葡萄糖激酶在人重组FGF21蛋白活性检测中的应用的制作方法

本发明属于葡萄糖激酶应用技术领域，具体涉及一种葡萄糖激酶在人重组fgf21蛋白活性检测中的应用。

背景技术：

肥胖和2型糖尿病的新药研制一直是科研和开发领域的热点，其中具有代谢调控作用的生物活性蛋白类物质也是中国研发公司的开发重点。研究发现，成纤维细胞生长因子21(fgf21)重组蛋白可降低肥胖和2型糖尿病患者的血脂、减轻体重、降低血糖、显著减轻2型糖尿病及其并发症。在药物研发中，一个稳定高效的药物效果检测体系是评价候选药物优劣的关键，因此，建立一个客观评价fgf21重组蛋白治疗糖尿病效果的检测体系对于fgf21研发十分重要。

目前，脂肪细胞的葡萄糖摄取实验室测定普遍采用的fgf21重组蛋白活性检测方法，该方法通过在培养液中加入2-脱氧葡萄糖来测定，2-脱氧葡萄糖摄入细胞后被己糖激酶磷酸化为6-磷酸-2-脱氧葡萄糖，6-磷酸-2-脱氧葡萄糖不能进入后续代谢步骤，从而在细胞中聚集，直接成比例地反映细胞的葡萄糖摄入水平。该方法虽然可以检测fgf21活性，但是有以下不足之处：一是该方法使用放射性物质标记2-脱氧葡萄糖，对于实验防护和环境保护要求较高，而且该方法使用荧光检测方法测定6-磷酸-2-脱氧葡萄糖的水平，价格昂贵，不利于高通量筛选使用；二是2-脱氧葡萄糖摄取受到己糖激酶活性的影响，在酶活性发生变化时不能很好地反映葡萄糖摄取能力变化。因此，如果发明新的fgf21重组蛋白功能检测体系来弥补葡萄糖摄取实验的不足，并且能够做到更加简便、可靠，那这对于客观评价fgf21重组蛋白效果具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种葡萄糖激酶在人重组fgf21蛋白活性检测中的应用，为判断人重组fgf21蛋白活性提供了新的思路，解决了现有检测方法成本昂贵、对环境要求高的问题。

本发明所采用的技术方案是，葡萄糖激酶在人重组fgf21蛋白活性检测中的应用。

本发明的特征还在于，

葡萄糖激酶的基因表达水平与人重组fgf21蛋白的添加浓度的关系为：当人重组fgf21蛋白的添加浓度c≥4-6ng/ml时，葡萄糖激酶基因表达水平随人重组fgf21蛋白的添加浓度的增加而减少。

本发明的另一个技术方案是，用于判断人重组fgf21蛋白活性的葡萄糖激酶，葡萄糖激酶的引物序列为：

上游引物：5’-cacccaactgcgaaatcacc-3’；

下游引物：5’-catttgtggggtgtggagtc-3’。

本发明的特征还在于，

葡萄糖激酶的基因表达水平被人重组fgf21蛋白下调，且呈剂量依赖性下降。

葡萄糖激酶为脂肪细胞内的葡萄糖激酶。

本发明的有益效果是：本发明通过人重组fgf21蛋白处理脂肪细胞，采用定量反转录聚合酶链式反应(qrt-pcr)检测脂肪细胞的基因表达，从而确定脂肪细胞葡萄糖激酶表达水平可成为fgf21活性检测的新指标，操作过程简单，对环境的要求低，有很好的实用价值。

附图说明

图1是本发明细胞转变为成熟脂肪细胞的显微图片；

图2是本发明定量pcr观察葡萄糖激酶和beta-actin基因的扩增曲线图；

图3是本发明pcr产物的溶解曲线；

图4是本发明人重组fgf21对葡萄糖激酶基因表达的影响的柱状图；

图5是本发明人重组fgf21对葡萄糖激酶基因表达的量效关系图；

图6是本发明人重组fgf21受体抑制剂对fgf21作用的抑制效应的柱状图。

具体实施方式

本发明葡萄糖激酶在人重组fgf21蛋白活性检测中的应用，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

一、细胞培养和处理：小鼠前体脂肪细胞种植于12孔培养板中，在37℃孵箱培养，所用培养液为普通培养液即dmem培养液，其中加入体积分数10％的新生牛血清，每2天更换新鲜培养液；当细胞生长至接触抑制2天后，更换到诱导培养液，诱导培养液为dmem培养液，其中加入体积分数10％的新生牛血清、0.3iu/ml胰岛素、20μmol/l地塞米松和20μmol/l罗格列酮，处理2天后；更换到胰岛素培养液，胰岛素培养液为dmem培养液，其中加入体积分数为10％的新生牛血清和0.3iu/ml胰岛素，继续培养2天后；更换到普通培养液中继续培养，细胞经诱导后可见细胞内脂滴沉积，向脂肪细胞转化，每2天更换新鲜培养液，6天后细胞用于fgf21处理。如图1所示，细胞经诱导分化后全部出现脂滴沉积，转变为成熟的脂肪细胞。

在脂肪细胞培养液中分别加入不同浓度0ng/ml、1ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、1000ng/ml人重组fgf21蛋白，处理12小时后，脂肪细胞用于rna提取。

二、脂肪细胞的rna提取和反转录：将12孔板中的培养液去除干净，每孔加入350μl裂解液rl。用细胞研磨棒研磨裂解，再将所有溶液转移至过滤柱cs中12000rpm离心2min，收集滤液；向滤液中加入350μl70％乙醇，混匀并转入吸附柱cr3中12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入80μldnasei工作液，室温放置15min；向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室温静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；重复向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室温静置2min，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3置于室温放置5min以彻底晾干残余的漂洗液；将吸附柱cr3转入rnase-free离心管中，加入50μlrnase-freeddh2o，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到rna溶液。

酶标仪检测rna浓度与纯度，琼脂糖凝胶电泳检测rna质量。在八连管中依次加入2μl5xgdnaeraserbuffer，再分别加入1μlgdnaeraser，再分别加入1μgtotalrna，最后用rnasefreedh2o补足至10μl，混匀，室温反应5min。在各管中依次加入以下试剂，4μl5xprimescriptbuffer2，4μlrnasefreedh2o，1μlprimescriptrtenzymemixi，1μlrtprimermix，总反应体系为20μl，混匀。反应条件为37℃15min，85℃5s。反应完成后将cdna存于4℃备用，长期保存时转入-20℃。

三、葡萄糖激酶表达水平的检测：葡萄糖激酶基因表达水平采用定量pcr方法检测，以beta-actin基因的表达作为参考基因。在八连管中依次加入6μldh2o，2μl模板cdna，2μl葡萄糖激酶引物，10μlsybrpremixextaqii(2x)，总反应体系为20μl，混匀。

反应条件是：第一步是94℃、5min；第二步是94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min，循环以上顺序40次；第三步是进行加温溶解扩增产物，获得溶解曲线。

葡萄糖激酶引物序列是：

上游引物：5’-cacccaactgcgaaatcacc-3’；

下游引物：5’-catttgtggggtgtggagtc-3’。

beta-actin的引物序列是：

上游引物：5’-cgttggcatccacgaaacta-3’

下游引物：5’-ggtgctgggaggtacaggg-3’。

以beta-actin基因表达为参考，对实验结果进行表达水平分析。如图2所示，随着扩增次数的增加，葡萄糖激酶和beta-actin基因的拷贝数在一定扩增次数后呈指数增加，最后到达平台期，如图3所示，溶解曲线表现单峰，说明扩增产物的特异性强。如图4所示，人重组fgf21(美国peprotech公司产品，浓度100ng/ml)处理细胞12小时可显著降低脂肪细胞内葡萄糖激酶的表达(**表示统计学分析p<0.01，n＝6)。如图5所示，葡萄糖激酶表达随人重组fgf21(美国peprotech公司产品，处理细胞12小时)浓度的增加而减少，表现为良好的量效关系。如图6所示，设置4组实验，一组为对照组即空白组，二组加入人重组fgf21蛋白，三组加入人重组fgf21蛋白抑制剂azd4547，四组同时加入人重组fgf21蛋白和抑制剂azd4547，结果表明，人重组fgf21受体抑制剂azd4547(美国mce公司产品，浓度10nmol/l)处理后显著抑制fgf21对葡萄糖激酶表达的作用(**表示统计学分析p<0.01，n＝6)。

四、扩增特异性的鉴定：把定量pcr扩增产物进行dna测序，葡萄糖激酶的扩增序列如下：

“cacccaactgcgaaatcaccttcattgaatcagaggagggcagcggcaggggagccgcactggtctctgcggtggcctgcaagaaggcttgcatgctgggccagtgaaatccaggcaaggacagggacctgggttccacggggactccacaccccacaaatg”，扩增片段大小为162bp，与美国国家生物技术信息中心报道的葡萄糖激酶mrna(序号：xm006514443.3)的1563-1724碱基序列完全一致。

根据以上可知，葡萄糖激酶表达水平被人重组fgf21下调，且呈剂量依赖性下降，脂肪细胞葡萄糖激酶表达水平可成为fgf21活性检测的新指标。