筛选光肩星天牛引诱成分及制备光肩星天牛引诱剂的方法与流程

本发明涉及林业森林保护学技术领域。

背景技术：

现有技术确认，伴随着化学、生态及分子生物技术和研究方法的成熟，昆虫综合治理技术也发生了质的飞跃，这种飞跃体现在综合利用昆虫与寄主植物间、种间等的化学通讯基础，从而从生态学、化学及生物技术领域开展昆虫的防治措施研究，即利用寄主昆虫、寄主植物、天敌等均可以释放特定的具有吸引、拒避或不吸引寄主昆虫对寄主植物选择的挥发性化学物质来实现预防昆虫的目的。

光肩星天牛是一种蛀干类杂食性昆虫，但寄主植物对光肩星天牛的吸引作用、危害程度具有一定的差异性，在同一地点栽植不同寄主树种，存在只危害优势寄主树种，而不危害其他树种的情况。如糖槭作为优势寄主树种，当与榆树、白桦、杨树、柳树等树种在同一地点栽植时，对糖槭都危害非常严重，而对其他树种不危害或危害但不成灾。研究也证明，糖槭挥发物对光肩星天牛的引诱作用明显高于其他树种挥发物。

从现有研究技术来看，国内外相关光肩星天牛引诱剂的内容也比较多，主要从单纯的光肩星天牛性信息素成分提出性引诱剂的制作方法及现有其它的植物源引诱剂应用到光肩星天牛的防治中，以上方法均从单一方面的寄主植物或植食性昆虫角度提出，然而昆虫在实际的生存环境中，昆虫对寄主植物的定向选择，是对寄主植物释放的挥发物和昆虫自身释放的聚集信息素成分混合物的一种综合反映。同时，作为光肩星天牛寄主树种挥发物和聚集信息素成分较多，利用常用单一的嗅觉行为测试，很难筛选出高效的引诱活性成分。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术均从单一方面的寄主植物或植食性昆虫角度提出，很难筛选出高效的引诱活性成分的缺点，而提出一种筛选高效引诱成分及制备光肩星天牛引诱剂的方法。

一种筛选光肩星天牛引诱成分的方法包括以下步骤：

步骤一：提取及纯化光肩星天牛触角感器的总rna；

步骤二：获取光肩星天牛气味结合蛋白全长；

步骤三：构建光肩星天牛气味结合蛋白的原核表达载体；

步骤四：光肩星天牛重组气味结合蛋白的诱导及纯化；

步骤五：光肩星天牛引诱成分的筛选。

一种制备光肩星天牛引诱剂的方法的具体过程为：

将9种糖槭挥发物与8种光肩星天牛聚集信息素挥发物以体积比2:1混合后，按照体积比1:2溶于液体石蜡，制成光肩星天牛引诱剂；

所述9种糖槭挥发物顺-3-己烯醇、4-己烯，1-乙酸酯、十六烷酸甲酯、乙酸己酯、3-己烯，1-乙酸酯、4-己烯，1-丁酸酯、4-己烯，1-戊酸酯、2-二丙基-己二酸酯、邻苯二甲酸二异辛酯的质量百分比依次为：2.78：34.70：5.06：2.07：0.38：12.36：6.38：5.74：0.79；

所述8种光肩星天牛聚集信息素挥发物2-甲基-二十二烷、顺式-9-二十三烯、顺式-9-二十五烯、顺式-7-二十五烯、顺式-9-二十七烯、顺式-7-二十七烯、4-庚氧基-丁醛、4-庚氧基-正丁醇的体积比为：0.5：1：2：1：0.5：0.5：1:1。

本发明的有益效果为：

本发明在现有研究的基础上，选择从综合趋性行为和分子生物学手段筛选光肩星天牛优势寄主树种糖槭的挥发物和光肩星天牛聚集信息素中高效的引诱活性成分，通过诱捕试验从而确立引诱剂的最佳配方。对光肩星天牛具有引诱作用最强的配方为糖槭挥发物混合物：聚集信息素混合物＝2:1。

本发明的目的在于提供一种利用触角气味受体蛋白筛选光肩星天牛优势寄主树种糖槭挥发物和聚集信息素的高效引诱成分方法及利用高效的植物源引诱成分及聚集信息素成分制备光肩星天牛引诱剂的方法。其创新点在于利用具有引诱作用的光肩星天牛优势寄主树种特定比例的糖槭挥发物及光肩星天牛特定比例的聚集信息素中挥发物成分按不同比例混合，筛选出具有高效引诱作用的特定比例的高效引诱成分的引诱剂混合物。

附图说明

图1为触角总rna0.01琼脂糖凝胶电泳图；

图2为目标蛋白pet-32a(+)-agla-obp1电泳图；

图3为目标蛋白pet-32a(+)-agla-obp2电泳图；

图4为纯化后目标蛋白pet-32a(+)-agla-obp1电泳图；

图5为纯化后目标蛋白pet-32a(+)-agla-obp2电泳图；

图6为不同配比引诱剂配方对光肩星天牛的eag反应图；

图7为不同配比的引诱剂配方对光肩星天牛嗅觉趋性图；

图8为野外诱捕光肩星天牛防治效果。

具体实施方式

具体实施方式一：一种筛选光肩星天牛引诱成分的方法包括以下步骤：

步骤一：提取及纯化光肩星天牛触角感器的总rna；

步骤二：获取光肩星天牛气味结合蛋白全长；

步骤三：构建光肩星天牛气味结合蛋白的原核表达载体；

步骤四：光肩星天牛重组气味结合蛋白的诱导及纯化；

步骤五：光肩星天牛引诱成分的筛选及鉴定。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述步骤一中光肩星天牛触角感器的总rna的提取及纯化的具体过程为：

利用trizol试剂提取光肩星天牛触角总rna，利用非酶dna清除-a(dna-be-gone-a)清除总rna中残留的dna，并利用0.01琼脂糖凝胶电泳检测总rna完整性；利用smartivoligonucleotide和cdsⅲ/3′pcrprimer(引物)反转录，42℃繁育1h，生成cdna第一链。

其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：所述步骤二中获取光肩星天牛气味结合蛋白全长的具体过程为：

agla-obp1、agla-obp2的引物设计，

agla-obp1引物序列：

forward：5'-atgaaactttttgtattcgtcc-3'

reverse：5'-ttagggcaagaaataattcgag-3'

agla-obp2引物序列：

forward：5'-atgtcgctcagaatcgttatcg-3'

reverse：5'-ctataccaggaaccagttctcc-3'

光肩星天牛气味结合蛋白agla-obp1和agla-obp2cdna的扩增、克隆和测序。以反转录酶合成cdna第一链为模板，用引物对其进行pcr扩增；反应体系：pfu0.5μl，pfubuffer+mg²⁺(so4^2-)5.0μl，dntp4.0μl，cdna1.0μl，agla-obp1-forward1.0μl，agla-obp1-reverse1.0μl，ddh2o37.5μl；pcr扩增程序：95℃3min；95℃30s、62.1℃30s、72℃40s，35个循环；72℃10min；将pcr产物4℃保存，经琼脂糖凝胶电泳并割胶纯化，克隆于pmd18-tvector载体内，鉴定并送生物公司进行测序，从而获得目的基因序列。

其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：所述步骤三中构建光肩星天牛气味结合蛋白的原核表达载体的具体过程为：

光肩星天牛气味结合蛋白agla-obp1和agla-obp2属于气味结合蛋白minusc亚蛋白家族，含有6个保守的cys，形成3对二硫键。利用原核表达载体构建融合蛋白表达系统方法，对pet-32a(+)载体进行改造，去除载体自带的thrombin酶切位点；设计带有xhai和xhoi两个酶切位点的引物，利用桥式pcr的方法将含有thrombin的一段碱基去除，重新克隆出一段不含thrombin的载体序列。然后将从xbai-xhoi目的片段(不含thrombin)搭桥pcr扩增；对扩增的cdna片段使用xbai和xhoi对pet-32a(+)和cdna片段进行酶切，后与经过相同酶切处理的pet-32a(+)载体进行连接，转化宿主菌trans5α后，挑取单菌落、提质粒并进行酶切鉴定。

其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：所述光肩星天牛重组气味结合蛋白的诱导及纯化的具体过程为：

通过iptg诱导光肩星天牛重组气味结合蛋白表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化；

目的蛋白的原核表达：将构建好的pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2质粒转化进bl21(de3)感受态细胞，挑取单克隆或甘油菌接种至5ml含相应抗生素的lb培养液中，37℃，230r/min震荡培养过夜；取1ml过夜培养物接入50ml含适量相应抗生索的lb培养液中，37℃，摇床230r/min培养，3h后取培养物20ml转接至1l含适量相应抗生素的lb培养液中，37℃，摇床230r/min培养至od6000.6-0.8；在筛选出的诱导条件16℃，iptg浓度为0.5mm，诱导过夜，诱导表达靶蛋白；于4℃以6000r/min离心15min收集细胞，将湿菌体保存于-80℃继续后面的纯化；

目标蛋白pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2的纯化：将400ml诱导好的pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2菌体重悬于裂解液buffera中，buffera由ph7.0，40mmtris，300mmnaci，5％glycerol组成，按照菌液:buffera＝2l：50ml的比例溶解菌体；再加入psmf(100mm),50ml菌体溶液加入50μlpsmf，mgc12(1m)，5oml溶液加入50μlmgci2，和dnase(24mg/ml)，1l菌加入10μldnase混匀后高压破菌，压力为1200bar，直至菌液呈水滴状流出即可(3-4遍)，再于4℃，6000r/min，1h，取上清至平衡好的镍nta琼脂糖凝胶柱，并依次用不同咪唑梯度(0mm,10mm,50mm，100mm,250mm,500mm(100％bufferb)的溶液进行洗脱，共计七次，收集7管洗脱液后，每管各取10ul进行sds-page分析，检测目的蛋白的纯度；

收集含有纯pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2重组蛋白的洗脱液后，将其转移至透析袋中，在500ml含浓度递减尿素(初始浓度7mol/l)的pbs缓冲液(ph7.4)中，在4℃下透析72h，且每隔8h更换一次pbs缓冲液。

其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：所述步骤五中光肩星天牛引诱剂成分的筛选的具体过程为：

利用竞争性荧光结合方法获得光肩星天牛重组气味蛋白与糖槭挥发物及光肩星天牛聚集信息素挥发物的结合反应谱，筛选出高效引诱光肩星天牛的糖槭挥发物及聚集信息素成分，9种糖槭挥发物和光肩星天牛聚集信息素8种挥发物均能和光肩星天牛pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2产生结合反应。

其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：所述9种糖槭挥发物具体为：

顺-3-己烯醇(3-hexen-1-o1,(z))、4-己烯，1-乙酸酯(4-hexen-1-o1,acetate)、十六烷酸甲酯(methylpalmitate)、乙酸己酯(aceticacid,hexylester)、3-己烯，1-乙酸酯((z)-3-hexen-1-olacetate)、4-己烯，1-丁酸酯(butanoicacid,4-hexen-1-ylester)、4-己烯，1-戊酸酯(pentanoicacid,4-hexen-1-ylester)、2-二丙基-己二酸酯(hexanedioicacid,bis(2-methylpropyl)ester)、邻苯二甲酸二异辛酯(diisooctylphthalate)。

其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：所述8种挥发物发物具体为：

2-甲基-二十二烷(2-methyldocosane)、顺式-9-二十三烯((z)-9-tricosene)、顺式-9-二十五烯((z)-9-pentacosene)、顺式-7-二十五烯((z)-7-pentacosene)、顺式-9-二十七烯((z)-9-heptacosene)、顺式-7-二十七烯((z)-7-heptacosene)、4-庚氧基-丁醛(4-(heptyloxy)-butana)、4-庚氧基-正丁醇(4-(heptyloxy)-butan-1-ol)。

其它步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：一种制备光肩星天牛引诱剂的方法的具体过程为：

选择将相对荧光强度降低至50％以下，且结合常数在13-45umol/l的糖槭挥发物及光肩星天牛聚集信息素成分作为引诱剂的成分；通过不同比例的糖槭挥发物成分与聚集信息素成分的混合，通过gc-eag、室内嗅觉趋性测定及野外诱捕试验，确定最佳引诱剂配方。

按照筛选出的9种糖槭挥发物含量比例设定糖槭挥发物混合物、8种光肩星天牛聚集信息素挥发物含量比例设定聚集信息素混合物；以糖槭挥发物混合物：聚集信息素混合物＝1：5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5：1混合后1:2溶于液体石蜡，形成不同比例配方，以液体石蜡为作为对照(ck)，利用gc-eag筛选出对光肩星天牛具有引诱作用最强的配方糖槭挥发物混合物：聚集信息素混合物＝2:1。室内趋性测定：利用y型嗅觉仪以液体石蜡作为对照(ck)，测定引诱剂糖槭挥发物混合物：聚集信息素混合物＝1：5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5：1混合后1:2溶于液体石蜡对光肩星天牛的嗅觉趋性，结果显示，对光肩星天牛具有引诱作用最强的配方为糖槭挥发物混合物：聚集信息素混合物＝2:1。

采用以下实施例验证本发明的有益效果

实施例一：

筛选(高效)光肩星天牛引诱剂成分及制备光肩星天牛引诱剂的方法包括以下步骤：

1)光肩星天牛触角感器总rna的提取及纯化：

①供试光肩星天牛成虫采于哈尔滨市糖槭绿化树，与7月中旬至8月期间，现采现用，利用trizol试剂提取光肩星天牛触角总rna。

②利用非酶dna清除-a(dna-be-gone-a)清除总rna中残留的dna，并利用0.01琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，如图1所示。

③利用smartivoligonucleotide和cdsⅲ/3′pcrprimer反转录，42℃繁育1h，生成cdna第一链。

2)利用rt-pcr获得光肩星天牛气味结合蛋白的具体步骤。

①光肩星天牛气味结合蛋白agla-obp1、agla-obp2的引物设计。根据genbank中光肩星天牛气味结合蛋白agla-obp1、agla-obp2(2010，王伟)的基因序列，利用软件oligo7.0进行引物设计。

②agla-obp1引物序列:

forward：5'-atgaaactttttgtattcgtcc-3'.

reverse：5'-ttagggcaagaaataattcgag-3'.

③agla-obp2引物序列：

forward：5'-atgtcgctcagaatcgttatcg-3'.

reverse：5'-ctataccaggaaccagttctcc-3'.

④光肩星天牛气味结合蛋白agla-obp1和agla-obp2cdna的扩增、克隆和测序。以反转录酶合成cdna第一链为模板，用引物对其进行pcr扩增。反应体系：pfu0.5μl,pfubuffer+mg²⁺(so4^2-)5.0μl,dntp4.0μl,cdna1.0μl,agla-obp1-forward1.0μl,agla-obp1-reverse1.0μl,ddh2o37.5μl。pcr扩增程序：95℃3min；95℃30s、62.1℃30s、72℃40s，35个循环；72℃10min。

⑤将pcr产物4℃保存，经琼脂糖凝胶电泳并割胶纯化，克隆于pmd18-tvector载体内，鉴定并送生物公司进行测序，从而获得目的基因序列，如图1所示。

3)光肩星天牛气味结合蛋白原核表达载体的构建。

①二硫键的异源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达：光肩星天牛气味结合蛋白agla-obp1和agla-obp2属于气味结合蛋白minusc亚蛋白家族，含有6个保守的cys，形成3对二硫键。利用原核表达载体构建融合蛋白表达系统方法，对pet-32a(+)载体进行改造，去除载体自带的thrombin酶切位点。

②设计带有xhai和xhoi两个酶切位点的引物，利用桥式pcr的方法将含有thrombin的一段碱基去除，重新克隆出一段不含thrombin的载体序列。然后将从xbai-xhoi目的片段(不含thrombin)搭桥pcr扩增；对扩增的cdna片段使用xbai和xhoi对pet-32a(+)和cdna片段进行酶切，后与经过相同酶切处理的pet-32a(+)载体进行连接，转化宿主菌trans5α后，挑取单菌落、提质粒并进行酶切鉴定。

4)通过iptg诱导光肩星天牛重组气味结合蛋白表达，并通过镍琼脂糖凝胶亲和层析柱对其进行纯化。

①目的蛋白的原核表达：将构建好的pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2质粒转化进bl21(de3)感受态细胞，挑取单克隆或甘油菌接种至5ml含相应抗生素的lb培养液中，37℃,230r/min震荡培养过夜。取1ml过夜培养物接入50ml含适量相应抗生索的lb培养液中，37℃,摇床230r/min培养，3h后取培养物20ml转接至1l含适量相应抗生素的lb培养液中,37℃，摇床230r/min培养至od6000.6-0.8。在筛选出的最佳诱导条件16℃，iptg浓度为0.5mm，诱导过夜，诱导表达靶蛋白，如图2和图3所示。于4℃以6000r/min离心15min收集细胞，将湿菌体保存于-80℃继续后面的纯化。

②目标蛋白pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2的纯化：将400ml诱导好的pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2菌体重悬于裂解液buffera中，buffera由ph7.0,40mmtris，300mmnaci,5％glycerol组成，按照菌液:buffera＝2l：50ml的比例溶解菌体。再加入psmf(100mm),50ml菌体溶液加入50μlpsmf,mgc12(1m),5oml溶液加入50μlmgci2,和dnase(24mg/ml),1l菌加入10μldnase混匀后高压破菌，压力为1200bar，直至菌液呈水滴状流出即可(3-4遍)，再于4℃,16000r/min,1h,取上清至平衡好的镍nta琼脂糖凝胶柱，并依次用不同咪唑梯度的溶液进行洗脱，共计七次，收集7管洗脱液后，每管各取10ul进行sds-page分析，检测目的蛋白的纯度，其中1-7为收集管位置，如图4和图5所示。

③收集含有纯pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2重组蛋白的洗脱液后，将其转移至透析袋中，在500ml含浓度低减尿素(初始浓度7mol/l)的pbs缓冲液(ph7.4)中，在4℃下透析72h，且每隔8h更换一次pbs缓冲液。然后利用bradford法对透析好的融合蛋白测定浓度，转移至1.5mleppendorf微量离心管内，保存于-80℃冰箱备用。

5)利用竞争性荧光结合方法获得光肩星天牛重组气味蛋白与糖槭挥发物及光肩星天牛聚集信息素挥发物的结合反应谱，筛选出高效引诱光肩星天牛的糖槭挥发物及聚集信息素成分。

①将荧光配基1-npn溶于甲醇中，配制成1mmol/l的溶液，4℃条件下避光保存，取1.5μmol/lpet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2置于1cm四通的荧光比色皿中，向比色皿中逐次加入1mmol/l的1-npn溶液进行荧光扫描，每次加入后反应2min，在282波长下激发，记录荧光发射光谱，及最大发射波长328nm处的荧光强度根据scatchard方程(1)线性化光谱数据：

其中dt和d分别表示总的和体系中游离的1-npn浓度，pt为pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2重组蛋白的浓度，k为1-npn与pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2的结合常数，n为结合位点数。可得到1-npn与agla-obp1/agla-obp2的解离常数。

其中ic50为竞争配基能替换50％的1-npn时的浓度，1-npn为未结合1-npn的浓度，k1-npn为pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2与1-npn的解离常数。

②选取不同糖槭叶片气味挥发物及光肩星天牛聚集信息素挥发物进行竞争性荧光结合试验，对利用gcsm鉴定出的26种糖槭挥发物，筛选出9种糖槭挥发物和光肩星天牛聚集信息素8种挥发物均能和光肩星天牛pet-32a(+)-agla-obp1和pet-32a(+)-agla-obp2产生结合反应，具体结果如1、表2。

表1糖槭挥发物配基与1-npn和重组pet-32a(+)-agla-obp1、pet-32a(+)-agla-obp2(a1/a2)蛋白的竞争结合

表2光肩星天牛聚集信息素配基与1-npn和重组pet-32a(+)-agla-obp1、pet-32a(+)-agla-obp2(a1/a2)蛋白的竞争结合

6)光肩星天牛引诱剂配方的提出：

①gc-eag筛选最佳配方：按照上述筛选出的高效的9种糖槭挥发物含量比例设定糖槭挥发物混合物、8种光肩星天牛聚集信息素挥发物含量比例设定聚集信息素混合物；而后以糖槭挥发物混合物：聚集信息素混合物＝1：5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5：1混合后1:2溶于液体石蜡，形成不同比例配方，以液体石蜡为作为对照(ck)，利用gc-eag筛选出对光肩星天牛具有引诱作用最强的配方糖槭挥发物混合物：聚集信息素混合物＝2:1，如图6。

②室内趋性测定：利用y型嗅觉仪以液体石蜡作为对照(ck)，测定引诱剂糖槭挥发物混合物：聚集信息素混合物＝1：5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5：1混合后1:2溶于液体石蜡对光肩星天牛的嗅觉趋性，结果显示，对光肩星天牛具有引诱作用最强的配方为糖槭挥发物混合物：聚集信息素混合物＝2:1，如图7所示。

7)野外诱捕试验：利用上述所得到的的引诱剂配方，采用实用新型专利cn201620147068.7中诱捕器及诱捕方法，于2016年7月下旬于9月上旬进行野外诱捕光肩星天牛，分别调查对照区(ck)和诱捕区(yb)30株糖槭树上光肩星天牛成虫数量，对照区共计11头，而诱捕区共计189头，平均单株虫口数降低了5.93头，说明本发明所获得的引诱剂配方对光肩星天牛的防治效果明显，如图8所示。与现有单纯的以性信息素及植物挥发物作为光肩星天牛引诱剂比较，具有明显的引诱效果。

本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，本领域技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。