一种来源于GSDMD蛋白的抗菌肽及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种来源于gsdmd蛋白的抗菌肽及其应用。

背景技术：

传统抗生素虽然在治疗细菌性感染疾病方面取得了一定的成果，但是近年来，由于抗生素的滥用，越来越多的微生物对传统的抗生素产生了耐受性，这对于人类的健康产生了很大的威胁。所以，研发一种新型的抗菌药物是十分必要的。

抗菌肽（antinicrobialpeptides,amps）原指昆虫体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的多肽物质，对细菌，真菌和病毒均有极强的杀灭能力，是生物免疫防御系统里的重要组成部分。与传统抗生素相比，抗菌肽分子量小、热稳定性好、水溶性好、抗菌谱广、不易诱发细菌产生耐药性。

目前研究认为抗菌肽可能主要是通过这种机制杀伤肿瘤细胞和微生物:胞膜攻击作用：大多数抗菌肽最基本的作用机制是破坏肿瘤细胞或细菌质膜结构,引起胞内水溶性物质大量渗出,从而最终导致肿瘤细胞和细菌的死亡,而抗菌肽分子的结构特征是保证上述机制发挥作用的重要基础。

细胞炎性坏死或细胞焦亡是机体在感知病原微生物浸染后启动的免疫防御反应，在拮抗和清除病原感染以及内源危险信号中发挥重要作用。细胞焦亡本质上一种程序性细胞坏死：细胞膜形成孔洞，细胞逐渐膨胀至细胞膜破裂，最终导致大量细胞内容物释放，激活强烈的炎症反应。过度的细胞焦亡会诱发多种自身炎症性和自身免疫性疾病。最近有研究显示艾滋病的发生也和细胞焦亡有关。细胞焦亡被认为由两种含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)介导，包括caspase-1和caspase-4/5/11。caspase-1由一个被称为炎症小体(inflammasome)的复合物在感知病原信号后激活，是细胞质天然免疫最为重要的通路之一。在最新的研究中，gasdermind（gsdmd）蛋白是炎性蛋白酶caspase的共有底物。

gsdmd属于gasdermin蛋白家族，该家族还包括gsdma，gsdmb，gsdmc，gsdme（dfna5），dfnb59等。gsdmd蛋白的n端大都可以引发细胞焦亡，在没有感染的情况下它们也是通过n端和c端的自抑制作用保持无活性状态。gsdmd在被炎性caspase切割后释放出来的的n端结构域其自身就足以引发细胞焦亡；在通常情况下，n端和c端结构域很强地相互作用，使得gsdmd处于无活性的自抑制状态。在细胞中表达基因工程改造的gsdmd(在两个结构域中间插入其它蛋白酶位点)，可以使细胞在其它蛋白酶刺激下发生焦亡，甚至可以将细胞凋亡转化为焦亡。这些结果都证明gsdmd的n端结构域具有诱发细胞焦亡的活性。

此外，gasdermin家族中人的gsdme（dfna5）和小鼠gsdma3的提前终止突变(翻译出可以诱发细胞焦亡的片断)分别导致人类非综合征性耳聋(nonsyndromichearingimpairment)和小鼠脱毛以及皮肤发炎等疾病，预示这些疾病都是由gasdermin蛋白引发非正常细胞焦亡所导致。这就为多种自身炎症性疾病和内毒素诱导的败血症提供了一个全新的药物靶点，同时也为我们提供了一个新型抗菌机制来对抗细菌的耐药性。

技术实现要素：

本发明目的是为了解决传统抗生素的不足之处，提供一种来自人源gsdmd蛋白的抗菌肽，同时提供了该抗菌肽的氨基酸序列、其抗菌活性检测方法及其应用。

本发明所述的抗菌肽，其为人源gsdmd蛋白(seqidno.1所示)序列m-n位的多肽,或该m-n位多肽序列中除fhfydamdgqi序列外的其他氨基酸进行各种取代、添加和/或缺失氨基酸后具有至少90%以上同源性的衍生多肽；其中，m选自60-80间的整数，n选自为90-110间的整数。

优选的，本发明所述的抗菌肽，其为人源gsdmd蛋白(seqidno.1)序列m-n位的多肽或该m-n位多肽序列中除fhfydamdgqi序列外的其他氨基酸进行各种取代、添加和/或缺失氨基酸后具有至少95%以上同源性的衍生多肽；其中，m选自70-80间的整数，n选自为90-100间的整数。

优选的，本发明所述的抗菌肽，其为人源gsdmd蛋白序列m-n位的多肽或该多肽序列中除fhfydamdgqi序列外的其他氨基酸进行各种取代、添加和/或缺失氨基酸后具有至少99%以上同源性的衍生多肽；其中，m选自70-80间的整数，n选自为90-100间的整数。

本发明涉及人源gsdmd蛋白(seqidno.1)序列m-n位的多肽中，除fhfydamdgqi序列外的其他氨基酸进行各种取代、添加和/或缺失氨基酸后具有至少90%以上同源性的衍生多肽，优选包含取代、缺失和/或插入不超过3个氨基酸的人工变体，更优选不超过2个氨基酸的突变体，最优选仅为1个位置氨基酸的突变。保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组（精氨酸、赖氨酸和组氨酸）、酸性氨基酸组（谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸组（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水氨基酸组（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）、芳族氨基酸组（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）和小氨基酸组（甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸）。通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如η.neurath和r.l.hill,1979,于theproteins，academicpress，newyork中描述。最普遍发生的交换是ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、tyr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu和asp/gly等。

更优选的，本发明所述的抗菌肽，其为人源gsdmd蛋白(seqidno.1)序列m-n位的多肽，其中m为80，n选自为90-100间的整数。

更优选的，本发明所述的抗菌肽，其为人源gsdmd蛋白(seqidno.1)序列m-n位的多肽，其中m选自70-80间的整数，n为90。

更优选的，本发明所述的抗菌肽，其为人源gsdmd蛋白(seqidno.1)序列80-90位的多肽，所述的抗菌肽序列为fhfydamdgqi。

更优选的，本发明所述的抗菌肽，其为人源gsdmd蛋白(seqidno.1)序列70-90位的多肽，所述的抗菌肽序列为aepdvqrgrsfhfydamdgqi。

本发明优选的抗菌肽还包括下列多肽：

sfhfydamdgqi（seqidno.2）；

rsfhfydamdgqi（seqidno.3）；

grsfhfydamdgqi（seqidno.4）；

rgrsfhfydamdgqi（seqidno.5）；

qrgrsfhfydamdgqi（seqidno.6）；

vqrgrsfhfydamdgqi（seqidno.7）；

dvqrgrsfhfydamdgqi（seqidno.8）；

pdvqrgrsfhfydamdgqi（seqidno.9）；

epdvqrgrsfhfydamdgqi（seqidno.10）。

根据文献报道，gsdmd的n端结构域有抑菌的活性但是对人体本身的细胞没有毒性。以目前的研究结果来看，人们并不知道gsdmd的n端具体是哪一段区域会对细菌产生抑制作用。为了找到这一段抑菌区域，我们以gsdmd序列作为模板，构建了不同长度的截短体分别连接在了带有his-sumo标签的psmt3载体上，并将其转化大肠杆菌（escherichiacoli）细胞中，涂布于添加37μg/ml抗性涂氯霉素及50μg/ml卡那霉素和终浓度为0.5mm的iptg的lb培养基固体平板上，放置在37°c培养箱中培养20小时，最终根据平板上菌落的生长状态来判断抑菌区域的范围。

根据图1结果显示，全长的gsdmd蛋白没有抑菌效果，gsdmd蛋白序列90-185、185-275、1-64+94-295也均没有抑菌效果。

相反的，gsdmd蛋白序列1-90、70-205、70-90、70-85、70-80、80-90均显示具有抑菌效果。

因此，通过不断摸索，发明人意外发现人源gsdmd蛋白氨基酸序列80-90（抗菌肽1，fhfydamdgqi）是gsdmd端结构域的核心抑菌区域。经人工合成的抗菌肽1由11个氨基酸组成，氨基酸序列为fhfydamdgqi（seqidno.11），分子量为1343.48da，等电点为4.20。经体外实验验证，抗菌肽1（fhfydamdgqi）对细菌具有很强的抗菌活性，包括但不限于大肠杆菌、耻垢分枝杆菌以及金黄色葡萄球菌等。

经进一步验证，其他包含抗菌肽1（fhfydamdgqi）的短肽也均具有抗菌活性，例如图1显示gsdmd蛋白序列70-90具有抗菌活性。发明人经人工合成含抗菌肽1（fhfydamdgqi）序列的抗菌肽2，其氨基酸序列为aepdvqrgrsfhfydamdgqi（seqidno.12），由21个氨基酸组成，分子量为2439.64da，等电点为4.66。经体外实验验证，抗菌肽2对细菌具有很强的抗菌活性，包括但不限于大肠杆菌、耻垢分枝杆菌以及金黄色葡萄球菌等。

为进一步验证包含gsdmd蛋白70-80核心序列的多肽也具有抗菌活性，发明人进一步人工合成抗菌肽3（aepdvqrgrsf），其氨基酸序列为aepdvqrgrsf（seqidno.13），由11个氨基酸组成，分子量为1398.51da。经体外实验验证，抗菌肽3对细菌具有很强的抗菌活性，包括但不限于大肠杆菌、耻垢分枝杆菌以及金黄色葡萄球菌等。

为进一步验证包含gsdmd蛋白70-85核心序列的多肽也具有抗菌活性，发明人进一步人工合成抗菌肽4（aepdvqrgrsfhfyda），其氨基酸序列为aepdvqrgrsfhfyda（seqidno.14），由16个氨基酸组成，分子量为1895.03da。经体外实验验证，抗菌肽4对细菌具有很强的抗菌活性，包括但不限于大肠杆菌、耻垢分枝杆菌以及金黄色葡萄球菌等。

本发明还进一步验证了所述的抗菌肽在抑制细菌繁殖方面的应用。经检测，所述的抗菌肽对于细菌具有较好的抑制生长活性，包括但不限于革兰氏阴性菌（大肠杆菌、耻垢分枝杆菌等）和革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌等）。通过在无菌96孔板中加入适量的出于对数生长期的细菌，加入不同浓度的抗菌肽，在37°c条件下，150-220rpm振荡培养，检测其在600nm处的吸光值。针对不同的细菌，例如大肠杆菌、耻垢分枝杆菌以及金黄色葡萄球菌等，均具有较好的抑菌活性，其最小抑制浓度为0.5nm-31.25μm。

在本发明优选的实施例中，本发明提供了抗菌肽1（fhfydamdgqi）、抗菌肽2（aepdvqrgrsfhfydamdgqi）、抗菌肽3（aepdvqrgrsf）和抗菌肽4（aepdvqrgrsfhfyda）对细菌，包括但不限于大肠杆菌、耻垢分枝杆菌以及金黄色葡萄球菌等生长活性的抑制检测。

本发明的优点是提供了一种来源于人的抗菌肽以及其在抑菌方面的作用。本抗菌肽具有高效的抗菌作用，对细菌具有很强的抗菌活性，且其分子量小，合成简单，具有较好的应用价值，例如可用于制备抑制细菌繁殖的药物。

附图说明

图1为gsdmd抑菌区域分析结果。gsdmd抑菌区域分析结果表明氨基酸序列70-80、70-85、80-90以及70-90可以抑制细菌生长。

图2为抗菌肽1（fhfydamdgqi）抑制大肠杆菌活性分析结果，表明其最小抑制浓度为0.5nm。

图3为抗菌肽1（fhfydamdgqi）抑制耻垢分枝杆菌活性分析结果，表明其最小抑制浓度为0.5nm。

图4为抗菌肽1（fhfydamdgqi）抑制金黄色葡萄球菌活性实验。结果表明其最小抑制浓度为8nm。

图5为抗菌肽2（aepdvqrgrsfhfydamdgqi）抑制大肠杆菌活性分析结果，结果表明其最小抑制浓度为31.25μm。

图6为抗菌肽2（aepdvqrgrsfhfydamdgqi）抑制耻垢分枝杆菌活性分析结果，表明其最小抑制浓度为0.5nm。

图7为抗菌肽2（aepdvqrgrsfhfydamdgqi）抑制金黄色葡萄球菌活性实验。结果表明其最小抑制浓度为0.5nm。

图8为抗菌肽3（aepdvqrgrsf）抑制大肠杆菌活性实验。结果表明其最小抑制浓度为0.5nm。

图9为抗菌肽3（aepdvqrgrsf）抑制金黄色葡萄球菌活性实验。结果表明其最小抑制浓度为0.5nm。

图10为抗菌肽4（aepdvqrgrsfhfyda）抑制大肠杆菌活性实验。结果表明其最小抑制浓度为0.5nm。

图11为抗菌肽4（aepdvqrgrsfhfyda）抑制金黄色葡萄球菌活性实验。结果表明其最小抑制浓度为0.5nm。

具体实施方式

实施例1：人源抗菌肽的发现

根据文献报道，gsdmd的n端结构域有抑菌的活性但是对人体本身的细胞没有毒性。以目前的研究结果来看，人们并不知道gsdmd的n端具体是哪一段区域会对细菌产生抑制作用。为了找到这一段抑菌区域，我们以gsdmd序列作为模板，构建了不同长度的截短体分别连接在了带有his-sumo标签的psmt3载体上，并将其转化大肠杆菌（escherichiacoli）细胞中，涂布于添加37μg/ml抗性涂氯霉素及50μg/ml卡那霉素和终浓度为0.5mm的iptg的lb培养基固体平板上，放置在37°c培养箱中培养20小时，最终根据平板上菌落的生长状态来判断抑菌区域的范围。

由图1的结果可以分析出，氨基酸序列80-90（抗菌肽1，fhfydamdgqi）、70-90（抗菌肽2，aepdvqrgrsfhfydamdgqi）、70-80（抗菌肽3，aepdvqrgrsf）及70-85（抗菌肽4，aepdvqrgrsfhfyda）这四段区域是gsdmd端结构域的抑菌区域。

实施例2：抗菌肽的合成及鉴定

抗菌肽1（fhfydamdgqi）、抗菌肽2（aepdvqrgrsfhfydamdgqi）、抗菌肽3（aepdvqrgrsf）和抗菌肽4（aepdvqrgrsfhfyda）由上海强耀公司合成提供，纯度大于90%。

实施例3：抗菌肽抗大肠杆菌活性检测

在无菌96孔板中加入适量的出于对数生长期的大肠杆菌，使其总体积达到200μl，且抗菌肽的终浓度达到500μm,125μm,31.25μm,8μm,2μm,488nm,122nm,30nm,8nm,2nm,0.5nm,0nm，在37°c条件下，150-220rpm振荡培养，检测其在600nm处的吸光值。

由图2抗菌肽1（fhfydamdgqi）抑制大肠杆菌活性结果可知，其最小抑制浓度为0.5nm。

由图5抗菌肽2（aepdvqrgrsfhfydamdgqi）抑制大肠杆菌活性结果可知，其最小抑制浓度为31.25μm。

由图8抗菌肽3（aepdvqrgrsf）抑制大肠杆菌活性结果表明其最小抑制浓度为0.5nm。

由图10抗菌肽4（aepdvqrgrsfhfyda）抑制大肠杆菌活性实验。结果表明其最小抑制浓度为0.5nm。

实施例4：抗菌肽抗耻垢分枝杆菌活性检测

在无菌96孔板中加入适量的出于对数生长期的耻垢分枝杆菌，使其总体积达到200μl，且抗菌肽的终浓度达到500μm,125μm,31.25μm,8μm,2μm,488nm,122nm,30nm,8nm,2nm,0.5nm,0nm，在37°c条件下，150-220rpm振荡培养，检测其在600nm处的吸光值。

由图3抗菌肽1（fhfydamdgqi）抑制耻垢分枝杆菌活性结果可知，其最小抑制浓度为0.5nm。

由图6抗菌肽2（aepdvqrgrsfhfydamdgqi）抑制耻垢分枝杆菌活性结果可知，其最小抑制浓度为0.5nm。

实施例5：抗菌肽抗金黄色葡萄球菌活性检测

在无菌96孔板中加入适量的出于对数生长期的金黄色葡萄球菌，使其总体积达到200μl，且抗菌肽的终浓度达到500μm,125μm,31.25μm,8μm,2μm,488nm,122nm,30nm,8nm,2nm,0.5nm,0nm，在37°c条件下，150-220rpm振荡培养，检测其在600nm处的吸光值。

图4抗菌肽1（fhfydamdgqi）抑制金黄色葡萄球菌活性实验。结果表明其最小抑制浓度为8nm。

图7抗菌肽2（aepdvqrgrsfhfydamdgqi）抑制金黄色葡萄球菌活性实验。结果表明其最小抑制浓度为0.5nm。

图9抗菌肽3（aepdvqrgrsf）抑制金黄色葡萄球菌活性实验。结果表明其最小抑制浓度为0.5nm。

图11抗菌肽4（aepdvqrgrsfhfyda）抑制金黄色葡萄球菌活性实验。结果表明其最小抑制浓度为0.5nm。

因此，抗菌肽1对于大肠杆菌、耻垢分枝杆菌和金黄色葡萄球菌都有较好的抑制作用，且其最小抑制浓度为0.5nm。抗菌肽2对于耻垢分枝杆菌和金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用，最小抑制浓度为0.5nm。抗菌肽3和4对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有较好的抑制作用，且其最小抑制浓度为0.5nm。因此，抗菌肽1（fhfydamdgqi）、抗菌肽2（aepdvqrgrsfhfydamdgqi）、抗菌肽3（aepdvqrgrsf）和抗菌肽4（aepdvqrgrsfhfyda）都可望在治疗细菌性疾病的药物方面有着很好的应用前景。

综上所述，本发明提供了一种来源于人的天然抗菌肽以及其在抑菌方面的作用。本抗菌肽具有高效的抗菌作用，对细菌具有很强的抗菌活性，在代替抗生素治疗细菌系疾病方面有很好的前景。

序列表

<110>复旦大学

<120>一种来源于gsdmd蛋白的抗菌肽及其应用

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>484

<212>prt

<213>homosapiens(human)

<400>1

mgsafervvrrvvqeldhggefipvtslqsstgfqpyclvvrkpssswfw50

kprykcvnlsikdilepdaaepdvqrgrsfhfydamdgqiqgsvelaapg100

qakiaggaavsdssstsmnvyslsvdpntwqtllherhlrqpehkvlqql150

rsrgdnvyvvtevlqtqkevevtrthkregsgrfslpgatclqgegqghl200

sqkktvtipsgstlafrvaqlvidsdldvllfpdkkqrtfqppatghkrs250

tsegawpqlpsglsmmrclhnfltdgvpaegaftedfqglraevetiske300

lelldrelcqllleglegvlrdqlalraleealeqgqslgpvepldgpag350

avleclvlssgmlvpelaipvvyllgaltmlsetqhkllaealesqtllg400

plelvgslleqsapwqerstmslppgllgnswgegapawvlldecglelg450

edtphvcwepqaqgrmcalyaslallsglsqeph484

<210>2

<211>12

<212>prt

<213>人工

<400>2

sfhfydamdgqi12

<210>3

<211>13

<212>prt

<213>人工

<400>3

rsfhfydamdgqi13

<210>4

<211>14

<212>prt

<213>人工

<400>4

grsfhfydamdgqi14

<210>5

<211>15

<212>prt

<213>人工

<400>5

rgrsfhfydamdgqi15

<210>6

<211>16

<212>prt

<213>人工

<400>6

qrgrsfhfydamdgqi16

<210>7

<211>17

<212>prt

<213>人工

<400>7

vqrgrsfhfydamdgqi17

<210>8

<211>18

<212>prt

<213>人工

<400>8

dvqrgrsfhfydamdgqi18

<210>9

<211>19

<212>prt

<213>人工

<400>9

pdvqrgrsfhfydamdgqi19

<210>10

<211>20

<212>prt

<213>人工

<400>10

epdvqrgrsfhfydamdgqi20

<210>11

<211>11

<212>prt

<213>人工

<400>11

fhfydamdgqi11

<210>12

<211>21

<212>prt

<213>人工

<400>12

aepdvqrgrsfhfydamdgqi21

<210>13

<211>11

<212>prt

<213>人工

<400>13

aepdvqrgrsf11

<210>14

<211>16

<212>prt

<213>人工

<400>14

aepdvqrgrsfhfyda16