具有破骨细胞分化及活性抑制能力的肽及其用途的制作方法

本专利申请针对2014年07月31日向韩国专利厅提出的韩国特许申请第10-2014-0098362号主张优先权，上述专利申请的公开事项插入于本说明书作为参照。

本发明涉及具有破骨细胞分化及活性抑制能力的肽及其用途。

背景技术：

骨头(bone)用于支撑人体的软组织和体重，并包围内部器官来从外部冲击保护内部脏器。并且，不仅在结构上支撑肌肉或脏器，而且是储存体内的钙或其他必须无机质，即储存如磷或镁等的物质的人体的重要部分之一。因此，生长结束的成人的骨头直到死亡为止不停地非常动态、持续地反复再生去除老骨头并以新骨头代替的生成和吸收过程，并保持均衡。将上述称为骨重建(boneremodeling)。在去除老骨头并以新骨头代替的骨头的循环(turnover)在恢复由生长和应激而发生的骨头的微细损伤，并适当地保持骨头的功能中是必须的。

众所周知，在骨重建中大致两种细胞参与。在两种细胞中一种为生成骨头的造骨细胞(osteoblast)，另一种为破坏骨头的破骨细胞(osteoclast)。造骨细胞生成核因子kb受体活化因子配体(receptoractivatorofnuclearfactor-κbligand)和作为它的诱饵受体(decoyreceptor)的骨保护素(opg，osteoprotegerin)。若核因子kb受体活化因子配体与作为位于破骨前体细胞(osteoclastprogenitorcells)的表面的受体的核因子kb受体活化因子相结合，则破骨前体细胞成熟(maturation)为破骨细胞，来发生骨吸收(boneresorption)。但是，若骨保护素与核因子kb受体活化因子配体相结合，则通过阻隔核因子kb受体活化因子配体和核因子kb受体活化因子之间的结合，来抑制破骨细胞的形成，并未发生必要以上的骨吸收。老骨头的吸收或破坏通过在血液细胞(造血干细胞)中生成的破骨细胞实现，这是在骨头中穿出孔来使少量的钙向血流放出，从而适用于保持身体功能。另一方面，在骨细胞中生成的造骨细胞利用胶原质填满孔，并利用羟磷灰石(hydroxyapatite)覆盖来重建结实的新的骨头。从骨头受到破坏其至再次形成为新的骨头约需要100天左右。在幼儿中1年之内更换100％的骨头的钙，但是在成人中，每年骨骼的约10～30％通过上述过程来再次形成，只有破骨速度和造骨速度相同，才可保持与以前相同的骨密度。如上所述，在重要的骨头中破坏平衡的情况下，可导致很多疾病，尤其，代表性地是由骨质疏松症和癌细胞的骨转移(bonemetastasis)引起的与骨损伤相关的疾病。

骨质疏松症(osteoporosis)作为由各种原因使骨头的质量减少，因骨头组织的微细结构的退化骨折风险持续增加的疾病，是处于构成骨头的矿物质(尤其钙)和基质减少的状态，由于破坏骨重建的平衡，因而在破骨作用相比于造骨作用增加的状态下发生。正常的骨头内部形成如网形成致密的结构，但是在骨质疏松症的情况下结构之间的间隔宽，因使微细结构变薄来变弱，从而以在小小的冲击下，还可使骨头骨折的状态进行。骨质疏松症与闭经期的开始一同呈现急剧的骨损失(年2～3％)，在脊柱的压迫及腕骨易骨折的风险增加的闭经期后的骨质疏松症(postmenopausalosteoporosis)、70岁以上的男女老年人中逐渐发生(年0.5～1％)，并且分类为带来髋骨(hipbone)和椎骨的渐进的骨损失的老年期的骨质疏松症(senileosteoporosis)及与年龄无关的疾病(内分泌疾病、胃肠道疾病、恶性肿瘤)或药物(肾上腺皮质激素、抗癌化疗法、甲状腺激素、抗癫痫剂、抗凝固剂、甲氨蝶呤(methotrexate)、环孢霉素(cyclosporine)、促性腺激素释放激素(gnrh)等)、由乙醇、吸烟及事故发生的第二次骨质疏松症(secondaryosteoporosis)。

在由如上所述的骨质疏松症及癌细胞的骨转移导致的骨损伤中利用如福善美(fosamax，成分名称：阿仑膦酸钠(alendronate))、安妥良(actonel，成分名称：利塞膦酸钠(risedronate))等双磷酸盐(bisphosphonate)类的治疗剂。它们双磷酸盐制剂大部分使破坏骨头的破骨细胞的功能弱化，并且诱导凋亡来使骨头的损失缓慢或停止的作用。但是，这些药不具有促进形成新骨的作用，最近，在服用双磷酸盐的患者中发生颌骨的坏死(骨坏死(osteonecrosis))、重症心房颤动、骨头或关节的无力化或筋骨骼的痛症的事例年年增加。因此，相比于抑制骨吸收对促进骨的形成的骨质疏松症的预防及治疗剂的开发集中较多的关心。

本说明书全文中，参照多篇论文及专利文献，并标示了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容，作为参照全部插入到本说明书中，从而更加明确地说明本发明所属技术领域的水平及本发明的内容。

技术实现要素：

要解决的问题

本发明人努力开发在生物学上具有有效的活性的优秀的肽，其结果，查明由序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列形成的肽通过抑制破骨细胞的分化及活性，来对由骨破坏发生的多种骨疾病具有优秀的预防及治疗效果，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供具有破骨细胞分化及活性抑制能力的肽。

本发明的另一目的在于，提供骨疾病的预防或治疗用组合物。

根据发明的详细说明、发明要求保护范围及附图更加明确本发明的其他目的及优点。

解决问题的方案

根据本发明的一实施方式，本发明提供由选自由序列表中序列1及序列表中序列3的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的具有破骨细胞分化及活性抑制能力的肽。

本发明人努力开发在生物学上具有有效的活性的优秀的肽，其结果，查明具有序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列的肽通过抑制破骨细胞的分化及活性，来对由骨破坏发生的多种骨疾病具有优秀的预防及治疗效果，从而完成了本发明。

本发明的肽包含序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列。具体地，本发明的肽必须由选自由序列表中序列1及序列表中序列3的氨基酸序列组成的组中的一种的氨基酸序列构成。

本发明的肽有效抑制破骨细胞的分化及活性。

在关节内骨破坏随着破骨细胞(osteoclast)得到活性化而呈现，在造血干细胞中分化的骨髓性前体细胞(myeloidprecursor)在炎性环境下分化为破骨细胞。在类风湿关节内存在很多炎性细胞因子及趋化因子，并且通过上述物质使对破骨细胞的分化需要的各种分子的表达增加，从而诱导破骨细胞的形成。认识到在类风湿关节炎的治疗目标中重要的是通过抑制骨破坏来将关节损伤最小化。

作为在骨髓性前体细胞分化成破骨细胞中必须的物质在前体细胞表面中诱导核因子kb受体活化因子(rank，receptoractivatorofnuclearfactorκb)，并且提供作为对此的配体的核因子kb受体活化因子配体(receptoractivatorofnuclearfactorκbligand)的细胞相结合的所谓核因子kb受体活化因子-核因子kb受体活化因子配体的相互作用是必须的。并且，巨噬细胞集落刺激因子(m-csf，macrophagecolonystimulatingfactor)也在破骨细胞成熟且分化中起到重要的作用。作为破骨细胞分化的主要的信号传递途径核因子kb受体活化因子-核因子kb受体活化因子配体相互作用和巨噬细胞集落刺激因子是必须的，但是通过在于前体细胞表面的多种免疫球蛋白样受体(ig-likereceptor)，来与作为细胞内信号传递物质的dap12或fcrγ相连接，来提供共刺激信号(co-stimulatorysignal)。成为最中心的信号传递途径是在形成核因子kb受体活化因子配体-核因子kb受体活化因子相互结合后，通过作为细胞内信号传递物质的肿瘤坏死因子受体相关蛋白6(traf6，tnf-receptor-associatedfactor6)，来经过核因子kb(nf-kb)的活性化，使在破骨细胞形成中必须的基因转录增加而形成。然后，众所周知，巨噬细胞集落刺激因子也是在分化为破骨细胞中必须的物质，并且与如属于受体酪氨酸激酶超家族的cfms等特异受体相结合后，构成细胞质内src-pyk2复合体，来通过上述诱导如核因子κb等转录调节物质，或通过整合蛋白，来执行细胞内信号传递作用。

根据本发明的一实例，本发明的肽使与破骨细胞分化相关的抗酒石酸盐酸性磷酸酶(tartrateresistantalkalinephosphatase)及组织蛋白酶k(cathepsink)的表达减少，通过抑制nf-κb的核内移动，来最终抑制破骨细胞的分化及活性。

在本说明书中，所使用的术语“肽”是指通过肽键来由多个氨基酸残基互相结合而成的线性分子。本发明的肽可通过本领域中公知的化学合成方法，例如，固相合成技术(solid-phasesynthesistechniques:merrifield,j.amer.chem.soc.85:2149-54(1963)；stewart,etal.,so]idphasepeptidesynthesis,2nd.ed.,piercechem.co.:rockford,111(1984))或液相合成技术(美国登录专利第5516891号)来制备而成。

根据本发明的一实例，上述肽的n-末端或c-末端可与选自由乙酰基、芴甲氧羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂酰基及聚乙二醇(peg)组成的组中的保护基相结合。

上述的氨基酸的变形起到大大提高本发明的肽的稳定性的作用。在本发明中提及的术语“稳定性”不仅是指“体内”稳定性，还指储存稳定性(例如，常温储存稳定性)。上述保护基起到从生物体内的蛋白质切割酶的攻击保护本发明的肽的作用。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供骨疾病的预防或治疗用组合物，上述骨疾病的预防或治疗用组合物包含由选自由序列表中序列1及序列表中序列3的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的肽作为有效成分。

本发明的组合物包含由上述的本发明的由序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列形成的肽作为有效成分，因此为了避免本说明书过于复杂，省略共同的记载内容。

如在以下实施例中得到证明，由本发明的序列表中序列1、序列表中序列2或序列表中序列3的氨基酸序列形成的肽抑制破骨细胞的分化及活性，因此在与骨破坏相关的骨疾病的预防或治疗中非常有效。

本发明的骨疾病的预防或治疗用组合物可适用于在破骨作用过度的情况下发生的全部疾病，例如可使用于骨损伤、骨质疏松症、软骨症、佝偻病、纤维性骨炎、无力性骨病或代谢性骨疾病等。

根据本发明的一实例，本发明的组合物可制备成药剂学组合物，上述药剂学组合物包含：(a)上述的本发明的肽的药剂学有销量；以及(b)药剂学上接受的载体。

在本说明书中使用的术语“药剂学有销量”是指达成与上述的肽的功效或活性的充分量。

包含于本发明的药剂学组合物的药剂学上接受的载体作为制剂时通常利用的载体，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但不局限于此。本发明的药剂学组合物除了上述成分之外，还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、保鲜剂等。适当的药剂学上接受的载体及制剂详细地记载于remington’pharmaceuticalsciences(19thed.，1995)。

本发明的药剂学组合物能够以口服或非口服的方式进行给药，在以非口服的方式给药的情况下，可通过静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、局部给药、经皮给药等的方式进行给药。

本发明的药剂学组合物的适当的给药量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏度等的因素而多样地进行处方。另一方面，本发明的药剂学组合物的1天给药量为0.0001～200μg。

并且，本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可容易实施的方法，利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而可制备成单位容量形态或装入多容量容器内来制备。此时，剂型还可以为油性或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态或浸膏剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或凝胶(例如，水凝胶)形态，还可包含分散剂或稳定剂。

发明的效果

归纳本发明的特征及优点如下。

(i)本发明的由选自由序列表中序列1及序列表中序列3的氨基酸序列组成的组中的一种的氨基酸序列形成的肽具有破骨细胞分化及活性抑制能力，并且对与骨破坏相关的骨疾病的预防或治疗非常有效。

(ii)本发明的肽通过使与破骨细胞分化相关的抗酒石酸盐酸性磷酸酶及组织蛋白酶k(cathepsink)的表达减少，并抑制核因子κb的核内移动，来最终抑制破骨细胞的分化。

(iii)本发明提供包含上述肽的骨疾病的预防或治疗用组合物。

附图说明

图1a、图1b及图1c为通过抗酒石酸盐酸性磷酸酶染色确认当基于本发明的肽处理的破骨细胞分化时，所表达的的抗酒石酸盐酸性磷酸酶蛋白质的表达程度变化的结果。图1a为序列表中序列1的肽、图1b为序列表中序列2的肽及图1c为序列表中序列3的肽。

图2a、图2b及图2c为通过逆转录-聚合酶链反应(rt-pcr)确认当基于本发明的肽处理的破骨细胞分化时，所表达的抗酒石酸盐酸性磷酸酶及组织蛋白酶k的信使核糖核酸(mrna)的水平的结果。图2a为序列表中序列1的肽、图2b为序列表中序列2的肽、图2c为序列表中序列3的肽。

图3a、图3b及图3c为通过蛋白质印迹法确认当基于本发明的肽处理的破骨细胞分化时，所促进的核因子κb的核内移动变化的结果。图3a为序列表中序列1的肽、图3b为序列表中序列2的肽、图3c为序列表中序列3的肽。

图4a、图4b及图4c通过免疫化学染色确认为当基于本发明的肽处理的破骨细胞分化时，所表达的抗酒石酸盐酸性磷酸酶的表达程度的结果。图4a为序列表中序列1的肽、图4b为序列表中序列2的肽及图4c为序列表中序列3的肽。

图5a、图5b及图5c为通过免疫化学染色确认当基于本发明的肽处理的破骨细胞分化时，所表达的组织蛋白酶k的表达程度的结果。图5a为序列表中序列1的肽、图5b为序列表中序列2的肽及图5c为序列表中序列3的肽。

具体实施方式

以下，通过实施例更加详细说明本发明。这种实施例只用于更加详细说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

实施例

合成例1：肽合成

将700mg的氯三苯甲基氯树脂(chlorotritylchlorideresin；ctlresin，novabiochemcatno.01-64-0021)放入反应容器中，并加入10ml的二氯甲烷(mc)来搅拌了3分钟。去除溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺(dmf)来搅拌3分钟后，重新去除了溶剂。将10ml的二氯甲烷(dcm)溶液放入反应器中，并放入200mmole的fmoc-arg(pbf)-oh(瑞士巴亨公司(bachem，swiss))及400mmole的二异丙基乙胺(diea)后，搅拌并均匀溶解，搅拌1小时并进行反应。反应后清洗，将甲醇和二异丙基乙胺(2：1)溶解于二氯甲烷中，反应10分钟，并用过量的二氯甲烷/二甲基甲酰胺(1：1)进行清洗。去除溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺来搅拌3分钟后，重新去除了溶剂。将10ml的脱保护溶液(20％的哌啶(piperidine)/二甲基甲酰胺)放入反应容器中，并在常温条件下搅拌10分钟后，去除了溶液。放入同量的脱保护溶液，并重新维持10分钟反应后，去除溶液，并分别以3分钟的方式用二甲基甲酰胺清洗2次、用二氯甲烷清洗1次、用二甲基甲酰胺清洗1次，来制备了arg(pbf)-ctl树脂。

在新的反应器中放入10ml的二甲基甲酰胺溶液，并加入200mmole的fmoc-leu-oh(bachem，swiss)、200mmole的羟基苯并三唑(hobt)及200mmole的苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(bop)后，搅拌来均匀溶解。在反应器中，经过2次以分馏的方式放入400mmole的n，n-二异丙基乙胺(diea，n，n-diisopropylethylamine)后，搅拌至所有固体溶解为止至少5分钟。将溶解的氨基酸混合溶液放入具有脱保护的树脂的反应容器中，在常温条件下搅拌1小时并进行反应。去除反应液，并用二甲基甲酰胺溶液每次搅拌5分钟，并搅拌3次后去除。取少量的反应树脂，并利用茚三酮测试(nihydrintest)检查了反应程度。使用脱保护溶液，以与上述方法相同的方法进行2次脱保护反应，来制备了leu-arg(pbf)-ctl树脂。使用二甲基甲酰胺和二氯甲烷充分清洗，并重新执行一次茚三酮测试，接着以与上述方法相同的方法执行了以下氨基酸附着实验。

根据选定的氨基酸序列，按fmoc-phe、fmoc-glu(otbu)、fmoc-val、fmoc-pro、fmoc-ser(tbu)的顺序进行连锁反应。利用脱保护溶液使fmoc-保护基以10分钟的方式反应2次后，清洗干净并去除。利用二甲基甲酰胺、二氯甲烷及甲醇，分别将放入乙酸酐、n，n-二异丙基乙胺、羟基苯并三唑(hobt，hydroxybenzotriazole)乙酰化1小时后制备的肽基树脂清洗3次，使氮气慢慢流入来干燥后，在五氧化二磷(phosphoruspentoxide，p2o5)条件下，减压成真空状态，来完全干燥后，放入30ml的泄漏溶液[95％的三氟乙酸(tfa，trifluroaceticacid)、2.5％的蒸馏水、2.5％的苯甲硫醚(thioanisole)]，接着，在常温条件下微动一下，并保持2小时反应。通过过滤对树脂进行过滤，并利用少量的溶液清洗树脂后，与母液进行混合。利用减压蒸馏至剩有总容积的一半左右的容积，并加入50ml的凉的醚诱导沉淀后，进行离心分离来收集沉淀，并利用更凉的醚清洗2次。去除母液，并在氮条件下充分干燥，来合成了0.80g的纯化前ser-pro-val-glu-phe-leu-arg肽1(序列1)(收率：88.8％)。当利用分子量测定仪测定时，可得到的分子量为846.7(理论值：846.9)。以如上所述的方法还合成了ile-thr-leu-gln-glu-ile-ile-arg-thr肽2(序列表中序列2)及ala-cys-ile-his-thr-leu-ser-leu-leu-cys肽3(序列表中序列3)(收率：分别86.4％及83.2％)。当利用分子量测定仪测定时，可分别得到分子量为1086.3(理论值：1086.3)及1073.0(理论值：1073.3)的值。

表1

实施例1：抗酒石酸盐酸性磷酸酶染色

通过染色确认当破骨细胞分化时，所表达的抗酒石酸盐酸性磷酸酶蛋白质的程度，并观察了当处理肽时所减少的倾向。

以1×10⁴细胞/孔的方式在48-孔板中播种raw264.7的巨噬细胞后，同时按浓度对肽(独立的肽或同时处理50ng/ml核因子kb受体活化因子配体)进行处理，并且培养5天来诱导了分化。使用西格玛奥德里奇(sigmaaldrich)公司的酸性磷酸酶试剂盒(acidphosphatasekit)来执行了抗酒石酸盐酸性磷酸酶的染色。添加固定缓冲液后反应30秒钟，并利用蒸馏水进行了清洗。每孔放入200μl的染色溶液，在37℃反应30分钟后利用蒸馏水进行了清洗。干燥一天后利用显微镜进行了观察。

与通过核因子kb受体活化因子配体处理诱导细胞分化，来抗酒石酸盐酸性磷酸酶的表达增加的对照组相比，在处理序列1至序列3的肽的组中可观察到抗酒石酸盐酸性磷酸酶的表达以浓度依赖性的方式减少(图1a至图1c)。

实施例2：与抗酒石酸盐酸性磷酸酶及组织蛋白酶k(cathepsink)相关的逆转录-聚合酶链反应

通过逆转录-聚合酶链反应确认当破骨细胞分化时，所表达的抗酒石酸盐酸性磷酸酶及组织蛋白酶k(cathepsink)的信使核糖核酸水平(mrnalevel)，并观察了当处理肽时所减少的倾向。

以1×10⁴细胞/孔的细胞密度在48-孔板中播种raw264.7的巨噬细胞。同时按浓度(10μg/ml、50μg/ml)处理50ng/ml的核因子kb受体活化因子配体和肽，并且在37℃的培养器中培养了5天。回收结束培养的细胞后通过处理核糖核酸提取液(rnaextractionsolution)(easyblue、内含子(intron))来准备核糖核酸后，使用反义预混合液(rtpremix)(内含子)来合成了互补脱氧核糖核酸(cdna)。通过使用对各个标记因子(组织蛋白酶k、抗酒石酸盐酸性磷酸酶)的引物和聚合酶链式反应预混合液(pcrpremix)(内含子)，来执行了聚合酶链式反应。在1％的琼脂糖凝胶中以每次5ul的方式装载聚合酶链式反应的结果物来进行电泳后，在凝胶(gel)-doc中确认了带。观察到了通过核因子kb受体活化因子配体处理诱导的破骨细胞分化标记、抗酒石酸盐酸性磷酸酶及组织蛋白酶k的表达根据序列1至序列3的肽处理减少(图2a至图2c)。

实施例3：利用蛋白质印迹法分析核因子κb的位置移动

为了确认当破骨细胞分化时，所促进的核因子κb的核内移动，分离和蛋白质，并观察基于核因子kb受体活化因子配体处理的核内核因子κb的水平增加后观察了基于肽处理的减少倾向。

以5×10⁵细胞/孔的方式在6-孔板中播种小鼠巨噬细胞株raw264.7巨噬细胞。培养一天后利用无血清培养基进行更换，来培养了6小时。按浓度处理50ng/ml的核因子kb受体活化因子配体和原材料，并培养了30分钟。在结束处理的细胞中提取核蛋白质，并进行二喹啉甲酸(bca)后，准备样品来在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sds-page)中进行了电泳。利用硝酸纤维素膜进行转移后使用5％的脱脂乳阻断了1小时。以1：1000在阻断溶液中稀释第一次抗体抗-核因子κbp65，来在冷藏中培养了一宿。利用pbst，15分钟清洗3次后，使用第二次抗体抗-兔(rabbit)igg-hrp来在常温条件下培养了1小时。利用pbst，15分钟清洗3次后，利用ecl溶液进行了发色。

观察到了通过核因子kb受体活化因子配体处理诱导的核因子κb的核内移动、通过序列1至序列3的肽的处理减少(图3a至图3c)。

实施例4：与抗酒石酸盐酸性磷酸酶相关的免疫化学染色

通过荧光染色更明确地确认作为当破骨细胞分化时，所表达的标记的抗酒石酸盐酸性磷酸酶的表达程度，并观察了基于肽处理的表达减少倾向。

以2×10⁴细胞/孔的方式在48-孔板中播种raw264.7巨噬细胞，同时按浓度对原材料进行了处理。分化诱导5天后，在细胞中放入4％的多聚甲醛，并在常温条件下培养20分钟来进行了固定。利用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗3次后，放入0.3％的tritonx-100(在磷酸盐缓冲液(inpbs))，并在常温条件下培养了15分钟。之后，利用磷酸盐缓冲液清洗了3次。放入2％的牛血清白蛋(bsa)(在磷酸盐缓冲液)，并在常温条件下培养1小时来进行了阻断。在2％的牛血清白蛋中以1：100稀释第一次抗体(抗酒石酸盐酸性磷酸酶)后，在常温条件下培养了2小时。利用磷酸盐缓冲液清洗3次后，在2％的牛血清白蛋中以1：100稀释德克萨斯红-融合第二次抗体，在常温条件下培养了1小时。利用磷酸盐缓冲液清洗3次后，利用含有4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)的装片溶液进行装片，第二天利用显微镜进行了观察。

与通过核因子kb受体活化因子配体处理诱导破骨细胞分化，来抗酒石酸盐酸性磷酸酶的表达增加的对照组相比，在处理序列1至序列3的肽的组中可观察到rap的表达以浓度依赖性的方式减少(图4a至图4c)。

实施例5：与组织蛋白酶k相关的免疫化学染色

通过荧光染色更明确地确认作为当破骨细胞分化时，所表达的标记的组织蛋白酶k的表达程度，并观察了基于肽处理的表达减少倾向。

以2×10⁴细胞/孔的方式在48-孔板中播种raw264.7巨噬细胞，同时按浓度对原材料进行了处理。分化诱导5天后，在细胞中放入4％的多聚甲醛，并在常温条件下培养20分钟来进行了固定。利用磷酸盐缓冲液清洗3次后，放入0.3％的tritonx-100(在磷酸盐缓冲液)，并在常温条件下培养了15分钟，并利用磷酸盐缓冲液清洗了3次。放入2％的牛血清白蛋(在磷酸盐缓冲液)，并在常温条件下培养1小时来进行了阻断。在2％的牛血清白蛋中以1：100稀释第一次抗体(组织蛋白酶k)后，在常温条件下培养了2小时。利用磷酸盐缓冲液清洗3次后，在2％的牛血清白蛋中以1：100稀释异硫氰酸荧光素(fitc)-融合第二次抗体，在常温条件下培养了1小时。利用磷酸盐缓冲液清洗3次后，利用含有4’，6-二脒基-2-苯基吲哚的装片溶液进行装片，第二天利用显微镜进行了观察。

与通过核因子kb受体活化因子配体处理诱导破骨细胞分化，来组织蛋白酶k的表达增加的对照组相比，在处理序列1至序列3的肽的组中可观察到组织蛋白酶k的表达以浓度依赖性的方式减少(图5a至图5c)。

以上，对本发明的特定部分进行详细记述，而对于所属领域的普通技术人员而言，这些具体记述仅仅是优选实施例，本发明的范围不会由此受到限制是显而易见的。因此，本发明的实质范围应视为根据发明要求保护范围和其等同技术方案进行定义。