用于扩增检测玉米5512J基因的分子标记的特异性引物组及其应用的制作方法

本发明涉及一种用于扩增检测玉米5512j基因的分子标记的特异性引物组及其应用。

背景技术：

玉米（zeamaysl.）属于禾本科玉蜀黍属玉米种，为一年生草本植物，起源于中美洲地区，是世界三大粮食作物之一，同时也是重要的工业原料和能源作物。随着世界经济的发展，作为食品、饲料和燃料的重要来源，玉米的需求量在不断增加，同时也是我国今后一个时期消费需求增长最快的农作物。近年来玉米深加工业产能迅速扩展，对畜牧业和养殖业的发展表现出了举足轻重的作用，这对玉米产量和品质的改良与创新提出了更高的要求。

为了提高玉米品质，国内外科研人员利用生物学的方法对玉米的品质进行大量的试验摸索和改造尝试。其基本原理是，以玉米中一些籽粒的突变体为材料，运用分子生物学和遗传学方法对其进行相关基因的克隆和研究，从而借助遗传学的手段提高其营养价值。在玉米中，有一类与蛋白品质相关的突变体，被称为opaque或floury突变体。在表型上，这类突变体胚乳细胞内的主要储藏细胞器淀粉粒和蛋白体包装不紧密，造成籽粒胚乳结构疏松，比较容易粉碎，所以与野生型的透明籽粒相比容易消化，适口性好，更适合用于优质饲料的加工。其中最为有名的是opaque2突变体。opaque2突变体具有粉质的、不透光的胚乳表型。opaque2基因可以显著降低醇溶蛋白在胚乳蛋白中的比例、显著提高玉米籽粒胚乳蛋白中赖氨酸含量，从而提高籽粒品质。floury1是另一个比较有名的籽粒粉质突变体。fl1通过改变22kd醇溶蛋白在蛋白体中的定位来影响蛋白体的合成，从而形成粉质的胚乳表型。

5512j也是一个类似的粉质胚乳突变体。对5512j突变体的遗传学分析表明：5512j是单基因控制的隐性突变，能够引起玉米籽粒的不透明表型（图1）。遗传学研究将5512j基因定位在2号染色体上。5512j基因至今尚未通过杂交育种被很好地利用，主要是因为5512j由隐性基因突变引起，通过杂交选育需要较长的时间。借助dna分子标记辅助育种，利用网上玉米基因组序列信息结合相关生物信息学软件的分析进行了ssr、indel等分子标记的开发，筛选出多态性良好的分子标记用于对群体材料的检测。最终通过对大规模突变体籽粒群体进行检测，将5512j基因限定在2号染色体短臂上h2和k6区间内。

dna分子标记辅助育种是一种新的育种技术。该技术是通过利用与目标性状紧密连锁的dna分子标记对控制目标性状的基因进行间接选择的现代育种技术。该技术对目标基因的转移，不仅可以在早代进行准确、稳定的选择，而且可以克服再度利用隐性基因时识别难的问题，从而加速育种过程，提高育种效率。由于其明显的优越性，该技术已得到了发达国家的高度重视和应用。dna分子标记辅助育种技术的关键是：（1）获得的分子标记应该是能够区分育种过程中杂交亲本（纯合5512j类型和纯合野生型类型）以及他们的杂交子代（f1代）的共显性标记；（2）获得的共显性分子标记位于该基因在染色体物理位置的两侧；（3）两侧的分子标记都应该与控制目标性状的基因紧密连锁。但是，以往的研究中没有获得与5512j基因紧密连锁的共显性dna分子标记，故无法对该基因所控制的目标性状进行dna分子标记辅助的选择。所以，对于该种标记的获得和鉴定是对玉米品质相关基因5512j进行dna分子标记辅助育种的基础。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种用于扩增检测玉米5512j基因的特异性分子标记的特异性引物组。

本发明的目的之二在于提供该特异性引物组在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本5512j中的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种用于扩增检测玉米5512j基因的特异性分子标记的特异性引物组，其特征在于：

扩增该玉米5512j基因左侧dna片段的第一对特异性引物的碱基序列为：

正向引物从5′端至3′端为：gcagagttggagacaagttcgg；

反向引物从5′端至3′端为：cacaagtaatgtttggggtaggc；

扩增该玉米5512j基因右侧dna片段的第二对特异性引物的碱基序列为：

正向引物从5′端至3′端为：gcaacgagtgagcgagatgag；

反向引物从5′端至3′端为：gccatgtcgctctggtatacg。

一种根据上述的用于检测玉米5512j基因的分子标记在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本以及它们杂交子代类型中的应用。

本发明提供的两对位于5512j基因染色体物理位置两侧的与其紧密连锁的共显性dna分子标记，以及利用这两对分子标记能对玉米5512j基因进行分子标记辅助选择的方法。利用这两个分子标记能对玉米任何时期和任何组织的dna进行基因型鉴定，检测杂交育种子代各单株中5512j基因的存在与否以及杂合或纯合状态。这种检测方法的准确性高，操作简单，为利用5512j基因的dna分子标记辅助育种提供重要的技术手段。

附图说明

图1、玉米5512j纯合突变体和野生型籽粒外形及透光观察。wt为野生型籽粒；5512j为突变体纯合籽粒。

图2、用于进行5512j基因定位的f2群体构建路线。

图3、标记h2在w22背景的f2群体中的分离情况；其中5512j/5512j为纯合突变体；+／5512j为杂合体；+/+为纯合野生型。

图4、标记k6在w22背景的f2群体中的分离情况；其中5512j/5512j为纯合突变体；+／5512j为杂合体；+/+为纯合野生型。

图5、本发明中分子标记在玉米2号染色体短臂上的示意位置，其中cen2代表2号染色体着丝粒，tel代表端粒。

图6、是标记h2在不同自交系间的多态情况。

图7、是标记k6在不同自交系间的多态情况。

具体实施方式

下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆（molecularcloning:alaboratorymanual,3rded.）或植物分子生物学－实验手册（plantmolecularbiology－alaboratorymanual,melodys.clark编，springer-verlagberlinheidelberg,1997）中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一：两个共显性分子标记的获得

本发明通过经典的遗传定位获知5512j基因定位在玉米第2号染色体的短臂上。通过在5512j位点附近为纯合突变体和纯合野生型的植株构建的f2群体，提取纯合突变体、野生型以及f2群体各单株的基因组dna。通过筛选已有的ssr分子标记，获取有多态性的ssr类型分子标记（umc2032与bnlg1175），将5512j基因定位于分子标记umc2032与bnlg1175之间。然而这两个标记和5512j的连锁性并不十分紧密，在实际使用上仍有一定的问题。因此根据umc2032与bnlg1175之间已知的b73基因组序列（http://www.genome.arizona.edu/fpc/maize），设计引物。通过测序以及序列比对，获得纯合突变体与纯合野生型亲本间的序列差异，并通过所测序列开发标记，然后根据序列差异设计获得能够区分育种过程中杂交亲本（纯合突变体类型和纯合野生型类型）以及它们杂交子代（f1代）的特异性标记h2和k6。

扩增该基因左侧dna片段的第一对特异性引物h2的碱基序列为：

正向引物从5′端至3′端为：gcagagttggagacaagttcgg；

反向引物从5′端至3′端为：cacaagtaatgtttggggtaggc；

扩增该基因右侧dna片段的第二对特异性引物k6的碱基序列为：

正向引物从5′端至3′端为：gcaacgagtgagcgagatgag；

反向引物从5′端至3′端为：gccatgtcgctctggtatacg。

实施例二：分子标记h2与k6与5512j连锁关系的确定

分别抽提5512j/5512j与w22背景杂交后获得的f2群体中的籽粒dna用于分子标记h2与k6与5512j连锁关系的分析，野生型表型的基因型为+/+和+/5512j，5512j纯合突变体的基因型为5512j/5512j。以这些样本来分析分子标记h2与k6与5512j基因的遗传连锁关系（图3和4）。分析结果表明，这两个标记与5512j基因连锁，大群体分析表明，在w22背景的分离群体中，标记h2的交换率为3.0×10^-3，标记k6的交换率为4.0×10^-3。分子标记h2与k6与5512j基因在染色体上的物理位置关系参见图5。

实施例三：分子标记在不同亲本间的多态性鉴定

提取5512j/5512j和6种育种中广泛使用的自交系昌7-2、w22、w64a、b73、郑58、和bsss53的基因组dna，通过pcr反应分析在不同品种间的多态性。结果表明，使用本发明中的分子标记h2和分子标记k6可以区别5512j/5512j与其余所有自交系（图6和图7）。此结果证明，分子标记h2和分子标记k6能够在w22、w64a、b73、昌7-2和bsss53背景群体中准确检测到5512j基因的存在，辅助选择时的错选率为2.04×10^-7，可以满足选择要求。

<110>上海大学

<120>用于扩增检测玉米5512j基因的分子标记的特异性引物组及其应用

<160>4

<210>1

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<212>单链dna

<213>人工序列

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gcagagttggagacaagttcgg22

<210>2

<211>23

<212>单链dna

<213>人工序列

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cacaagtaatgtttggggtaggc23

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<212>单链dna

<213>人工序列

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gcaacgagtgagcgagatgag21

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<212>单链dna

<213>人工序列

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gccatgtcgctctggtatacg21