本发明属于体外诊断试剂
技术领域：
，具体涉及一种前白蛋白多抗血清的制备方法及其应用。
背景技术：
：血清前白蛋白(pa)又称转甲状腺素蛋白，是由4个相同亚基组成的四聚体，分子量为55.0kd。由肝细胞合成，除作为组织修补的材料外，还可视作一种转载蛋白，pa与视黄醇结合蛋白形成复合物，具有运载维生素a的作用。pa与甲状腺素结合球蛋白(tbg)和白蛋白(alb)一起，协同参与甲状腺素的转运。pa在甲状腺激素运输中的作用仅次于tbg。tbg负责转运甲状腺素总量的70％～75％，pa则转运15％～20％，而alb转运的甲状腺素更少些(10％)。在正常生理条件下，血浆甲状腺素几乎全部(99.98％)通过与这三种蛋白质结合运转，到达靶细胞。pa的另一重要功能是协助视黄醇结合蛋白(rbp)转运视黄醇。当机体需要维生素a时，贮存在肝脏内的视黄醇酯被水解，游离的视黄醇与rbp结合，被分泌到血循环中，再与pa结合，所形成的视黄醇rbp-pa大分子结合物，通过循环转运到有特异性rbp受体结合部位的靶组织中，一进入靶细胞，视黄醇-rbp-pa结合物即分离。血清中pa的测定结果在临床上是反应肝功能和机体营养状态的重要指标，常见于营养不良者。由于pa半衰期很短，可以反应肝脏合成和分解代谢的轻微改变，其血清浓度降低的幅度与肝实质损害的程度密切相关，因此在临床上也常见于肝功能损伤、肝硬化、外伤及感染患者。急性、亚急性重症肝炎起病后一周内，pa的下降变化远较alb敏感。各型肝炎患者血清pa水平均有不同程度的降低，以肝硬化和重症肝炎降低最显著。因此，血清中的pa可作为中毒肝病的早期诊断指标和观察肝脏功能恢复的灵敏指标。鉴于前白蛋白在疾病诊断中的应用，作为前白蛋白检测试剂核心原料的前白蛋白多抗血清的制备具有显著的应用价值。常规的硫酸铵和氯化钙沉淀法存在杂蛋白去除不完全、血清损耗率高等问题。技术实现要素：本发明的目的在于解决现有技术存在的缺点与不足，提供一种前白蛋白多抗血清的制备方法及其应用。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种前白蛋白多抗血清的制备方法，其中，包括以下步骤：1)采血：使用无菌采血法采集羊全血至血袋内备用；2)分离：将步骤1)采集的羊全血置于高速冷冻离心机中，在温度为4℃的条件下，采用3000～5000rpm的转速，离心10min，待离心结束后取上清液备用；3)沉淀：在步骤2)处理好的上清液中按照体积比为上清液：1％氨水的饱和硫酸铵溶液：生理盐水＝3:5:2的比例加入含1％氨水的饱和硫酸铵溶液和生理盐水，置于磁力搅拌器上搅拌2～3小时，制得混合溶液；4)离心：将步骤3)制得的混合溶液置于高速冷冻离心机中，在温度为4℃的条件下，采用8000～1000rpm的转速，离心10min，弃上清，沉淀物备用；5)复溶：将步骤4)制得的沉淀物中再按照体积比为沉淀物：1％氨水的饱和硫酸铵溶液：生理盐水＝3:5:2的比例加入含1％氨水的饱和硫酸铵溶液和生理盐水，置于磁力搅拌器上搅拌2～3小时，制得混合溶液；6)重离心：将步骤5)制得的混合溶液再置于高速冷冻离心机中，在温度为4℃的条件下，采用8000～1000rpm的转速，离心10min，弃上清，沉淀物备用；7)再在步骤6)制得的沉淀物中加入体积比为沉淀物：生理盐水＝3:2的生理盐水，置于磁力搅拌器上搅拌10～15分钟，将混合液装入透析袋，在生理盐水环境中透析72h～96h，每24h更换一次生理盐水，透析结束后得透析液；8)将步骤7)制得的透析液倒出，置于高速冷冻离心机中，在温度为4℃的条件下，采用8000～1000rpm的转速，离心10min，弃沉淀，在上清中加体积分数为4％的peg-6000，制得前白蛋白多抗血清。本发明一种前白蛋白多抗血清，应用于制备前白蛋白检测试剂。与现有技术相比，本发明提供的从免疫的羊血浆中制备前白蛋白多抗血清的制备方法，具有如下优点及效果：1.在饱和硫酸铵溶液中添加氨水，使得溶液处于稳定的饱和状态，保证盐析的进行；2.利用蛋白质的盐析特性，两次沉淀纯化，减少了血浆中的杂蛋白；3.根据聚乙二醇可作为分散剂和促溶剂的性质，保证了血清的稳定状态。采用简便操作方法，实现了血清除杂，该方法不但操作简单，而且血清损耗少，获得的血清可以直接用于诊断试剂生产。具体实施方式实施例1一种前白蛋白多抗血清的制备方法，其中，包括以下步骤：1)采血：使用无菌采血法采集羊全血至血袋内备用；2)分离：将步骤1)采集的羊全血置于高速冷冻离心机中，在温度为4℃的条件下，采用3000rpm的转速，离心10min，待离心结束后取上清液a1备用；3)沉淀：在步骤2)处理好的上清液a1中按照体积比为上清液：1％氨水的饱和硫酸铵溶液：生理盐水＝3:5:2的比例加入含1％氨水的饱和硫酸铵溶液和生理盐水，置于磁力搅拌器上搅拌2小时，制得混合溶液b1；4)离心：将步骤3)制得的混合溶液b1置于高速冷冻离心机中，在温度为4℃的条件下，采用8000rpm的转速，离心10min，弃上清，沉淀物c1备用；5)复溶：将步骤4)制得的沉淀物c1中再按照体积比为沉淀物：1％氨水的饱和硫酸铵溶液：生理盐水＝3:5:2的比例加入含1％氨水的饱和硫酸铵溶液和生理盐水，置于磁力搅拌器上搅拌2小时，制得混合溶液b2；6)重离心：将步骤5)制得的混合溶液b2再置于高速冷冻离心机中，在温度为4℃的条件下，采用8000rpm的转速，离心10min，弃上清，沉淀物c2备用；7)再在步骤6)制得的沉淀物c2中加入体积比为沉淀物：生理盐水＝3:2的生理盐水，置于磁力搅拌器上搅拌10分钟，将混合液装入透析袋，在生理盐水环境中透析72h，每24h更换一次生理盐水，透析结束后得透析液d；8)将步骤7)制得的透析液d倒出，置于高速冷冻离心机中，在温度为4℃的条件下，采用8000rpm的转速，离心10min，弃沉淀，得上清a2，在上清a2中加体积分数为4％的peg-6000，制得前白蛋白多抗血清。本发明一种前白蛋白多抗血清，应用于制备前白蛋白检测试剂。实施例2一种前白蛋白多抗血清的制备方法，其中，包括以下步骤：1)采血：使用无菌采血法采集羊全血至血袋内备用；2)分离：将步骤1)采集的羊全血置于高速冷冻离心机中，在温度为4℃的条件下，采用5000rpm的转速，离心10min，待离心结束后取上清液a1备用；3)沉淀：在步骤2)处理好的上清液a1中按照体积比为上清液：1％氨水的饱和硫酸铵溶液：生理盐水＝3:5:2的比例加入含1％氨水的饱和硫酸铵溶液和生理盐水，置于磁力搅拌器上搅拌3小时，制得混合溶液b1；4)离心：将步骤3)制得的混合溶液b1置于高速冷冻离心机中，在温度为4℃的条件下，采用10000rpm的转速，离心10min，弃上清，沉淀物c1备用；5)复溶：将步骤4)制得的沉淀物c1中再按照体积比为沉淀物：1％氨水的饱和硫酸铵溶液：生理盐水＝3:5:2的比例加入含1％氨水的饱和硫酸铵溶液和生理盐水，置于磁力搅拌器上搅拌3小时，制得混合溶液b2；6)重离心：将步骤5)制得的混合溶液b2再置于高速冷冻离心机中，在温度为4℃的条件下，采用10000rpm的转速，离心10min，弃上清，沉淀物c2备用；7)再在步骤6)制得的沉淀物c2中加入体积比为沉淀物：生理盐水＝3:2的生理盐水，置于磁力搅拌器上搅拌15分钟，将混合液装入透析袋，在生理盐水环境中透析96h，每24h更换一次生理盐水，透析结束后得透析液d；8)将步骤7)制得的透析液d倒出，置于高速冷冻离心机中，在温度为4℃的条件下，采用10000rpm的转速，离心10min，弃沉淀，得上清a2，在上清a2中加体积分数为4％的peg-6000，制得前白蛋白多抗血清。本发明一种前白蛋白多抗血清，应用于制备前白蛋白检测试剂。实施例3一种前白蛋白多抗血清的制备方法，其中，包括以下步骤：1)采血：使用无菌采血法采集羊全血至血袋内备用；2)分离：将步骤1)采集的羊全血置于高速冷冻离心机中，在温度为4℃的条件下，采用4000rpm的转速，离心10min，待离心结束后取上清液a1备用；3)沉淀：在步骤2)处理好的上清液a1中按照体积比为上清液：1％氨水的饱和硫酸铵溶液：生理盐水＝3:5:2的比例加入含1％氨水的饱和硫酸铵溶液和生理盐水，置于磁力搅拌器上搅拌2.5h，制得混合溶液b1；4)离心：将步骤3)制得的混合溶液b1置于高速冷冻离心机中，在温度为4℃的条件下，采用9000rpm的转速，离心10min，弃上清，沉淀物c1备用；5)复溶：将步骤4)制得的沉淀物c1中再按照体积比为沉淀物：1％氨水的饱和硫酸铵溶液：生理盐水＝3:5:2的比例加入含1％氨水的饱和硫酸铵溶液和生理盐水，置于磁力搅拌器上搅拌2.5h，制得混合溶液b2；6)重离心：将步骤5)制得的混合溶液b2再置于高速冷冻离心机中，在温度为4℃的条件下，采用9000rpm的转速，离心10min，弃上清，沉淀物c2备用；7)再在步骤6)制得的沉淀物c2中加入体积比为沉淀物：生理盐水＝3:2的生理盐水，置于磁力搅拌器上搅拌10分钟，将混合液装入透析袋，在生理盐水环境中透析84h，每24h更换一次生理盐水，透析结束后得透析液d；8)将步骤7)制得的透析液d倒出，置于高速冷冻离心机中，在温度为4℃的条件下，采用9000rpm的转速，离心10min，弃沉淀，得上清a2，在上清a2中加体积分数为4％的peg-6000，制得前白蛋白多抗血清。本发明一种前白蛋白多抗血清，应用于制备前白蛋白检测试剂。将上述实施例中制备的实施例1血清、实施例2血清和实施例3血清分别检测试剂空白值、分析灵敏度、精密度，检测结果如下：1.试剂空白表1为由实施例1血清、实施例2血清和实施例3血清配制的前白蛋白试剂分别在相同条件下连续检测三次空白吸光度。表12.分析灵敏度表2为由实施例1血清、实施例2血清配制的前白蛋白试剂分别在相同条件下连续检测三次质控品，计算吸光度变化值δa表23.精密度表3-5为由实施例1血清、实施例2配制的前白蛋白试剂分别在相同条件下连续检测10次质控品1(前白蛋白含量为9.8mg/dl)、质控品2(前白蛋白含量为20.3mg/dl)、质控品3(前白蛋白含量为30.2mg/dl)表3质控品112345678910cv偏差实施例110.210.810.710.710.810.910.810.410.710.82.01％8.97％实施例210.010.110.19.910.59.79.89.910.010.22.25％2.24％实施例310.110.39.99.8109.710.210.210.49.92.26％2.55％表4质控品2表5质控品312345678910cv偏差实施例131.531.231.231.131.431.430.531.230.931.40.95％3.31％实施例229.129.028.828.329.528.530.129.429.129.01.76％-3.64％实施例329.530.330.630.930.429.829.629.430.329.71.71％-0.50％表3-5表明，由本发明所制前白蛋白多抗血清配制的前白蛋白检测试剂对质控品1、2、3的检测结果不准确度相对偏差不超过±5％，靶值偏差不超过±10％，说明符合诊断试剂的技术指标。本发明的血清可直接应用于诊断试剂的生产。当前第1页12