qyg-f/qyg-r，hz-f/hz-r。

引物序列由擎科梓熙生物科技有限公司合成。

2.3pcr反应

用筛选后的3对特异性引物进行多重pcr扩增。取扩增产物采用2％的琼脂糖凝胶，在电压150～180v下电泳7min，在凝胶成像仪下观察。

3对特异性引物序列及pcr扩增方法见表2。

表2引物及pcr反应条件

三、实验结果

1.重楼不同部位提取dna及通用引物its-4/its-l对样品模板扩增的结果

对重楼的根茎，叶及种子进行了dna提取并用通用引物its-4/its-l进行扩增，结果见图1。

结果显示重楼的根茎，叶及种子都有明显的条带，表明该提取方法效果良好。通用引物its-4/its-l对样品模板扩增的结果表明模板dna的质量满足后续实验研究。

2.多重pcr鉴别不同重楼品种

用已经确立的dna提取方法、多重pcr体系及反应条件对收集的重楼品种进行鉴别，结果见图3。

可见，华重楼有两条长度不等，明暗相似的条带，球药隔重楼有一条在marker250bp和100bp之间的条带，黑籽重楼有一条在500bp和250bp之间的条带，长药隔重楼有一条亮带和两条大小不同的暗带，可以与上述三个重楼有明显区分，其余重楼样品均没有条带。

因此，本发明方法可准确有效鉴别华重楼，球药隔重楼，黑籽重楼极其常见混杂栽培种。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：

试验例1本发明pcr引物的筛选

1、特异性引物的设计

用pirmerpermier5.0软件在华重楼，球药隔重楼，黑籽重楼的特有snp位点区域分别设计特异性引物，并用设计的引物对重楼样品dna模板进行pcr扩增，设计的各引物见表3。

表3设计的各引物序列

2、pcr扩增

pcr反应体系及扩增结果见表4-13。

pcr扩增条件：94℃30sx℃30s72℃20s28cycle72℃后延伸2min。其中，x为退火温度，具体见下述各表格中温度。

表4初步验证引物的特异性

表5qyg-f1/qyg-r1、hz-f2/hz-r2、h-f1/h-r1引物组合的鉴别结果

表6qyg-f1/qyg-r2、hz-f2/hz-r2、h-f1/h-r1引物组合的鉴别结果

表7hz-f2/hz-r2、h-f1/h-r1与其它不同引物组合的鉴别结果

表8hz-f2/hz-r2、h-f1/h-r1与其它不同引物组合的鉴别结果

表9hz-f2/hz-r2、h-f1/h-r1与其它不同引物组合的鉴别结果

表10h-f1/h-r1与其它不同引物组合的鉴别结果

表11h-f1/h-r1、qyg-f2/qyg-r7与其它不同引物组合的鉴别结果

表12h-f1/h-r1、hz-f3/hz-r3与其它不同引物组合的鉴别结果

表13两种引物组合的鉴别结果

可见，仅在h-f2/h-r2，qyg-f2/qyg-r8，hz-f3/hz-r3组合时，能够通过pcr扩增准确区分三个法定品种(华重楼、球药隔重楼和黑籽重楼)并能有效鉴别其他常见伪品，其它引物组合均不能有效区分。因此，选择该引物组合，并将其分别命名为h-f/h-r，qyg-f/qyg-r，hz-f/hz-r。

试验例2本发明pcr引物浓度及反应条件的优化

一、实验方法

用特异性引物h-f/h-r，qyg-f/qyg-r，hz-f/hz-r进行多重pcr扩增，pcr反应条件根据引物的tm和扩增条带的长度初步定为95℃解链30s；94℃变性30s；64℃退火30s；72℃延伸20s；循环28次；72℃后延伸1min。在该条件下对引物浓度进行优化。在优化后的pcr体系下对pcr扩增条件进行了优化。

本发明对引物浓度、pcr循环数、退火温度，模板量四个因素进行了优化

①h-f/h-r，qyg-f/qyg-r，hz-f/hz-r三组引物浓度组合：

0.25μm/0.25μm，0.25μm/0.25μm，0.125μm/0.125μm；

0.5μm/0.5μm，0.5μm/0.5μm，0.25μm/0.25μm；

0.5μm/0.5μm，0.5μm/0.5μm，0.125μm/0.125μm；

1μm/1μm，0.5μm/0.5μm，0.125μm/0.125μm；

1μm/1μm，0.5μm/0.5μm，75nm/50nm；。

②退火温度：58，59，60，62，64，65，66，67。

③循环数：26，27，28，29，30。

④模板量：10ng，20ng，30ng,40ng,50ng。

取7.5μl扩增产物采用2％的琼脂糖凝胶，在电压150～180v下电泳7min，在凝胶成像仪下观察。

二、实验结果

1、引物浓度优化

结果见图2。

可见，当加入的三种引物浓度组合为1μm/1μm，0.5μm/0.5μm，75nm/50nm时，华重楼有两条明显的长度分别为86bp和271bp的条带，球药隔重楼有一条长度为121bp的条带，黑籽重楼有一条长度为339bp的条带，可准确鉴别重楼品种。

而其它浓度组合下，要么条带亮度太弱，要么引物用量较高，综合考虑节约引物用量和条带亮度及条带特异性，选择本发明的引物浓度组合。

2、不同退火温度、循环数、模板量的扩增结果见表14。

可见，退火温度在58℃～62℃时各重楼品种存在无法鉴别的非特异性扩增，退火温度在64℃～66℃时华重楼，球药隔重楼及黑籽重楼都有鉴别条带，而其它重楼均无条带。为了保证扩增产物的特异性，选择退火温度为66℃。

pcr循环数在27～30时，三种川产重楼药材基源植物(华重楼、球药隔重楼、黑籽重楼)都能扩增出鉴别条带，其中，循环数在28～29时，三种重楼药材的鉴别条带较亮，循环数在30时，有非特异性扩增。

为了保证扩增产物的特异性，选择循环数为28个循环。

模板量在30ng～50ng时，三种重楼药材都能扩增出条带，其他重楼除了长药隔有三条明显可以与三种重楼药材相区别的条带外，都没有非特异性扩增。

因此，多重pcr的反应体系选择：

25μl体系中：10×taqbuffer2.5ul；dntp0.5ul；h-f/h-r各1μm；qyg-f/qyg-r各0.5μm；hz-f75nm；hz-r50nm；模板1ul(≈30ng)；其余为ddh2o。

多重pcr的反应条件选择：

95℃解链30s；94℃变性30s；66℃退火30s；72℃延伸20s；循环28次；72℃后延伸1min。

表14pcr条件优化

注：“+”.一条亮带；“δ”。一条暗带；“－”.无条带。

综上，本发明提供的试剂盒和方法，可以准确、有效的鉴别川产重楼药材基源植物华重楼，球药隔重楼，黑籽重楼与其他同属近缘易混种，还可以鉴别长药隔重楼，实现了在单个反应管中一次性检测多个靶标的目的，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，操作简单，高效快速，成本低，为重楼属药材的鉴别及利用提供可靠依据，应用前景良好。

sequencelisting

<110>成都中医药大学

<120>一种快速鉴别重楼品种的试剂盒

<130>gy041-17p1191

<160>26

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<213>its上游引物

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<212>dna

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<212>dna

<213>hz-f1引物

<400>9

catcccactcttcaacctaccgtgt25

<210>10

<211>25

<212>dna

<213>hz-f2引物

<400>10

catcccactcttcaacctaccgtct25

<210>11

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<212>dna

<213>hz-f4引物

<400>11

taggcgtggcacggagt17

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<212>dna

<213>hz-r1引物

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<212>dna

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ctcggtgccaactactcccgat22

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<212>dna

<213>hz-r4引物

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caacactttcgaccaacggaa21

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tcccactcttcaacctaccgtgt23

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ggaacgagtatgtgaatgtgaccctt26

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<212>dna

<213>qyg-r1引物

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