检测松墨天牛是否携带松材线虫的引物组、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及松墨天牛携带松材线虫的检测，尤其涉及检测松墨天牛携带松材线虫的lamp引物组和试剂盒，本发明还涉及所述lamp引物组和试剂盒在检测松墨天牛携带松材线虫中的应用，属于松墨天牛携带松材线虫的分子检测领域。

背景技术：

松材线虫病(pinewiltdisease)，又被称为松树萎蔫病、枯萎病，该病由松材线虫[bursaphelenchusxylophilus(steiner&buhrer)nickle]引起，主要通过墨天牛属(monochamus)昆虫在松树上取食和产卵进行自然传播以及病木、病木加工木的运输进行长距离传播。林区内松材线虫的传播主要靠松墨天牛，可为害包括松属(pinusspp.)、落叶松属(larixspp.)、云杉属(piceaspp.)、黄杉属(pseudotsugaspp.)、冷杉属(abiesspp.)和雪松属(cedrusspp.)的36种松属植物和8种非松属植物，其中松属植物是最主要的寄主。由于其危害极其严重而目前又缺乏有效的防治方法，被多个国家列为头号检疫对象。

形态学是线虫种类常规鉴定的标准方法，松材线虫的鉴定主要依靠成虫的形态特征。但是，通过形态学准确鉴定松材线虫成虫对于非专业人员相当困难，且无法对幼虫进行准确鉴定。由于形态学的限制，免疫学、生理生化和分子生物学方法被应用到松材线虫的鉴定上。

松墨天牛是松材线虫病最重要的传播媒介，携带的是松材线虫幼虫，且携带的线虫有多种，难以根据形态学特征来区分和鉴定松材线虫幼虫。准确诊断松墨天牛携带的松材线虫是监测松材线虫病发生蔓延过程中急需解决的难题。分子生物学技术的引入，克服了形态学的一些限制，实现快速鉴定。松墨天牛携带的松材线虫分子检测技术的开发，对于及时发现早期疫点，有效的将松材线虫病控制在一定的范围内，缩小松材线虫病的发生，降低防治成本，具有重要的意义；同时为松材线虫病的总体预警与控制策略提供依据。

目前，松材线虫的检测与鉴定主要以分子生物学的方法为主。其中，dna探针技术虽能有效地鉴定松材线虫，但费用较高，具有放射性；rapd技术分析松材线虫与近似种的关系，结果重复性较差；rflp技术区分松材线虫和拟松材线虫，内切酶价格昂贵、耗时；荧光pcr灵敏、快速，但较昂贵；pcr技术操作简便、花费较少，但所需时间也较长。

环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，简称lamp)是2000年日本荣研化学株式会的notomit等开发的一种新的核酸扩增方法，该方法针对靶基因的6个区域设计了2对特异的引物，引物在链置换dna聚合酶(bstdnapolymerase)的作用下在恒温条件(65℃左右)下保温几十分钟，因其独特的反转设计，对自身进行链置换无限扩增；整个反应过程1个小时内即可完成，其间不需要模板的热变性、退火、温度循环等过程，扩增具有高特异性、等温快速的特点。因此，相较以上几种分子检测技术，lamp扩增不需要昂贵的仪器和试剂，更利于在一些基层机构的应用。

syg-2基因是编码多功能细胞粘附因子的基因。syg-1和syg-2存在于所有动物类群中，从突触的形成到过滤防御屏障的建立，参与多种主要的生理功能。因此，以松材线虫的syg-2基因为靶标设计特异性引物，对松墨天牛携带的松材线虫进行lamp快速扩增，对于松材线虫的快速鉴定及有效防控具有重要意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的第一个技术问题是提供用于检测松墨天牛是否携带松材线虫的lamp引物组；

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种检测松墨天牛是否携带松材线虫的lamp试剂盒；

本发明所要解决的第三个技术问题是建立一种松墨天牛携带松材线虫的lamp检测方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了用于检测松墨天牛携带松材线虫的lamp引物组，所述lamp引物组选自以下2组引物中的任意一组：

引物组(1)：包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；所述外引物对由核苷酸序列为seqidno.1所示上游外引物和seqidno.2所示下游外引物组成；所述内引物对由核苷酸序列为seqidno.3所示上游内引物和seqidno.4所示下游内引物组成；所述环引物对由核苷酸序列为seqidno.5所示上游环引物和seqidno.6所示下游环引物组成；

引物组(2)：包括一对外引物和一对内引物；所述外引物对由核苷酸序列为seqidno.1所示上游外引物和seqidno.2所示下游外引物组成；所述内引物对由核苷酸序列为seqidno.3所示上游内引物和seqidno.4所示下游内引物组成。

本发明经ncbi比对松材线虫和拟松材线虫的syg-2基因片段，发现该段基因在松材线虫种内保守，与拟松材线虫种间差异极其大。本发明以松材线虫的syg-2基因为靶基因，设计了16组lamp引物。上述16组lamp引物对松材线虫bx和拟松材线虫bm的检测结果证明，4号引物组加环引物或者不加环引物均能扩增出松材线虫，都不会扩增出拟松材线虫，对松材线虫检测的特异性好。其中，4号引物组加环引物(即本发明所述引物组(1))检测松材线虫bx的出峰时间为20-25min；4号引物组不加环引物(即本发明所述引物组(2))检测松材线虫bx的出峰时间为30-35min。因此，与不加环引物相比，4号引物组加环引物的扩增效率更优。而本发明所设计的1号、10号、13号和15号引物组加/不加环引物都能扩增出拟松材线虫和松材线虫，对松材线虫检测的特异性差；3号和5号引物组在加环引物的情况下，可扩增出拟松材线虫和松材线虫，而不加环引物，均扩增不出松材线虫和拟松材线虫；8号和16号引物组在加环引物的情况下，也能够扩增出拟松材线虫；另外的7组引物(即：2号、6号、7号、9号、11号、12号和14号引物组)加或不加环引物均不能扩增出松材线虫。

因此，本发明用于检测松墨天牛携带松材线虫的lamp引物组优选为4号引物组加环引物，即引物组(1)：包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；所述外引物对由核苷酸序列为seqidno.1所示上游外引物和seqidno.2所示下游外引物组成；所述内引物对由核苷酸序列为seqidno.3所示上游内引物和seqidno.4所示下游内引物组成；所述环引物对由核苷酸序列为seqidno.5所示上游环引物和seqidno.6所示下游环引物组成。

本发明所述的lamp引物组能够应用于检测松墨天牛携带的松材线虫。

本发明进一步公开了一种松墨天牛携带松材线虫的lamp检测试剂盒，包括：lamp引物组，2×rm(包括：tris-hcl，kcl，mgso4，(nh4)so4，tween20，betaine，dntps)，sybrgreenⅰ，bstdna聚合酶和ddh2o；其中，所述lamp引物组选自本发明所述的lamp引物组，即4号引物组加环引物或者不加环引物；优选为4号引物组加环引物。

本发明所述的lamp检测试剂盒能够应用于检测松墨天牛携带的松材线虫。

本发明还公开了一种松墨天牛携带松材线虫的lamp检测方法，包括：(1)提取待测松墨天牛的dna；(2)以提取的dna为模板，以本发明所述的lamp引物组(即4号引物组加环引物或者不加环引物)为扩增引物，建立lamp反应体系并置于实时荧光pcr仪中进行pcr反应；(3)对反应结果进行判定：①收集荧光信号，如果出现“s”型扩增曲线，则判定为阳性(有核酸扩增，即待测松墨天牛携带松材线虫)；如果无“s”型扩增曲线，则判定为阴性(无核酸扩增，即待测松墨天牛不携带松材线虫)；或者，②将pcr反应产物灭活，加入显色液混匀；如果呈现绿色，则判定为阳性(有核酸扩增，即待测松墨天牛携带松材线虫)；如果呈现橙色，则判定为阴性(无核酸扩增，即待测松墨天牛不携带松材线虫)。

其中，当所述lamp引物组为4号引物组加环引物时，所述lamp反应体系包括：反应体系的总体积为25μl；其中，2×rm12.5μl(包括：ph8.8的tris-hcl40mm，kcl20mm，mgso416mm，(nh4)so420mm，tween200.2％，betaine1.6m，dntps(2.8mm每种))，sybrgreeni0.5μl，40μm的上游内引物1μl，40μm的下游内引物1μl，10μm的上游外引物0.5μl，10μm的下游外引物0.5μl，20μm的上游环引物0.5μl，20μm的下游环引物0.5μl，8u/μl的bstdna聚合酶1μl，dna模板1μl，余量为ddh2o。或者，当所述lamp引物组为4号引物组不加环引物时，lamp反应体系包括：反应体系的总体积为25μl；其中，2×rm12.5μl，sybrgreeni0.5μl，40μm的上游内引物1μl，40μm的下游内引物1μl，10μm的上游外引物0.5μl，10μm的下游外引物0.5μl，8u/μl的bstdna聚合酶1μl，dna模板1μl，余量为ddh2o。

本发明所述lamp检测方法中，所述pcr反应的程序包括：63℃15s，63℃45s作为一个循环；于63℃45s处收集荧光信号。所述灭活是85℃灭活3min。

应用本发明所述的松墨天牛携带松材线虫的lamp检测方法，对江苏南京采集的2批松墨天牛进行检测，结果松材线虫的检出率分别为28.60％和43.75％。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明以松材线虫的syg-2基因为靶标设计lamp引物，并筛选获得能够区分松材线虫和拟松材线虫的特异性lamp引物组。本发明利用所筛选的特异性lamp引物组建立了一种松墨天牛携带松材线虫的lamp检测方法，能够对松墨天牛携带的松材线虫进行快速、准确的检测，特异性高，操作简便、耗时短，成本低。本发明方法对于监控松材线虫病的发生与蔓延，降低防治成本等具有重要的意义，同时也为松材线虫病的总体预警与控制策略提供依据。

附图说明

图1为1号、4号和15号引物组不加环引物，对松材线虫bx和拟松材线虫bm的检测结果；

图2为8号和16号引物组不加环引物，对松材线虫bx的检测结果；

图3为8号和16号引物组不加环引物，对天牛检测的结果；其中，nj1代表从江苏南京采集的天牛携带松材线虫(6月21日批)；nj2代表从江苏南京采集的天牛携带松材线虫(6月24日批)；

图4为10号和13号引物组不加环引物，对松材线虫bx和拟松材线虫bm的检测结果；

图5为1号、8号、13号和15号引物组加环引物，对松材线虫bx和拟松材线虫bm的检测结果；

图6为3号引物组加环引物，对松材线虫bx和拟松材线虫bm的检测结果；

图7为4号引物组加环引物，对松材线虫bx和天牛的检测结果；其中，nj1代表从江苏南京采集的天牛携带松材线虫(6月21日批)；nj2代表从江苏南京采集的天牛携带松材线虫(6月24日批)；sd-1代表从山东采集的松材线虫；js代表从江苏采集的松材线虫；jst-10代表从江苏采集的松材线虫；js和jst-10代表不同的株系；

图8为5号和16号引物组加环引物，对松材线虫bx和拟松材线虫bm的检测结果；

图9为10号引物组加环引物，对松材线虫bx和拟松材线虫bm的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1松墨天牛携带松材线虫的lamp快速检测方法的建立

1、材料与方法

1.1松墨天牛dna的提取

取松墨天牛成虫头部及胸部组织0.2g放入2mlep管中，放入钢珠研磨仪研磨5min(60hz)；加入600μl3m异硫氰酸胍提取缓冲液，室温裂解1h，期间颠倒混匀；加入600μltris-酚氯仿异戊醇(25:24:1)，12000r/min离心10min；吸取上清液，加入600μl氯仿异戊醇(24:1)，12000r/min离心10min；吸取上清液，加入600μl异丙醇-20℃沉淀20min，12000r/min离心10min；弃上清，70％乙醇清洗沉淀2次，每次12000r/min离心3min；吸干乙醇彻底干燥后，用60μlbufferte溶解dna，备用。

1.2lamp引物设计

经ncbi比对松材线虫和拟松材线虫的syg-2基因片段，发现该段基因在松材线虫种内保守，与拟松材线虫种间差异极其大。因此，syg-2可以作为松材线虫lamp检测的新靶基因。

以syg-2基因为靶基因，通过荣研公司的lamp引物在线设计软件http://primerexplorer.jp/e/进行了lamp引物设计。所设计的lamp引物组见表1。

表1以syg-2为靶基因设计的lamp引物

1.3lamp反应

lamp反应方法参照loopampdna扩增试剂盒(eikenchemical)，按下表反应液配比构建25μl的lamp反应体系(表2)。

表2lamp反应体系

上述试剂混匀后，加入20μl密封液，混匀离心，盖紧管盖。

1.4lamp反应结果检测

1.4.1实时荧光法

将反应管放入实时荧光pcr仪，反应程序为63℃15s，63℃45s作为一个循环，于63℃45s处收集荧光信号，若有“s”型扩增曲线，则判断为阳性(有核酸扩增)，若无“s”型扩增曲线，则判断为阴性(无核酸扩增)。

1.4.2染色法

从实时荧光pcr仪中拿出反应管，85℃灭活3min，然后将1μl显色液滴在pcr管盖中间，盖紧管盖。颠倒反应管数次，使反应混合液与显色液充分混匀，观察反应液颜色。若呈现绿色则为阳性(有核酸扩增)，呈现橙色则为阴性(无核酸扩增)。

2、结果与分析

2.1lamp引物对松材线虫bx和拟松材线虫bm的检测结果

以syg-2为靶基因设计的lamp引物，对松材线虫bx和拟松材线虫bm的检测结果见表3。

表3lamp引物对松材线虫bx和拟松材线虫bm的检测结果

本发明所设计的16组引物，其中9组引物对松材线虫bx和拟松材线虫bm进行lamp检测，结果为：

1号、10号、13号和15号引物组加/不加环引物都能扩增出拟松材线虫；

3号和5号引物组在加环引物的情况下，可扩增出拟松材线虫，而不加环引物，扩增不出松材线虫和拟松材线虫；

8号、16号引物组在加环引物的情况下，可扩增出拟松材线虫，而不加环引物，扩增不出拟松材线虫；

4号引物组加/不加环引物都不能扩增出拟松材线虫。

具体的，1号、4号和15号引物组不加环引物，对松材线虫bx和拟松材线虫bm的检测结果(实时荧光扩增曲线)见图1；

8号和16号引物组不加环引物，对松材线虫bx的检测结果见图2；8号和16号引物组不加环引物，对天牛的检测结果见图3；

10号和13号引物组不加环引物，对松材线虫bx和拟松材线虫bm的检测结果见图4；

1号、8号、13号和15号引物组加环引物，对松材线虫bx和拟松材线虫bm的检测结果见图5；

3号引物组加环引物，对松材线虫bx和拟松材线虫bm的检测结果见图6；

4号引物组加环引物，对松材线虫bx和天牛的检测结果见图7；

5号和16号引物组加环引物，对松材线虫bx和拟松材线虫bm的检测结果见图8；

10号引物组加环引物，对松材线虫bx和拟松材线虫bm的检测结果见图9。

采用另外7组引物(即：2号、6号、7号、9号、11号、12号和14号引物组)对松材线虫bx和拟松材线虫bm进行lamp检测，结果发现，这7组引物无论加环引物或不加环引物都不能扩增出松材线虫。因此，这7组引物显然不能用于检测松材线虫。

2.2携带松材线虫的松墨天牛检出率

应用本发明所述的4号引物组加环引物或不加环引物，分别对2批松墨天牛进行检测，结果松墨天牛中松材线虫的检出率分别为28.60％和43.75％(表4)。

表4松墨天牛中松材线虫的检出率

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<110>中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所

<120>检测松墨天牛是否携带松材线虫的引物组、试剂盒及其应用

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