芳香氨基酸修饰的吲哚乙醇衍生物,其合成，活性和应用的制作方法

本发明涉及1-(乙酰-aa-obzl)-3-(乙氧基乙酰-aa-obzl)吲哚,涉及它们的制备方法，涉及它们的抗肿瘤活性，涉及它们的抗肿瘤转移活性,以及涉及它们的抗炎活性活性，因而本发明涉及它们在制备抗肿瘤药物，抗肿瘤转移药物和抗炎药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

恶性肿瘤严重威胁人类健康。其中肺癌是最具侵略性的人类癌症之一。对于肺癌患者晚期的患者，通常10％-15％的人只能存活5年。在过去的30年里这种困难的局面尚未显著有所改善。在很多临床病例中，肺癌在被诊断之前已经转移到周围组织。肿瘤转移，尤其是肿瘤肺转移是肿瘤患者死亡的最大风险。至今，仍然没有可预防肿瘤转移的抗肿瘤药物用于临床。炎症则会进一步恶化肿瘤及肿瘤转移患者的预后。至今，更没有可预防炎症及肿瘤转移的抗肿瘤药物用于临床。发明具有抗肿瘤，抗肿瘤转移和抗炎三重作用的药物是抗肿瘤药物研究的前沿。发明人的前期发明(专利申请公布号cn106349148a，申请号cn201510409682.6)曾经公开,在0.2μmol/kg剂量下氨基酸苄酯取代的双吲哚乙酸醇具有抗肿瘤，抗肿瘤转移和抗炎三重作用(左式)。发明人对这类双吲哚乙醇氨基酸酸苄酯有两点不满意。第一点不满意是mtt模型显示它们的抗肿瘤活性来自细胞毒作用(除1个化合物外，其余所有化合物抑制5种肿瘤细胞增殖的ic50为8.2-62.2μm)。临床应用显示，细胞毒类药物都有较大的毒副作用。也就是说，这类双吲哚乙醇氨基酸酸苄酯面临较大的毒副作用的风险。第二点不满意是它们发挥抗肿瘤，抗肿瘤转移和抗炎三重作用的最低有效剂量是0.2μmol/kg，偏高。在过去的两年里，发明人一直在寻找最低有效剂量比0.2μmol/kg低的非细胞毒类的具有抗肿瘤，抗肿瘤转移和抗炎三重作用的化合物。最终发明人发现，芳香氨基酸苄酯(phe-obzl,tyr-obzl和trp-obzl)修饰的吲哚乙醇(右式)在0.02μmol/kg剂量下具有抗肿瘤，抗肿瘤转移和抗炎三重作用。因为药物的毒副作用都可以随剂量降低而消失，所以有效剂量降低10倍表明了这种结构修饰有突出的技术效果。此外，mtt模型显示它们对肿瘤细胞增殖的ic50均大于200μm。也就是说，芳香氨基酸苄酯(phe-obzl,tyr-obzl和trp-obzl)修饰的吲哚乙醇还没有细胞毒类化合物的毒副作用。根据两方面的优势，发明人提出了本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个内容是提供下式的1-(乙酰-aa-obzl)-3-(乙氧基乙酰-aa-obzl)吲哚(式中aa为l-phe残基、l-tyr残基和l-trp残基)。

本发明的第二个内容是提供1-(乙酰-aa-obzl)-3-(乙氧基乙酰-aa-obzl)吲哚(aa为l-phe残基、l-tyr残基和l-trp残基)的制备方法,该方法由以下步骤构成：

1)在氢化钠催化吲哚乙醇与溴乙酸乙酯在四氢呋喃中80℃反应生成1-乙氧羰甲基-3-乙氧羰甲氧基乙基-吲哚(1)；

2)在浓度为2n的naoh水溶液中化合物1皂化得到1-羧甲基-3-羧甲氧基乙基-吲哚(2)；

3)在二环己基碳二亚胺和n-羟基苯并三氮唑存在下化合物2在无水四氢呋喃中与aa-obzl反应生成1-(乙酰-aa-obzl)-3-(乙氧基乙酰-aa-obzl)吲哚(aa为l-phe残基、l-tyr残基和l-trp残基)。

本发明的第三个内容是评价1-(乙酰-aa-obzl)-3-(乙氧基乙酰-aa-obzl)吲哚(aa为l-phe残基、l-tyr残基和l-trp残基)的抗肿瘤转移活性。

本发明的第四个内容是评价1-(乙酰-aa-obzl)-3-(乙氧基乙酰-aa-obzl)吲哚(aa为l-phe残基、l-tyr残基和l-trp残基)的抗肿瘤活性。

本发明的第五个内容是评价1-(乙酰-aa-obzl)-3-(乙氧基乙酰-aa-obzl)吲哚吲哚(aa为l-phe残基、l-tyr残基和l-trp残基)的抗炎活性。

附图说明

图1.1-(乙酰-aa-obzl)-3-(乙氧基乙酰-aa-obzl)吲哚的合成路线.i)溴乙酸乙酯，nah，80℃；ii)浓度为2n的naoh水溶液；iii)二环己基碳二亚胺，n-羟基苯并三氮唑，n-甲基吗啉；3a中aa为l-phe残基，3b中aa为l-tyr残基，3c中aa为l-trp残基。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备1-乙氧羰甲基-3-乙氧羰甲氧基乙基-吲哚(1)

室温下向5.00g(31mmol)吲哚乙醇与50ml无水四氢呋喃(thf)的溶液中缓慢加入2.98g(4mmol，60％)nah，搅拌30分钟之后缓慢滴加17.22ml(5mmol)溴乙酸乙酯，80℃加热48小时。tlc(石油醚/乙酸乙酯，3/1)显示反应完成。停止加热，反应混合物冷却至室温。滤除掉固体，滤液减压浓缩。残留物用硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯，3/1)纯化，得到1.54g(15％)标题化合物，为黄色糖浆。esi-ms(m/e):334[m+h]⁺。

实施例2制备1-羧甲基-3-羧甲氧基乙基吲哚(2)

冰浴下将1.31g(3.9mmol)1-乙氧羰甲基-3-乙氧羰甲氧基乙基-吲哚(1)用10ml甲醇溶解。往得到的溶液中滴加浓度为2n的naoh水溶液，调节溶液的ph至12，搅拌5小时后tlc(石油醚/乙酸乙酯，3/1)显示反应完成。反应混合物用饱和khso4水溶液节ph至7，减压浓缩，残留物物用15ml乙酸乙酯萃取3次，水层用饱和khso4水溶液调节ph至4，用15ml乙酸乙酯萃取3次。分出的水层继续用饱和khso4水溶液调节ph至2，用15ml乙酸乙酯萃取3次并合并分离的乙酸乙酯层，用15ml饱和nacl水溶液洗3次，用无水na2so4干燥12小时。过滤，滤液减压浓缩，得到0.68g(62％)标题化合物，为黄色糖浆。esi-ms(m/e):276[m-h]^-；mp97-100℃；ir(kbr,cm^-1):3196,3051,2892,1651,1469,1435,1175,1124,840,901,724；¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝12.731(s,2h),7.549(d,j＝7.8hz,1h),7.324(d,j＝6.9hz,1h),7.172(s,1h),7.114(t,j＝6.9hz,1h),7.021(t,j＝6.9hz,1h),4.937(s,2h),4.053(s,2h),3.725(t,j＝7.2hz,2h),2.947(t,j＝7.2hz,2h)。

实施例3制备1-(乙酰-phe-obzl)-3-(乙氧基乙酰-phe-obzl)吲哚(3a)

将0.55g(2.0mmol)1-羧甲基-3-羧甲氧基乙基-吲哚(2)，0.54g(4.0mmol)n-羟基苯并三氮唑(hobt)和10ml无水thf的溶液搅拌30分钟，得到反应溶液a。将0.82g(4.0mmol)二环己基碳二亚胺(dcc)用5ml无水thf溶解，得到反应溶液b。冰浴下，将反应溶液b缓慢滴加至反应溶液a中，搅拌30分钟。然后往里中加2.33g(8.0mmol)hcl·phe-obzl与15ml无水thf的溶液。反应混合物用n-甲基吗啉(nmm)调节ph至9，室温搅拌10小时。tlc(ch2cl2/ch3oh，30/1，加3滴乙酸)显示反应完成。反应混合物过滤,滤液减压浓缩，残留物用30ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用20ml饱和nahco3水溶液洗3次，20ml饱和nacl水溶液洗3次，20ml5％khso4水溶液洗3次，20ml饱和nacl水溶液洗3次，20ml饱和nahco3水溶液洗3次及20ml饱和nacl水溶液洗3次。乙酸乙酯层用无水na2so4干燥12小时，过滤，滤液减压浓缩，残留物用硅胶柱层析(ch2cl2/ch3oh，30/1，加3滴乙酸)纯化，得到0.39g(26％)目标化合物，为无色粉末。esi-ms(m/e):752[m+h]⁺；mp145-147℃；ir(kbr,cm^-1):3452,3335,2932,2868,1744,1705,1664,1645,1537,1468,1289,1201,746,731,696；¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝8.722(d,j＝7.8hz,1h),7.923(d,j＝8.1hz,1h),7.627(d,j＝6.3hz,1h),7.207(m,24h),5.093(m,4h),4.757(m,2h),4.591(m,2h),3.867(m,2h),3.576(t,j＝7.2hz,2h),3.001(m,6h)。

实施例4制备1-(乙酰-tyr-obzl)-3-(乙氧基乙酰-tyr-obzl)吲哚(3b)

采用实施例3的方法从0.55g(2.0mmol)1-羧甲基-3-羧甲氧基乙基-吲哚(2)和1.96g(8.0mmol)hcl·tyr-obzl得到0.39g(25％)标题化合物，为无色粉末。esi-ms(m/e):784[m+h]⁺；mp83-85℃；ir(kbr,cm^-1):3305,3063,2932,1737,1657,1614,1514,1455,1212,1174,1114,739,697；¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝9.316(s,1h),9.253(s,1h),8.680(d,j＝7.2hz,1h),7.838(d,j＝8.1hz,1h),7.534(d,j＝7.8hz,1h),7.303(m,10h),7.031(m,8h),6.644(m,4h),5.093(d,j＝3.9hz,4h),4.774(m,2h),4.646(m,2h),3.883(m,2h),3.611(t,j＝7.2hz,2h),2.888(m,6h)。

实施例5制备1-(乙酰-trp-obzl)-3-(乙氧基乙酰-trp-obzl)吲哚(3c)

采用实施例3的方法从0.55g(2.0mmol)1-羧甲基-3-羧甲氧基乙基-吲哚(2)和2.64g(8.0mmol)hcl·trp-obzl得到0.62g(37％)标题化合物，为淡黄色粉末。esi-ms(m/e):830[m+h]⁺；mp79-83℃；ir(kbr,cm^-1):3318,3056,2923,2853,1732,1657,1525,1455,1338,1177,1111,737,695；¹hnmr(300mhz,dmso-d6)δ/ppm＝10.912(s,1h),10.906(s,1h),8.701(d,j＝4.8hz,1h),7.818(d,j＝4.8hz,1h),7.489(m,3h),7.313(m,8h),7.218(m,4h),7.010(m,10h),5.053(m,4h),4.769(m,2h),4.637(m,2h),3.884(m,2h),3.581(t,j＝7.5hz,2h),3.179(m,4h),2.857(t,j＝7.2hz,2h)。

实施例6测定化合物3a-c的抗肿瘤转移活性

本测定模型用lewis小鼠肺癌细胞(llc,购自atcc)接种,选用dmem培养基(含10％经灭活的胎牛血清,1×10⁵u/l青霉素和100mg/l链霉素),按照贴壁细胞培养方法每两天传代一次，富集细胞。待细胞生长状态良好并处于对数生长期时消化细胞，用生理盐水调整细胞密度至1×10⁷个/ml。胎盘蓝染色，使活细胞计数>95％。取近交系c57bl/6雄性小鼠(spf级,体重20±2g)，左手固定小鼠。用75％乙醇对小鼠右前肢腋窝皮肤消毒。右手持1ml无菌注射器往小鼠腋部皮下注射llc肿瘤细胞悬液，每只小鼠注射0.2ml。小鼠接种10天后，长出直径约4-5mm的肿瘤即为瘤源。接种10天的lewis肺癌荷瘤小鼠乙醚麻醉，脱颈椎处死。用75％乙醇浸泡10min，消毒，在超净工作台上剥离瘤体。选择生长良好的肿瘤组织在无菌平皿中剪碎，置于玻璃制造的组织匀浆器内。按瘤块重比生理盐水体积为1比3(g比ml)的比例加温度为4℃的生理盐水，轻轻研磨制成细胞悬液。细胞悬液过200目细胞筛制单细胞悬液。用生理盐水调单细胞悬液的细胞密度至1.5×10⁷个/ml。胎盘蓝染色，使活细胞计数>95％。左手固定近交系c57bl/6雄性小鼠，用75％的乙醇对小鼠右前肢腋窝皮肤消毒。右手持1ml无菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤细胞悬液，每只注射0.2ml。接种10天后小鼠长出直径4-5mm的肿瘤，按测得的肿瘤体积将接种小鼠随机分组。每组12只小鼠。接种肿瘤的第11天小鼠或口服公认的抗肿瘤转移肽arg-gly-asp-ser(rgds)的生理盐水溶液(剂量为20μmol/kg/天)或口服化合物3a-c的生理盐水溶液(剂量为0.02μmol/kg/天)或口服化合物2的生理盐水溶液(剂量为2μmol/kg/天)或口服生理盐水(剂量为10ml/kg/天)，每天给1次药，连续给药12天，每隔两天测量并记录肿瘤体积。最后一次给药的次日测量瘤体积，乙醚麻醉脱颈椎处死，取小鼠的肿瘤称重，取小鼠的肺并计算肿瘤肺部转移的瘤节数。用t检验对数据进行统计分析。结果见表1。在0.02μmol/kg剂量下化合物3a-c不仅有效地抑制肿瘤肺转移，而且化合物活性与剂量比它们高1000倍rgds及剂量比它们高100倍的化合物2没有显著性差异。这些数据表明，本发明有显著的技术效果。

表1化合物3a-c的抗肿瘤转移活性

a)与生理盐水相比p<0.01，与rgds及化合物2比p>0.05；n＝10

实施例7测定化合物3a-c的抗肿瘤生长活性

测定前将阿霉素用生理盐水溶解,化合物2和化合物3a-c用生理盐水溶解,用s180小鼠模型进行评价。在无菌环境中取接种于雄性icr小鼠10天生长旺盛的s180腹水瘤液，用生理盐水稀释成(1:2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞。按细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/ml计算细胞密度，按细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％计算细胞存活率。将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制成密度为2.0×10⁷个/ml的细胞悬液。该细胞悬液接种于小鼠右腋皮下(0.2ml/只)，制造s180荷瘤小鼠。接种24h后s180荷瘤小鼠每日腹腔注射阿霉素的生理盐水溶液(剂量为2μmol/kg/天g)或每日口服化合物2的生理盐水溶液(剂量为5μmol/kg/天)或每日口服化合物3a-c的生理盐水溶液(剂量为0.02μmol/kg/kg/天)。每天给药一次，连续给药12天。最后一次给药的次日测量瘤体积，乙醚麻醉脱颈椎处死，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤钝性剥离肿瘤并称重。用瘤重(均值±sdg)表示疗效，数据用t检验和方差分析。结果见表2。在0.02μmol/kg剂量下化合物不仅有效地抑制肿瘤生长，而且活性与剂量比它们高100倍的化合物2没有显著性差异。这些数据表明，本发明有显著的技术效果。

表2化合物3a-c对s180小鼠肿瘤生长的影响

a)与生理盐水相比p<0.01，与化合物2比p>0.05；n＝12.

实施例8测定化合物3a-c的抗炎活性

因为二甲苯引起的小鼠耳肿胀被公认为急性炎症模型，所以本发明在二甲苯引起的小鼠耳肿胀模型上测定化合物3a-c的治疗作用。因为阿司匹林是治疗急性炎症的阳性药，所以本发明选择阿司匹林为阳性对照药。icr雄性小鼠(体重20±2g)在温度为22℃的环境静息2天,自由饮水和进食。之后，随机分为生理盐水组(剂量为0.2ml/只)，阿司匹林组(剂量为1.11mmol/kg)，化合物2组(剂量为2μmol/kg)及化合物3a-c组(剂量为0.02μmol/kg)，每组12只小鼠。测定时小鼠按所在组或口服生理盐水，或口服阿司匹林，或口服化合物2，或口服化合物3a-c。给药30min后,往小鼠的左耳廓均匀涂抹30μl二甲苯,2h后小鼠接受乙醚麻醉，断颈处死,剪下左右两耳,用7mm的打孔器在两耳的相同位置取圆形耳片,称重,求出两耳肿胀差值作为肿胀度。即肿胀度＝右耳圆片重量–左耳圆片重量。结果见表3。在0.02μmol/kg剂量下化合物3a-c不仅有效地抑制二甲苯引起的小鼠耳肿胀，而且活性与剂量比它们高100倍的化合物2没有显著性差异。这些数据表明，本发明有显著的技术效果。

表3化合物3a-c对二甲苯引起的小鼠耳肿胀的影响

a)与生理盐水相比p<0.01，与化合物2比p>0.05；n＝12。