一种人类HLA‑B*5801基因多态性检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物技术以及医学领域，具体而言，涉及一种人类hla-b*5801基因检测试剂盒。

背景技术：

别嘌呤醇是治疗痛风的一线药物，是目前唯一的黄嘌呤氧化酶抑制剂，主要用于治疗痛风和防止痛风性肾病、继发性高尿酸血症以及重症癫痫的辅助治疗。其代谢产物氧嘌呤醇通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性(后者能使次黄嘌呤转为黄嘌呤，再使黄嘌呤转变成尿酸)，使尿酸生成减少，血中及尿中的尿酸含量降低到溶解度以下的水平，从而防止尿酸结石的沉积，有助于痛风结节及尿酸结晶的重新溶解。但别嘌呤醇可引起严重的副作用，包括stevens-john综合征(sjs)及中毒性表皮坏死症(ten)。

科学研究发现hla-b*5801等位基因与别嘌呤醇引起的严重皮肤不良反应(scars)有很强的关联性，而在中国人群中携带此等位基因的频率较高，因此2012年美国风湿管理学会更新了痛风管理指南，其中建议使用别嘌呤醇前，对严重过敏反应的高危人群(中国裔汉族，韩国裔，泰国裔)，应该进行hla-b*5801等位基因检测。

hla(人类白细胞抗原)可分为三类，其中编码i类分子中的hla-b系列抗原的hla-b基因有上千种等位基因，hla-b*5801等位基因是其中的一种。

日本学者研究发现psors1c1基因位点的snp-rs9263726与别嘌呤醇所致的sjs/ten相关，且该snp与hla-b*5801完全连锁，这一发现为检测hla-b*5801等位基因找到了简单快速的方法。

目前针对基因多态性的检测方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶解曲线检测法(highresolutionmeltinganalysis，hrm)，荧光定量pcr法等。其中最常见方法为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难；传统荧光定量pcr法在临床上应用较为广泛，但该方法检测基因多态性一般采用genotyping方法进行检测，该方法对样本类型、样本质量以及多态性分布有一定要求，全血样本和低浓度基因组dna均不能进行准确检测。因此，需要建立一种快速有效的可以直接检测全血，同时兼容检测低浓度基因组dna的检测方法。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种hla-b*5801基因多态性的检测试剂盒，以此解决现有基因多态性检测技术中全血样本无法直接进行检测，以及低浓度基因组dna检测效果不理想的问题。本试剂盒可用于高通量、低成本快速检测hla-b*5801基因多态性，其灵敏度高，特异性强，可适用于edta、柠檬酸盐抗凝新鲜全血或血浆直接进行检测，也可以适用于从edta、柠檬酸盐抗凝新鲜全血或血浆中提取的人类基因组dna的检测。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种人类hla-b*5801基因多态性检测试剂盒，包括：

核苷酸序列为seqidno:1所示的正向外引物；

核苷酸序列为seqidno:2所示的反向外引物；

核苷酸序列为seqidno:3所示的用于检测目的基因的突变位点的arms引物；

核苷酸序列为seqidno:4所示的用于检测野生型位点的taqman探针；

核苷酸序列为seqidno:5所示的用于检测突变位点的taqman探针。

其中seqidno:1、seqidno:2为普通pcr引物，扩增包含hla-b*5801基因多态性的dna片段；seqidno:3为arms引物，用于特异性扩增含有hla-b*5801密码子cat的dna片段。arms引物3’末端与突变型碱基配对，seqidno:3在arms引物的3’末端倒数第3位增加错配碱基。

本发明提供的试剂盒用于检测hla-b*5801等位基因的序列号为rs9263726的snp位点：

表1：hla-b*5801等位基因的类型

其中，rs9263726g为野生型位点，rs9263726a为突变型位点。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1).灵敏度高，可以准确检测0.2ng基因组dna的基因型；

2).特异性好，采用arms特异性引物和snp分型探针相结合的技术，可以特异性扩增识别对应的基因型；

3).结果真实可靠，检测过程均为闭管反应，显著降低污染，并且加入ung酶防污染。另外采用人源性内标监测样本质量和操作准确性，采用弱阳性对照和空白对照监测试剂盒质量，避免了假阳性和假阴性结果的发生；

4).结果清晰明了易分析，野生型探针，突变型探针和内标探针分别用不同的荧光标记，三色通道检测，结合结果判读方法，即可明确得到结论；

5).操作简单，耗时短，本试剂盒采用一管检测两种多态性，避免了分管；同时又将酶直接混入pcr体系，极大地简化了操作流程；

6).可以直接进行全血检测，不需再提取基因组dna。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例2的qpcr实验结果；

图2为本发明实施例2的qpcr实验结果；

图3为本发明实施例2的qpcr实验结果；

图4为本发明实施例3的qpcr实验结果；

图5为本发明实施例3的qpcr实验结果；

图6为本发明实施例3的qpcr实验结果。

具体实施方式

本发明涉及一种人类hla-b*5801基因多态性检测试剂盒，包括：

核苷酸序列为seqidno:1所示的正向外引物；

核苷酸序列为seqidno:2所示的反向外引物；

核苷酸序列为seqidno:3所示的用于检测目的基因的突变位点的arms引物；

核苷酸序列为seqidno:4所示的用于检测野生型位点的taqman探针；

核苷酸序列为seqidno:5所示的用于检测突变位点的taqman探针。

其中seqidno:1、seqidno:2为普通pcr引物，扩增包含hla-b*5801基因多态性的dna片段；seqidno:3为arms引物，用于特异性扩增含有hla-b*5801密码子cat的dna片段。arms引物3’末端与突变型碱基配对，seqidno:3在arms引物的3’末端倒数第3位增加错配碱基。

优选地，本发明提供了两条taqman探针，均是snp探针，可以特异性识别目的序列。优选地，如上所述的试剂盒，所述taqman探针5’端连接有荧光报告基团，在核酸的3’端连接有荧光淬灭基团，且两个taqman探针的荧光报告基团不同；

所述荧光报告基团选自fam、vic、rox、cy3和cy5中的任一种；所述荧光淬灭基团选自tamra、bhq1、bhq2和nfq中的任一种。

在本发明的一些实施方式中，检测野生型的探针的5’端采用fam标记，检测突变型的探针5’端采用vic标记，两条探针的3’端荧光淬灭基团均是nfq(non-fluorescentquencher)，该基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度。进一步优选地，两条探针同时在一个反应管内，建立了同一反应管检测同一基因两种不同多态性的多重荧光定量pcr检测

在本发明的一些实施方式中，野生型和突变型的taqman探针上都连接有mgb(minorgroovebinder)修饰基团；

优选地，所述mgb修饰基团与所述荧光淬灭基团连接；例如mgb-nfq；

mgb修饰基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度，同时该特异性探针上还连接有mgb修饰基团，可以将该探针的tm值提高10℃左右，因此同样的tm值，mgb探针可以比普通taqman探针设计的更短，使得探针在识别具有单个核苷酸多态性位点时，特异性更强。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还提供了内标系统，所述内标系统包括内标引物和内标探针；

优选地，所述内标引物和内标探针为人源性内标；

更优选地，所述内标探针5’端连接有荧光报告基团，在核酸的3’端连接有荧光淬灭基团；所述荧光报告基团选自fam、vic、rox、cy3和cy5中的任一种；所述荧光淬灭基团选自tamra、bhq1、bhq2和nfq中的任一种；且所述内标探针与所述taqman探针上的荧光报告基团均不同；

更优选地，所述内标引物为核苷酸序列为seqidno:6所示的正向内标引物、核苷酸序列为seqidno:7所示的反向内标引物；所述内标探针的核苷酸序列为seqidno:8所示；

使用内标系统监测该荧光定量pcr反应是否存在抑制，由于待检测的样品中的某些成分可能含有导致pcr出现部分或完全抑制；此外，扩增仪可能存在高于允许范围的孔间差，导致不同管间扩增效率差异，另外人为加样错误也可能导致假阴性结果的出现，因此本发明实施例中采用内标系统来消除上述隐患，保证了检测结果的准确性；seqidno:6～8所示的引物所检测的内标物的序列选择的是人类基因组dna的一段gapdh序列；所述的gapdh序列与靶标序列同时存在于人类基因组，且与目标待检基因无同源性。因此保证了内标引物只扩增gapdh序列，而不影响靶标序列扩增；

优选地，所述内标探针5’端修饰有rox，3’端修饰有bhq2。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒优选还包括弱阳性对照液和/或空白对照液；

所述弱阳性对照液为含有2种质粒的混合液，所述2种质粒分别含有2种不同的带有待检测突变位点的hla-b*5801等位基因(即质粒中包含rs9263726g或rs9263726a突变位点的dna片段)；该质粒可为本领域技术人员熟知的质粒，这2种质粒浓度可以相同，优选地，所述质粒的浓度为2000～3000copies/μl；

所述空白对照液为tris-hcl缓冲液；优选地，所述tris-hcl缓冲液的浓度为7～13mm，ph为7.5～8.5。

优选地，如上所述的试剂盒，所述试剂盒还包括血液处理剂、pcr缓冲液、酶和水中的一种或多种；

优选地，如上所述的试剂盒，所述血液处理剂为0.9％的nacl水溶液；

血液样本经血液处理剂10～20倍稀释后可以直接进行pcr扩增，免去了dna提取步骤。

优选地，如上所述的试剂盒，所述pcr缓冲液中包括pcr添加剂、mgcl2和dntps中的一种或多种；

优选地，pcr缓冲液中mgcl2的浓度为1.0～5.0mm；

优选地，所述pcr添加剂包括dmso、甘油、bsa中的一种或多种；

优选地，所述dntps包括datp、dgtp、dctp、dutp；更优选地，datp、dutp、dgtp和dctp的浓度各0.1～0.5mm。

优选地，如上所述的试剂盒，所述酶包括taq酶、ung酶；

优选地，所述taq酶和ung酶单独分装或混合制成溶液；

优选地，将所述taq酶和ung酶混入pcr工作液中；直接点样即可进行pcr扩增，极大地节省了操作时间，整个反应只需90分钟即可完成。

更优选地，当所述taq酶和ung酶混合制成溶液时，所述taq酶和ung酶的总量比为：(0.5u～1.0u)：(0.1u～0.5u)。

本发明提供的酶溶液中含有taq酶，优选hotstarttaq酶，其为pcr反应所必需的，且该酶溶液还含有ung酶。其中ung(uracil-n-glycosylase)酶为尿嘧啶-n-糖基化酶，其特点是最佳活性温度为50℃，95℃灭活，其作用原理是选择性水解断裂含有du的双链或单链dna中的尿嘧啶糖苷键，形成有缺失碱基的dna链。在pcr反应中，使用ung酶可预防非特异性pcr扩增和污染。

本发明还涉及一种使用如上所述试剂盒进行人类hla-b*5801基因检测的方法，包括

(1)将所述试剂盒中的试剂与含有dna的样品进行混合组成pcr反应体系，并进行pcr反应；(2)分析扩增产物中的荧光信号强度。

优选地，所述pcr反应体系中，正向外引物、反向外引物、arms引物、用于检测野生型位点的taqman探针、用于检测突变位点的taqman探针的浓度比为0.2μm-1.0μm：0.2μm-1.0μm：0.5μm-1.5μm：0.1μm-0.5μm：0.2μm-1.0μm；

更优选地，当所述pcr反应体系中还包括正向内标引物、反向内标引物及内标探针时，seqidno:1～8的所示引物的浓度比为：0.2μm-1.0μm：0.2μm-1.0μm：0.5μm-1.5μm：0.1μm-0.5μm：0.2μm-1.0μm：0.1μm-0.5μm：0.1μm-0.5μm：0.1μm-0.5μm。

优选地，如上所述的方法，所述含有dna的样品为edta和/或柠檬酸盐抗凝新鲜全血或血浆；

或从edta和/或柠檬酸盐抗凝新鲜全血或血浆中提取的人类基因组dna。

该检测方法具体可包括以下步骤：

(1)设计并筛选特异性扩增与检测hla-b*5801基因多态性的引物组合和探针组合；制备本发明的人类hla-b*5801基因检测试剂盒。

(2)血液样本处理；

(3)进行荧光定量pcr扩增：每管中加入特异性引物组和探针组、pcr反应缓冲液、taq酶、ung酶、内标系统。反应液配制完成后分装到pcr反应孔中，加入处理后的血液样本或提取好的基因组dna，并进行pcr反应。

具体地，以25μl反应体系为例，向反应管中加入待检测样品后得到的混合物中各组分终浓度及含量如下：

上述体系仅为例证性，在实际应用中可以按照比例扩大或缩小该混合物体积及其中各组分含量。

具体地，在上述25μl反应体系中，所述各对引物包括上述步骤(1)中的1对特异性引物，1条arms筛选引物及内标引物，所述各条探针包括上述步骤(1)中的特异性探针和内标探针，所述样品为全血样本或基因组dna。

具体地，在步骤(3)中的荧光定量pcr反应条件为：

37℃处理10分钟，95℃预变性5分钟，

40个循环：95℃15秒，60℃60秒并收集荧光信号。

在上述pcr反应后，所得结果按表1进行结果判定：

表2结果判定

本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、结果真实可信的优点，同时该检测方法操作简单快速，能在90分钟内完成检测，并且结果判读简单客观，便于分析。

以下通过具体实施例对本发明进一步阐述。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

制备本发明的人类hla-b*5801基因检测试剂盒，包括以下步骤：

1.引物及探针合成：

设计并合成特异性引物seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3，特异性探针seqidno:4与seqidno:5，并在seqidno:4的5’端标记fam荧光基团，3’端标记nfq-mgb不发光淬灭基团，在seqidno:5的5’端标记vic荧光基团，3’端标记nfq-mgb不发光淬灭基团。将引物、探针分别制备成100μm的母液储存。

2.制备内标系统：设计并合成针对人源性基因gapdh的1对内标引物，该引物对序列为seqidno:6和seqidno:7；设计并合成内标探针，该探针为seqidno:8。在seqidno:8的5’端标记rox荧光基团，3’端标记bhq2不发光淬灭基团。将该内标引物、内标分别配制成100μm的母液储存。

3.制备其他试剂：制备pcr缓冲液，其中含有3.0mm的mgcl2，datp、dutp、dgtp和dctp各0.2mm，dmso2ul，bsa0.1mg/ml；制备酶混合液，其中含有taq酶0.5u，ung酶0.25u。

4.制备弱阳性对照液和空白对照液，该弱阳性对照液中含有2种质粒dna，这些质粒dna中分别含有本发明试剂盒涉及的hla-b*5801g质粒和hla-b*5801a质粒2种不同的多态性质粒，该质粒的选择及设计为本领域技术人员熟知，均为2500copies/μl；该空白对照液为tris-hcl(10mm)缓冲液。

5.pcr反应液配制：按照下表进行pcr反应液配制：

计算20人份各成分使用量,一次加入各组分，充分混匀。

6.制备血液处理剂，血液处理剂为0.9％的nacl。

7.组装试剂盒：将试剂盒各组分按顺序组装成成品试剂盒，具体包括1号管hla-b*5801pcr反应液，2号管血液处理剂，3号管弱阳性对照，4号管空白对照。

实施例2

用实施例1制备的人类hla-b*5801基因检测试剂盒对待测样品进行检测。

本实施例中收集10例edta抗凝全血样品，用血液处理剂进行处理,然后用实施例1制备的人类hla-b*5801基因检测试剂盒进行检测。

1.血液样品处理

取全血10μl，加入90μl的血液处理剂，震荡混匀1min。

2.样本的荧光定量pcr检测

将步骤1中样品取2μl分别加入到23μl的实施例1的试剂盒的hla-b*5801检测反应体系中，使反应体系总体积为25μl，并放入荧光定量pcr仪，按如下所示设置pcr反应程序后进行扩增反应：

37℃10min；

95℃5min；

95℃15s，60℃60s，40个循环；每个循环后收集fam、vic和rox的荧光信号。

3.样本的检测结果分析:10例样品的检测结果如下：

hla-b*5801位点g/g纯合野生6例，其中一个检测结果如图1所示；hla-b*5801位点a/a纯合突变样本1例，检测结果如图2所示；hla-b*5801位点g/a杂合突变样本3例，其中一个检测结果如图3所示；

上述10例样本荧光定量pcr检测结果与测序结果一致。以上结果表明本发明实施例提供的检测试剂盒用于人类hla-b*5801基因多态性检测结果可靠，与直接测序一致率达到100％。

实施例3

取实施例2中检测结果为杂合突变的剩余全血样本，提取基因组dna,测定dna浓度后，将dna依次稀释成10ng/μl、1ng/μl和0.1ng/μl，评价试剂盒的检测性能。

1.基因组dna提取

取全血300μl，加入900μl的细胞裂解液cl，颠倒混匀，静置5min；

10,000rpm(11,500×g)离心1min，吸去上清，留下细胞沉淀，向离心收集到的细胞沉淀中加200μl缓冲液gs，振荡至彻底混匀；

加入20μlproteinasek溶液，混匀；

加200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮(如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止)；

加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀；

将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱cb3放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb3放入收集管中；

向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb3放入收集管中；

向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb3放入收集管中；

向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12,000rpm(13,400×g)离心2min，倒掉废液；

将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

将吸附柱cb3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加100μl洗脱缓冲液tb，室温放置2-5min，12,000rpm(13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中；

取2μl所得溶液测od值以确定dna浓度，然后将样品dna稀释到10ng/μl、1ng/μl和0.1ng/μl。

2.样本的荧光定量pcr检测

将步骤1中稀释后的dna样品依次取2μl分别加入到23μl的实施例1的试剂盒的hla-b*5801检测反应体系中，使反应体系总体积为25μl，并放入荧光定量pcr仪，按如下所示设置pcr反应程序后进行扩增反应：

37℃10min；

95℃5min；

95℃15s，60℃60s，40个循环；每个循环后收集fam、vic和rox的荧光信号。

3.样本的检测结果分析：

3组样本检测结果如附图4～6所示。

a组dna总量为20ng(10ng/μl，上样2μl)；

b组dna总量为2ng(1ng/μl，上样2μl)；

c组dna总量为0.2ng(0.1ng/μl，上样2μl)；

由图中结果可以看出，杂合型样本上样总量低至0.2ng时，体系fam(检野生型)、vic(检突变型)和rox(内标)三通道依然正常扩增，因此本发明的试剂盒检测灵敏度可以达到：低至0.2ng的基因组dna准确检出基因型。本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于大规模推广。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

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