片段化酶打断缓冲液及提高片段化酶打断效率的方法与流程

本发明涉及分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种片段化酶打断缓冲液及提高片段化酶打断效率的方法。
背景技术：
随着第二代高通量测序技术的不断发展，测序及计算分析成本不断降低，然而样品制备技术及成本在近年来发展相对滞后。传统的二代测序样品制备仍然采用机械打断法来使dna片段化，但该技术需要专门的设备，且对dna投入量要求甚高，在很大程度上限制了相关领域的推广和应用。相对于机械打断，酶法打断具有简单、快速、dna投入量低、技术门槛低等天然优势，近年来逐渐受到研究者的青睐。酶法打断的技术瓶颈在于随机分布式的片段化效率太低，且难以控制片段集中度，较难获得适合于高通量测序的片段化效果。目前市售的产品(neb)采用vvn和t7核酸内切酶(endonuclease)的混合物进行dna打断，但存在产量低、片段小的问题，不适于大片段建库，此外还有双酶作用成本高等缺点。技术实现要素：本发明提供一种片段化酶打断缓冲液及提高片段化酶打断效率的方法，极大地提高了酶的片段化效率。根据第一方面，一种实施例中提供一种片段化酶打断缓冲液，包括适于片段化酶发挥作用的缓冲液组分和终浓度为10％以下的peg8000，以及终浓度为10-25mm的mg2+。作为进一步改进的方案，peg8000的终浓度为7％，mg2+的终浓度为15mm。作为进一步改进的方案，上述适于片段化酶发挥作用的缓冲液组分包括tris-hcl、nacl、tritonx-100、牛血清白蛋白(bsa)。作为进一步改进的方案，tris-hcl的终浓度为10-30mm，nacl的终浓度为25-75mm，tritonx-100的终浓度为0.1％-0.2％，牛血清白蛋白的终浓度为0.05-0.2mg/ml。作为进一步改进的方案，tris-hcl的终浓度为20mm，nacl的终浓度为50mm，tritonx-100的终浓度为0.15％，牛血清白蛋白的终浓度为0.1mg/ml。根据第二方面，一种实施例中提供一种提高片段化酶打断效率的方法，在适于片段化酶发挥作用的缓冲液组分中加入终浓度为10％以下的peg8000，以及终浓度为10-25mm的mg2+。作为进一步改进的方案，peg8000的终浓度为7％，mg2+的终浓度为15mm。作为进一步改进的方案，上述适于片段化酶发挥作用的缓冲液组分包括tris-hcl、nacl、tritonx-100、牛血清白蛋白(bsa)。作为进一步改进的方案，tris-hcl的终浓度为10-30mm，nacl的终浓度为25-75mm，tritonx-100的终浓度为0.1％-0.2％，牛血清白蛋白的终浓度为0.05-0.2mg/ml。作为进一步改进的方案，tris-hcl的终浓度为20mm，nacl的终浓度为50mm，tritonx-100的终浓度为0.15％，牛血清白蛋白的终浓度为0.1mg/ml。本发明针对片段化酶的作用效果展开研究，通过在反应缓冲液体系中添加不同比例的peg及mg2+来调节dna片段化的效率及片段大小，得到可满足bgiseq-500平台pe100和pe150双端测序文库要求的打断缓冲液，极大地提高了酶的片段化效率，缩短了反应时间，操作简单且成本低。附图说明图1为本发明实施例1中不加peg8000(左图)和加入10％peg8000(右图)的打断缓冲液对dna的片段化效率；图2为本发明实施例2中不同peg8000浓度梯度对dna的片段化效率的影响结果图；图3为本发明实施例3中不同mgcl2浓度梯度对dna的片段化效率的影响结果图；图4为本发明实施例4中片段化酶打断dna后进行琼脂糖电泳的结果图。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本发明相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本发明的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。本发明实施例针对片段化酶(例如华大基因的segmentase酶)展开研究，通过优化反应缓冲液体系中的组分，尤其是添加不同比例的peg8000及mg离子(mg2+)来调节dna片段化的效率及片段大小，探索出可满足bgiseq-500平台pe100和pe150双端测序文库要求的打断反应体系，大大提高了酶的片段化效率，缩短了反应时间，操作简单且成本低。本发明对于拓展微量、特殊样本的dna打断建库有重要意义，可为相应科学研究提供方法和技术手段。本发明的一种实施例中提供一种片段化酶打断缓冲液，包括适于片段化酶发挥作用的缓冲液组分和终浓度为10％以下的peg8000，以及终浓度为10-25mm的mg2+。在本发明实施例中，“适于片段化酶发挥作用的缓冲液组分”可以有多种，可以分别使用不同的反应缓冲液体系，例如公知的tris缓冲液、mes缓冲液等，这些缓冲液中各组分的含量可以根据经验确定，这样的缓冲液组分包括但不限于tris-hcl、nacl、tritonx-100、牛血清白蛋白(bsa)等，在本发明的一个实施例中，tris-hcl的终浓度为10-30mm，nacl的终浓度为25-75mm，tritonx-100的终浓度为0.1％-0.2％，牛血清白蛋白的终浓度为0.05-0.2mg/ml，这样的缓冲液体系能够为片段化酶发挥作用提供良好的缓冲环境。作为典型但非限定性的实例，tris-hcl的终浓度可以是10mm、12mm、15mm、18mm、20mm、25mm、28mm、30mm、15-25mm。作为典型但非限定性的实例，nacl的终浓度可以是25mm、30mm、40mm、50mm、60mm、65mm、70mm、75mm、30-60mm、40-50mm。作为典型但非限定性的实例，按体积百分比计，tritonx-100的终浓度可以是0.1％、0.12％、0.15％、0.17％、0.19％、0.12-0.18％、0.14-0.16％。作为典型但非限定性的实例，牛血清白蛋白的终浓度可以是0.05mg/ml、0.07mg/ml、0.09mg/ml、0.11mg/ml、0.12mg/ml、0.15mg/ml、0.18mg/ml、0.2mg/ml、0.08-0.18mg/ml、0.1-0.15mg/ml。在本发明的一个最优实施例中，tris-hcl的终浓度为20mm，nacl的终浓度为50mm，tritonx-100的终浓度为0.15％，牛血清白蛋白的终浓度为0.1mg/ml。在本发明实施例中，按质量体积百分比计，peg8000的终浓度为10％以下，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％；mg2+的终浓度为10-25mm，例如12mm、15mm、18mm、20mm、22mm、24mm、25mm。在本发明的一个最优实施例中，按质量体积百分比计，peg8000的终浓度为7％；mg2+的终浓度为15mm。因此，在本发明的一个最优实施例中，片段化酶打断缓冲液包括：tris-hcl的终浓度为20mm，nacl的终浓度为50mm，tritonx-100的终浓度为0.15％，牛血清白蛋白的终浓度为0.1mg/ml，peg8000的终浓度为7％；mg2+的终浓度为15mm。需要说明的是，本发明中片段化酶打断缓冲液按照工作浓度(终浓度)限定各种组分的浓度，也就是说，是1×时的浓度。本领域技术人员知晓，缓冲液可以以储备液的形式(例如10×)提供，在这种情况下，缓冲液中各种组分的浓度是工作浓度的倍数关系(例如10×)。毫无疑问，本发明的技术方案的范围也涵盖了这种储备液形式的缓冲液，只要各种组分的浓度比例关系落在本发明的范围内即可。以下通过实施例详细说明本发明的技术方案和效果，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。实施例1向反应体系中添加10％peg8000可显著提高片段化效率按照如下表1配置不加peg8000和加入10％peg8000反应体系：表1组分不加peg8000加入peg8000大肠杆菌(e.coli)gdna1μg/0.5μg/0.1μg1μg/0.5μg/0.1μg10×反应缓冲液(μl)22片段化酶(segmentase，bgi)0.7u0.7upeg8000终浓度010％mgcl2终浓度10mm10mm无核酸酶的水补足20μl补足20μl37℃下温浴不同时间(min)10/20/3010/20/30其中，10×反应缓冲液的组分包括：200mmtris-hcl(室温时ph7.5)，500mmnacl，1.5％tritonx-100，1mg/mlbsa。反应结束后立即加入1μl0.5medta终止反应。然后，对打断产物直接进行琼脂糖电泳检测，结果如图1所示。其中左图为不加peg8000的片段化效率，右图为加入10％peg8000的片段化效率。结果显示：起始dna为1μg时，反应体系中加入10％peg8000作用10min，能将片段大小控制在100-400bp；而不加peg8000的体系需要酶作用30min才能达到同样片段大小。表明peg8000的加入能够显著提高酶的打断效率。实施例2测试peg8000浓度梯度对片段化效率的影响按照如下表2配置peg8000浓度梯度的反应体系：表2其中，10×反应缓冲液的组分包括：200mmtris-hcl(室温时ph7.5)，500mmnacl，1.5％tritonx-100，1mg/mlbsa。反应结束后立即加入1μl0.5medta终止反应。打断产物经1.5×ampurexpbeads(磁珠)纯化后，用qubitdsdnahsassay检测产物浓度，结果如表3所示；用agilent2100bioanalyzer(生物分析仪)检测片段分布，结果如图2所示。表3表3和图2的结果显示：随peg8000浓度梯度增加，片段范围渐趋集中，片段化效率显著增高，相应的由于碎片化小片段增多，有效dna得率逐渐减少。当反应体系中peg8000终浓度在7％时，能达到最适于bgiseq-500平台pe100bp和pe150bp文库的片段化效果。实施例3测试mgcl2浓度梯度对片段化效率的影响按照如下表4配置mgcl2浓度梯度的反应体系：表4其中，10×反应缓冲液的组分包括：200mmtris-hcl(室温时ph7.5)，500mmnacl，1.5％tritonx-100，1mg/mlbsa。反应结束后立即加入1μl0.5medta终止反应。打断产物经1.5×ampurexpbeads(磁珠)纯化后，用qubitdsdnahsassay检测产物浓度，结果如表5所示；用agilent2100bioanalyzer(生物分析仪)检测片段分布，结果如图3所示。表5mgcl2终浓度(mm)152025片段化dna得率21％15％10％片段范围(bp)100-2000100-1000100-500峰值片段大小(bp)450200150表4和图3的结果显示：随mgcl2浓度梯度增加，片段范围渐趋集中，片段化效率显著增高，相应的由于碎片化小片段增多，有效dna得率逐渐减少。当mgcl2的浓度在15mm时，能达到最适于bgiseq-500平台pe100bp和pe150bp文库的片段化效果。实施例4将本发明实施例2-3得到的片段化酶打断dna的最优条件运用于bgiseq-500平台pe100或pe150双端测序文库构建，设置dna打断条件如表6：表6组分/参数优化后体系优化前体系阴性对照实验编号123大肠杆菌(e.coli)gdna100ng100ng100ng10×反应缓冲液(μl)222片段化酶(segmentase，bgi)0.8u0.8u0peg8000终浓度(sigma)7％0(不添加)0mgcl2终浓度(sigma)15mm10mm10mm无核酸酶的水补足20μl补足20μl补足20μl37℃下温浴时间(min)103030其中，10×反应缓冲液的组分包括：200mmtris-hcl(室温时ph7.5)，500mmnacl，1.5％tritonx-100，1mg/mlbsa。反应结束后立即加入1μl0.5medta终止反应。然后，对打断产物直接进行琼脂糖电泳检测，结果如图4所示。结果显示：本实施例中优化后体系(实验1)在37℃反应10min的片段化效果显著优于优化前体系(实验2)在37℃反应30min的效果。说明添加剂组分及比例可以显著提高片段化酶的片段化效率。优化后体系(实验1)在37℃反应10min后基因组片段小于1kb，主带在300-500bp，可满足bgiseq-500平台pe100和pe150双端测序文库的片段化效果。以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属
技术领域：
的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。当前第1页12