冷水七中分离的三萜皂苷类化合物及其在制备T淋巴细胞抑制剂中的应用的制造方法与工艺

本发明属三萜皂苷类化合物领域，具体涉及冷水七中分离的三萜皂苷类化合物及其在制备T淋巴细胞抑制剂中的应用。

背景技术：
民族药冷水七为凤仙花科凤仙花属植物冷水七(ImpatienspritzelliiHook.f.var.hupehensisHook.f.)的根茎，又名红苋﹑一口血﹑霸王七，多年生草本，分布于我国鄂西恩施自治州﹑宜昌市的宜昌﹑宜都﹑长阳﹑五峰﹑秭归等县以及神农架；建始县有栽培，栽培史达百年以上。《中国中药资源志要》记载，其根茎入药，性味辛、甘、凉，有小毒；具有祛风除湿，散瘀消肿，止痛止血，清热解毒之功效。民间单用或配方，用于风湿疼痛，四肢麻木，关节肿大，急性脘腹疼痛，食积腹胀泄泻，月经不调，经来腹痛，肠炎痢疾等症。目前，国内外对冷水七的研究仅限于生药学，而化学成分和生物活性研究报道较少。

技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供冷水七中分离的三萜皂苷类化合物及其在制备T淋巴细胞抑制剂中的应用。冷水七中分离的三萜皂苷类化合物，其具有如下所述的结构式：各化合物的化学名称如下：化合物2：刺囊酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-28-O-β-D-吡喃木糖(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(2)，化合物3：刺囊酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-28-O-β-D-吡喃木糖-(1→4)-[3″′-乙酰基]-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(3),化合物4：刺囊酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-28-O-β-D-吡喃木糖(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷(4),化合物5：刺囊酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯-28-O-β-D-吡喃木糖-(1→4)-[3″′-乙酰基]-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(5),化合物1：刺囊酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯-28-O-β-D-吡喃木糖-(1→4)-[3″′-乙酰基]-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-β-D-吡喃木糖苷(1)。上述冷水七中分离的三萜皂苷类化合物的获得方法：冷水七根茎粉碎后，经乙醇加热提取得到乙醇提取物，将乙醇提取物加水混悬，脱酯后，以正丁醇萃取，减压回收有机溶剂得到正丁醇部位；正丁醇部位留样后，利用硅胶柱层析，用氯仿－甲醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，采用MCI柱以水-甲醇溶液梯度洗脱分离，再次收集洗脱液，回收溶剂，得到粗品总皂苷类成分；将粗品总皂苷类上硅胶柱分离，以CHCl3:CH3OH:H2O体积比为60:20:3的混合溶剂洗脱，收集含目标产物的馏分，再用制备HPLC分离，用含0.05％(体积百分比)甲酸的32％乙腈-水溶液(体积百分比)洗脱，分离得到上述各目标三萜皂苷化合物。按上述方案，所述氯仿－甲醇溶液梯度洗脱为：依此采用全氯仿、体积比100:1的氯仿-甲醇溶液、体积比50:1的氯仿-甲醇溶液、体积比2:1的氯仿-甲醇溶液、体积比1:1的氯仿-甲醇溶液、全甲醇溶液洗脱，收集体积比2:1的氯仿-甲醇溶液，体积比1:1的氯仿-甲醇溶液，全甲醇溶液的洗脱液。按上述方案，所述水-甲醇溶液梯度洗脱为：依次用H2O、30％(体积百分比)的甲醇水溶液、60％的甲醇水溶液、80％的甲醇水溶液洗脱，收集80％CH3OH:H2O洗脱液。上述冷水七中分离的三萜皂苷类化合物在制备T淋巴细胞抑制剂中的应用。本发明还提供一种T淋巴细胞抑制剂，由有效量的上述冷水七中分离的三萜皂苷类化合物和药学上可接受的辅料组成。所述可接受辅料可以采用本领域常规的辅料，按照常规制备方法制备即可。按上述方案，所述T淋巴细胞抑制剂包括片剂等口服剂型以及外用的巴布剂等外用剂型。本发明的有益效果：本发明通过从冷水七中分离得到的三萜皂苷化合物1-5均有抑制T淋巴细胞增殖活性。在人类自身免疫性疾病中，化合物1-5可以抑制T淋巴细胞增殖，纠正机体免疫反应异常及失衡状况，恢复人体正常免疫平衡。患自身免疫性疾病类风湿性关节炎的病人关节中恢存在着T淋巴免疫细胞异常增高，Treg细胞减少的现象。本发明的药物通过对T淋巴细胞增殖的抑制，可对类风湿关节炎起到一定的治疗作用。另外，肿瘤的免疫疗法会导致人体的异常免疫反应，应用化合物1-5也可以减低人体的免疫反应，恢复人体正常免疫平衡。附图说明图1为本发明不同浓度的5种三萜皂苷单体对T淋巴细胞的存活率。图中各浓度中从左到右分别对应为在该浓度下三萜皂苷单体化合物2，3，4，5，1的T淋巴细胞的存活率。图2为化合物5的HSQC-TOCSY图谱。图3为化合物5的HMBC图谱。图4为化合物5的HMBC图(5.99-170.34)。图5为湿法压片工艺图。图6为湿法压片工艺图。具体实施方式实施例1冷水七中三萜皂苷化合物的提取分离冷水七根茎20kg经适当粉碎后，50％乙醇加热回流提取4次，每次2h，减压回收溶剂得乙醇总浸膏2.0kg。取乙醇总浸膏2.0kg加适量水使之混悬，先用等倍体积石油醚脱酯后，以等倍体积正丁醇(n-BuOH)分别萃取4次，减压回收有机溶剂得到正丁醇部位343g。正丁醇部位适当留样后，利用硅胶柱层析，以氯仿－甲醇系统梯度洗脱：依此采用全氯仿，体积比100:1的氯仿-甲醇溶液，体积比50:1的氯仿-甲醇溶液，体积比2:1的氯仿-甲醇溶液，体积比1：1的氯仿-甲醇溶液，全甲醇溶液洗脱，收集体积比2:1的氯仿-甲醇溶液，体积比1：1的氯仿-甲醇溶液，全甲醇溶液的洗脱液，将其混合后，采用MCI柱色谱，依次用H2O,30％的甲醇水溶液,60％的甲醇水溶液，80％的甲醇水溶液洗脱分离，取80％CH3OH:H2O洗脱液，回收溶剂，得到粗品总皂苷类成分。将粗品总皂苷类上硅胶柱分离，以CHCl3:CH3OH:H2O(体积比60:20:3)溶剂洗脱，收集含目标产物的3个馏分(Fr.7-4-1～Fr.7-4-3)，再分别用制备HPLC分离，检测波长205nm，32％乙腈-水溶液(0.05％甲酸)洗脱，流速为5ml/min，分离得到5个三萜皂苷化合物。5个三萜皂苷的结构确证数据化合物2：白色粉末.IR(KBr):3408,2945,1735,1629,1449,1388,1364,1222cm-1.1HNMR(C5D5N,800MHz)和13CNMR(C5D5N,200MHz),表征结果见表1-4，ESIMS(negitive)m/z1058[M]–化合物3：白色粉末.IR(KBr):3408,2944,1735,1754,1629,1449,1388,1364,1222cm-1.1HNMR(C5D5N,800MHz)和13CNMR(C5D5N,200MHz),表征结果见表1-4，ESIMS(negitive)m/z1100[M]–化合物4：白色粉末.IR(KBr):3408,2944,1735,1629,1449,1388,1364,1222cm-1.1HNMR(C5D5N,800MHz)和13CNMR(C5D5N,200MHz)表征结果见表1-4，ESIMS(negitive)m/z1058[M]–.化合物5：白色粉末.IR(KBr):3410,2938,1737,1756,1643,1449,1388,1364,1222cm-1.1HNMR(C5D5N,800MHz)和13CNMR(C5D5N,200MHz)表征结果见表1-4，ESIMS(negitive)m/z1114[M]–.化合物1：白色粉末.IR(KBr):3411,2939,1738,1754,1642,1450,1387,1363,1223cm-1.1HNMR(C5D5N,800MHz)和13CNMR(C5D5N,200MHz)表征结果见表1-4，ESIMS(negitive)m/z1114[M]–.5个皂苷化合物的结构确定：通过比对5个皂苷的苷元13C-NMR，1H-NMR数据，可以发现与文献(Chemical&PharmaceuticalBulletin,1991,39(2):388～396)中刺囊酸(echinocysticacid)的数据基本一致。化合物1-5的3位碳由于连有糖，化学位移值发生苷化位移，数据由78变为89左右，增加11ppm；化合物1-5中苷元由于28位羧基和糖连接有酯苷键，也发生苷化位移，化学位移值由180变为176左右，减少4ppm。因此化合物2-5是3，28位都连有糖的双糖链苷。化合物1-5中糖的个数可通过13C-NMR谱95-115之间碳的个数确定，进一步地，通过HSQC-TOCSY二维谱表征糖的种类木糖，葡萄糖醛酸，鼠李糖，阿拉伯糖通，化合物5的HSQC-TOCSY图谱见图2。通过HMBC谱确定糖与糖之间连接位置以及化合物3,5,1中乙酰氧基连接位置、甲氧基连接位置。化合物5的HMBC图谱见图3和图4。举例如下：化合物5为白色粉末，Liebermann-Burchard和Molish反应阳性，提示该化合物可能为甾体或三萜皂苷类化合物。ESI-...