一种全人源抗补体因子H的抗体的制作方法

本发明公开一种全人源抗补体因子h的抗体以及该抗体制备治疗补体相关病症药物中的应用。

背景技术：

补体系统是构成人体免疫系统的重要组成部分，补体不仅参与生理性的免疫防御过程，而且可以导致免疫病理性的损伤，补体系统的过度活化，将直接或间接地引起自身器官和组织的损伤，进而导致炎症反应。越来越多的研究发现，持续的感染或慢性炎症刺激可能导致肿瘤的发生发展。目前已经有研究证实补体系统与肿瘤的发生有相关关系(markiewskimm，etal,2008,9(11):1225-1235)。

补体系统的激活有3条途径：经典途径、mbl途径及旁路途径。虽然3条途径的启动激活物不同，但其共有步骤为将中心产物c3转化成其活化形式c3b。补体调节的初始就是补体级联的酶对c3的切割将硫酯暴露于亲核攻击，容许c3b经由硫酯结构域共价附着到抗原表面上。此切割消除了c3进一步扩大c3b沉积和活化补体级联晚期成分(包括能够指导膜破坏的膜攻击复合物)的能力。然而，巨噬细胞吞噬细胞受体优先识别c3b及其片段；由于酯键形成的通用性，c3介导的调节对于病原体识别是重要的(holers，etal,13，231-236(1992))，因此各种c3降解产物c3b的受体在宿主免疫应答中发挥重要作用。

cfh是补体系统旁路激活途径的关键抑制因子，在炎症及疾病的发生中发挥重要作用。已有大量研究表明cfh与多种肿瘤疾病的发病有密切关系。wilczed等的研究发现在结直肠癌患者及继发于结直肠癌的转移性肝癌患者中呈现高表达的状态，提示与结直肠癌的发病机理密切相关(wilczed，etal,2008,122(9):2030-2037)。在junnikkalal的实验中发现在卵巢癌患者的腹水和卵巢癌细胞中表达水平明显升高，还发现卵巢癌细胞可以分泌，提示在卵巢癌的发病过程中起重要作用(junnikkalal,etal,2002,87(10):1119-1127)。而目前关于cfh的研究多集中在与cfh密切相关的amd和冠心病方面。

cfh是一种具有多结构域和多功能的蛋白质，在补体活化早期阶段起重要的调节作用，通过抑制转换酶的生成发挥作用：一方面在c3b降解过程中可以作为i因子的辅助因子介导c3b降解而失活；另一方面可以通过与b因子竞争结合cfh减少c3转化酶的生成，同时加速已形成的c3转化酶的衰变。同时cfh还在先天免疫中发挥重要的作用，即它能辨别自体和异己；还具有区分细胞表面是否激活，在细胞粘附方面起重要作用。

补体活化的大多数调节物在cfh(补体转化酶的中心成分)水平起作用。补体活化的这些天然调节物分子通常大于100kda，而且难以开发成治疗性试剂。因此，需要开发cfh抗体治疗剂，主要通过阻断cfh来预防和治疗补体相关病症。

技术实现要素：

本发明关注cfh特异性的单克隆抗体及其在治疗补体相关病症中的用途，本发明的单克隆抗体结合人cfh的c末端结构域(scr)，本发明的单克隆抗体能够增加补体c3b沉积在细胞表面，从而促进补体介导的细胞毒性作用(cdc)。

本发明的cfh特异性单克隆抗体的重链可变区具有seqidno：1所示的氨基酸序列，单克隆抗体的轻链可变区具有seqidno：5所示的氨基酸序列；单克隆抗体的重链可变区的互补决定区cdr具有如下的氨基酸序列：seqidno：2所示的cdr1、seqidno：3所示的cdr2、seqidno：4所示的cdr3；其轻链可变区的互补决定区具有如下的氨基酸序列：seqidno：6所示的cdr1、seqidno：7所示的cdr2、seqidno：8所示的cdr3。

另一方面，本发明的单克隆抗体选择性结合多种哺乳动物物种(人类和选自除人类外的灵长类、小鼠、大鼠、猪、马及兔等)的cfh。所述抗体或抗原结合片段可为非补体激活同种型或亚类。

本发明的单克隆抗体还包括将上述抗体的氨基酸序列通过对氨基酸残基的添加、删除、修改形成所得到的包括人源与非人源抗体，并具有与cfh抗体相同功能或改造及优化的一切抗体。

本发明还提供了编码前面所述的单克隆抗体或其抗原结合分子的核酸分子。

本领域技术人员将意识到这些核酸分子的功能变体也是本发明的一部分。功能变体是这样的核酸序列，通过使用标准遗传密码可以将其直接翻译以提供与从亲代核酸分子中翻译的序列相同的氨基酸序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的核酸分子(或其片段，或其衍生物)的核酸序列。然后可将该核酸序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的核酸分子的序列中。

本发明还提供了一种包括前面所述的核酸分子的载体。所述载体包括克隆载体或者表达载体。

本发明还提供了一种含有前面所述的核酸分子或前面所述的载体的宿主细胞。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞：真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho,cos,293细胞、或bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

在本发明的具体实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，更优选293细胞。

在另一方面，本发明所述单克隆抗体与抗原的结合域是scr19区(seqidno：9)的8个特定氨基酸pidngdit(seqidno：10)。

本发明所述单克隆抗体的结合抗原包括包含pidngdit序列的任何多肽，不限于本发明使用的scr19区。

在另一方面，本发明所述单克隆抗体包含如下抗原结合位点，该抗原结合位点包含与cfh接触的cfh抗体残基。

在具体实施方案中，所述单克隆抗体是全人源化抗体。所述抗体片段可以例如选自下组：fab、fab′、f(ab′)2、scfv、(scfv)2、dab、互补决定区(cdr)片段、线性抗体、单链抗体分子、微型抗体(minibody)、双抗体、和自抗体片段形成的多特异性抗体。

在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含与药学可接受的载体混和的本发明的cfh抑制剂，诸如cfh抗体。

进一步，所述产品包括试剂盒，所述试剂盒包含容器和说明书，所述容器中装有本发明的cfh抗体或包含抗体的药物组合物，所述说明书指示如何施用所述抗体或药物组合物来治疗补体相关病症。

本发明还提供了前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗补体相关病症的药物中的应用。

进一步，所述补体相关病症可以是选自下述中的任意一种：包括炎性和自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)(ra)、急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratorydistresssyndrome)(ards)、缺血和再灌注后的远距离组织损伤(remotetissueinjuryafterischemiaandreperfusion)、心肺旁路手术期间的补体活化(complementactivationduringcardiopulmonarybypasssurgery)、皮肌炎(dermatomyositis)、天疱疮(pemphigus)、狼疮肾炎及所致肾小球肾炎和血管炎(lupusnephritisandresultantglomerulonephritisandvasculitis)、心肺旁路(cardiopulmonarybypass)、心脏停搏诱发的冠状内皮功能障碍(cardioplegia-inducedcoronaryendothelialdysfunction)、ii型膜性增生性肾小球肾炎(typeiimembranoproliferativeglomerulonephritis)、iga肾病(iganephropathy)、急性肾衰竭(acuterenalfailure)、冷球蛋白血症(cryoglobulemia)、抗磷脂综合征(antiphospholipidsyndrome)、黄斑变性性疾病(maculardegenerativediseases)诸如年龄相关黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration)(amd)、脉络膜新血管形成(choroidalneovascularization)(cnv)、葡萄膜炎(uveitis)、糖尿病性和其它缺血相关视网膜病变(diabeticandotherischemia-relatedretinopathies)、眼内炎(endophthalmitis)、和其它眼内新血管疾病(otherintraocularneovasculardiseases)诸如糖尿病性黄斑水肿(diabeticmacularedema)、病理性近视(pathologicalmyopia)、vonhippel-lindau病、眼的组织胞浆菌病(histoplasmosisoftheeye)、视网膜中央静脉阻塞(centralretinalveinocclusion)(crvo)、角膜新血管形成(cornealneovascularization)、视网膜新血管形成(retinalneovascularization)、以及同种异基因移植(allotransplantation)、超急性排斥反应(hyperacuterejection)、血液透析(hemodialysis)、慢性阻塞性肺病综合征(chronicocclusivepulmonarydistresssyndrome)(copd)、哮喘(asthma)、和吸入性肺炎(aspirationpneumonia)。在一个具体的实施方案中，所述补体相关病症是补体相关眼疾(complement-associatedeyecondition)，诸如年龄相关黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration)(amd)或脉络膜新血管形成(choroidalneovascularization)(cnv)；还包肿瘤或癌症，所述包括但不限于包括肾上腺皮质癌，肛门癌，膀胱癌，脑肿瘤，乳腺癌，类癌肿瘤，胃肠道未知原发癌，子宫颈癌，结肠癌，子宫内膜癌，食管癌，肝外胆管癌症，ewings家庭肿瘤，颅外生殖细胞肿瘤，眼内黑色素瘤眼癌，胆囊癌，胃癌，外生殖细胞肿瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，头颈癌，下咽癌，胰岛细胞癌，肾癌，喉癌，口腔癌，肝癌，肺癌，艾滋病相关淋巴瘤，中枢神经系统淋巴瘤，皮肤t细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，恶性间皮瘤，黑色素瘤，梅克尔细胞癌，多发性骨髓瘤、浆细胞瘤，鼻咽癌，成骨细胞瘤，口咽癌，骨肉瘤，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞肿瘤，胰腺癌，外分泌，胰腺癌，鼻旁窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，垂体癌，前列腺癌，横纹肌肉瘤，直肠癌，过渡细胞肾盂和尿道癌，唾液腺癌，sezary综合征，皮肤癌，小肠癌，软组织肉瘤，睾丸癌，恶性胸腺瘤，甲状腺癌，尿道癌，子宫癌，不寻常的儿童癌症，阴道癌，vulvar癌症和wilms′瘤。

在另一个方面，本发明涉及检测cfh的产品，所述产品包括前面所述的单克隆抗体。

本发明提供了前面所述的单克隆抗体在制备检测cfh的产品中的应用。

进一步，所述产品包括试剂盒、芯片或试纸。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

本发明其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示利用sds-page鉴定表达纯化后的trn1004抗体的图；

图2显示抗体trn1004结合位点验证的结果图；

图3显示利用biacore检测trn1004抗体的亲和活性的图。

具体实施方式

本发明从有自身抗体的病人单个b细胞中分离获得高亲和力全人源单克隆抗体。本发明探索了抗肿瘤活性的机制并证明了抗体在体外杀死肿瘤细胞和在体内抑制肿瘤细胞生长的作用。

分离的抗体或抗体片段可以是人源化的。

分离的抗体或抗体片段可以包含选自以下的重链免疫球蛋白恒定结构域：人igm恒定结构域，人igg4恒定结构域，人igg1恒定结构域，人ige恒定结构域，人igg2恒定结构域，人igg3恒定结构域和人iga恒定结构域。

本发明分离的抗体或抗体片段可能选自人抗体，免疫球蛋白分子，二硫键连接的fv，单克隆抗体，scfv，嵌合体抗体，单结构域抗体，cdr移植抗体，双抗体，人源化抗体，多特异性抗体，fab，双特异性抗体，dvd，tvd，fab′，双特异性抗体，f(ab′)2和fv。

本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。可变性集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(cdr)或超变区中的三个片段中。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个fr区(可变区中较保守的部分)，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个cdr相连，可形成部分β折叠结构。每条链中的cdr通过fr区紧密地靠在一起并与另一链的cdr一起形成了抗体的抗原结合部位。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1全人源的单克隆的cfh抗体trn1004的制备

1.pbmc分离和单个记忆性b细胞分选

用亲和素标记cfh15-mer多肽(seqidno：9)作为钓饵，利用流式分选仪从合并的外周血单个核细胞(pbmc，采自表达cfh自身抗体的病人)中分选到了单个记忆b细胞，通过荧光-荧光标记分选cd20+/cd27all/cfh-抗原结合记忆b细胞。为了使假阳性最小化，用alexa标记链霉抗生物素蛋白fluor647和brilliantviolet421。每个荧光团用链霉亲和素进行标记在单独的等分试样上，然后将其混合在一起然后与生物素化的抗原肽相互作用。显示升高荧光的两种荧光团细胞分选到单一96孔板的孔中。

2.vhdjh和vl基因的分离

通过rt/pcr从流式分选的人cfh抗原特异性记忆b细胞扩增mab的vhdjh和vljl基因区段对，并使用前述方法(liaoetal.，2013)测序。使用软件程序cloanalyst(http://www.bu.edu/computationalimmunology/research/software/)推断个体抗体的vhdjh和vljl基因区段的遗传信息，包括基因区段家族使用，体细胞突变频率，cdr3长度和克隆谱系关系。

3.生产纯化的重组抗体

合成选择的cfh抗体的vhdjh和vljl基因并分别克隆到含有人igg1重链恒定区的修饰的pcdna3.1质粒中。用转染试剂polyfect共转染293细胞，具体操作参见说明书。转染后6-8小时换新鲜培养基，并在37℃5％co2培养箱中培养72小时，收集细胞上清进行检测。

4.重组抗体的筛选检测

(1)纯化scr19(cfh15-mer多肽)

巴斯德毕赤酵母表达载体中编码人cfh短共有重复结构域19(称为scr19)进行克隆。通过使用具有50,000和5,000mw截留值(sartorius，goettingen，germany)的vivacell70离心单元，然后hitrapspff阳离子交换色谱(gehealthcarelifesciences，piscataway，nj)，通过顺序差异过滤，从巴斯德毕赤酵母培养基中纯化蛋白质。

(2)筛选实验

以cfh15-mer多肽(seqidno：9)为抗原，并用包被液将抗原10倍稀释后包被96孔elisa板，每孔100μl4℃过夜包被，用封闭液常温封闭2个小时。将100μl的瞬时转染上清作为一抗常温孵育2个小时，用抗-iggγ链-hrp(millipore)为二抗(1:2000)作为二抗常温孵育1个小时，加入底物显色液100μl/孔，常温避光放置5min后，用2m硫酸钠中止反应，用450nm/630nm波长进行比色。筛选获得具有活性并特异性结合cfh15-mer多肽的抗体命名为trn1004，进行大量表达和功能性实验验证。

5.抗体大量表达与纯化

将trn1004抗体重链与轻链的表达载体用polyfect(qiagen)转染试剂盒共转染大批量的293细胞，转染后6-8小时换新鲜培养基，并在37℃5％co2培养箱中培养72小时。收集转染上清，4000rpm离心1小时，采用amersham公司的protein-a亲和层析柱直接纯化表达上清。利用sds-page检验抗体trn1004的表达及纯化情况。

结果如图1所示，还原后可见清晰的抗体重链和轻链。

实施例2结合位点验证试验

标有生物素的cfh15-mer多肽抗原(seqidno:9)，对每个氨基酸分别进行突变，形成了15个突变肽，再加上野生型多肽作为阳性对照以及序列打乱的多肽作为阴性对照，用elisa检测trn1004抗体在不同浓度下分别与上述18个多肽的结合情况，绘制曲线并且计算出areaundercurve(auc)，分析抗体与多肽的关键结合位点。结果如图2显示，trn1004抗体与cfh抗原多肽关键结合位点是多肽序列gppppidngditsfp中第5位、第6位、第7位、第8位、第11位、第12位，证明能与抗原多肽特异性结合。其中，图2中cfh为阳性对照1，其序列如seqidno:9所示，or为阳性对照2，其序列如seqidno:11所示，ga1、pa2、pa3、pa4、pa5、ia6、da7、na8、ga9、da10、ia11、ta12、sa13、fa14、pa15分别代表上述15个突变肽。

实施例3抗体亲和力测定

先进行sa芯片偶联捕获分子，再活化芯片的葡聚糖表面，以进样时间确定偶联量。最后利用sa芯片捕获分子捕获配体：将制备的全人源抗狂犬病病毒中和抗体作为配体，以计算得到的信号值确定单抗的进样浓度及接触时间。单抗与cfh15-mer多肽(抗原)结合的亲和力和动力学分析：cfh15-mer多肽用hbs-ep缓冲液稀释作为分析物，分析物以逐渐增高的浓度依次流过芯片，分别得到信号曲线。每个浓度作为1个循环，完成1次循环后用10mmol/l的甘氨酸－盐酸再生芯片以回复到原始未结合抗原的状态。用biacorex-100system软件进行分析。

结果如图3所示，trn1004抗体的亲和力可达1.42e-08，具体见下表：

表1抗体亲和力测定表

实施例4trn1004抗体的抗原表位测定

丙氨酸扫描定点突变：

为了明确重组cfh单抗的氨基酸印记，本发明分析了重组单抗和丙氨酸替代多肽(包含最初描述的那8个氨基酸结合域pidngdit序列)的结合情况。异亮氨酸1120突变为丙氨酸后跟重组单抗完全不结合。天冬酰胺1117突变后有0％-35％的野生型结合。苏氨酸1121突变后有1％-66％的野生型结合。多肽的上游四个残基或下游三个残基的改变对于单抗没影响。

虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>广州泰诺迪生物科技有限公司；珠海泰诺麦博生物技术有限公司；暨南大学

<120>一种全人源抗补体因子h的抗体

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