一种检测含有糖链生物分子的试剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于功能化高分子材料技术领域，具体涉及一种检测含有糖链生物分子的试剂及其制备方法和应用。

背景技术：

生物分子广泛存在着糖链修饰，例如，糖类、核苷、核苷酸、糖基化蛋白、糖基化肽段等，它们在细胞信号传导、代谢调节、免疫功能调控等重要的生命过程中扮演着作用，许多含有糖链的生物分子是疾病、甚至癌症的发生、发展的生物标记物或药物治疗靶点，如胚胎抗原、组织特异性抗原等，又如e-钙黏蛋白的表达水平与肿瘤侵袭能力密切相关。因而，发展可对含有糖链的生物分子进行直接检测的方法对于癌症的早期预警、靶向治疗等具有重要意义。

硼酸亲和色谱的作用原理是利用硼酸基团与1,2或1,3-邻二羟基化合物的可逆性相互作用。在高ph值下，硼酸基团可以与1,2或1,3-邻二羟基化合物形成环状酯，该酯在低ph值下可以发生可逆的解离。利用这种可逆性相互作用来实现糖类、糖蛋白、糖肽、核苷、核苷酸等具有1,2或1,3-邻二羟基结构的重要生物分子分离分析的功能材料越来越受到了广泛关注。

目前，采用上述硼酸亲和色谱的作用原理制备出多种富集材料，例如专利号为201210329785.8、201310096122.0和201410856918.6等专利在磁性载体表面引入树枝状聚合物后再经硼酸功能化得到了树枝状硼酸功能化磁性微球，并用于含有顺式二羟基的生物分子，特别是糖蛋白的富集、纯化和分离。但该树枝状硼酸功能化磁性微球是基于固相的，只能用于基于固液分离的糖链生物分子的捕集，也就是说把溶液中的糖链生物分子从溶液中“抓”到固相载体上，再通过其他方式把“抓”到的糖链生物分子从该固相载体上洗脱下来，这样的方式不能实现糖链生物分子的直接检测。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测含有糖链生物分子的试剂及其制备方法和应用，利用所述试剂，可以对含有糖链的生物分子进行特异性、高灵敏度地定性和定量的检测，并且所述试剂的制备及应用方法简单、易行、省时、重复性好。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测含有糖链生物分子的试剂(a-d-b)，原料包括以下组分：树枝状聚合物(d)、含有硼酸和基官能团的化合物(b)以及含有基和可直接检测官能团的化合物或含有基和可被间接检测官能团的化合物(a)；其中r可为烷基、羟基、氢、卤素、烷氧基中的一种或多种；所述树枝状聚合物具有2个或2个以上胺基；

所述含有硼酸和基官能团的化合物(b)可通过基与树枝状聚合物(d)上的胺基发生化学键合反应进行结合；

所述含有基和可直接检测官能团的化合物或含有基和可被间接检测官能团的化合物(a)通过基与所述树枝状聚合物(d)上的胺基发生化学键合反应进行结合。

优选的，树枝状聚合物(d)为聚酰胺-胺型树枝状聚合物或含聚酰胺-胺型树枝状聚合物的嵌段聚合物。

优选的，聚酰胺-胺型树枝状聚合物为第二代到第十代中的一代或几代。

优选的，含有基和可直接检测官能团的化合物(a)中所述可直接检测官能团为荧光官能团或发光官能团。

优选的，所述荧光官能团含吖啶橙、吖啶黄、4',6-二脒基-2-苯基吲哚、荧光素、alexafluor系列染料、花青系列染料、罗丹明、德克萨斯红、邻苯二甲醛、香豆素类染料、尼罗红、俄勒冈绿色染料、碘化丙啶、级联蓝、荧光素酶、绿色荧光蛋白的结构或其衍生物中的一种或多种；

所述发光官能团含鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯及吖淀酰胺类、金刚烷的结构或其衍生物中的一种或多种。

优选的，含有基和可被间接检测官能团的化合物(a)中可被间接检测官能团含生物素或亲和素的结构。

优选的，所述含有硼酸和基官能团的化合物(b)包括对甲酰基苯硼酸及其衍生物。

本发明还提供所述的试剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将树枝状聚合物(d)和含有硼酸和基官能团的化合物(b)通过基进行化学键合反应，得到硼酸功能化树枝状聚合物；

2)将所述硼酸功能化的树枝状聚合物通过胺基与含有基和可直接检测官能团的化合物或含有基和可被间接检测官能团的化合物(a)的基进行化学键合反应，得到检测含有糖链生物分子的试剂。

本发明提供了所述试剂或所述方法制备的试剂在含有糖链生物分子的富集、纯化、分离和检测中的应用。

优选的，所述含有糖链生物分子为含有戊糖、己糖、甘露糖、半乳糖、山梨糖、岩藻糖、唾液酸糖型结构的生物分子或以上糖型衍生物的生物分子。

本发明提供了一种检测含有糖链生物分子的试剂(a-d-b)，原料包括以下组分：树枝状聚合物(d)、含有硼酸和基官能团的化合物(b)和含有基和可直接检测官能团的化合物或含有基和可被间接检测官能团的化合物(a)；其中r可为烷基、羟基、氢、卤素、烷氧基中的一种或多种；所述树枝状聚合物(d)具有2个或2个以上胺基；所述含有硼酸和基官能团的化合物(b)可通过基与树枝状聚合物上的胺基发生化学键合反应进行结合；所述含有基和可直接检测官能团的化合物或含有基和可被间接检测官能团的化合物(a)通过基与所述树枝状聚合物上的胺基发生化学键合反应进行结合。

本发明将含有硼酸官能团的化合物键合到了可溶的树枝状聚合物上，使本试剂具有了与含有糖链的生物分子结合的特点，同时在树枝状聚合物上键合了检测或被检测基团，实现了对含有糖链的生物分子的同步检测。

同时本发明所提供的试剂可在100000倍的不含糖链的生物分子干扰下选择性检测含有糖链的生物分子；含有本检测试剂的溶液可反复多次使用，且储存得当的话，可在长达几个月的保存期内保持良好的性能；所述检测试剂制备及应用方法步骤简单、易行、成本低廉、条件温和、便于操作，非常适用于生物化学、食品检测、分析化学、检验化学、临床医药等领域中的推广和普及。

附图说明

图1为实施例1中检测含有糖链生物分子的试剂的红外表征图；

图2为实施例7中检测含有糖链生物分子的试剂在高浓度非糖蛋白的干扰下对标准糖蛋白的选择性检测；

图3为实施例8中检测含有糖链生物分子的试剂应用于聚偏氟乙烯(pvdf)膜上糖蛋白的免疫印记(westernblotting)检测时的稳定性；

图4为实施例8中检测含有糖链生物分子的试剂对糖蛋白的定量准确性；

图5为实施例9中检测含有糖链生物分子的试剂应用于微孔板中糖蛋白的检测(elisa)；

图6为实施例10中检测含有糖链生物分子的试剂应用于微孔板中糖蛋白检测时的标准曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种检测含有糖链生物分子的试剂(a-d-b)，原料包括以下组分：树枝状聚合物(d)、含有硼酸和基官能团的化合物(b)以及含有基和可直接检测官能团的化合物或含有基和可被间接检测官能团的化合物(a)；其中r可为烷基、羟基、氢、卤素、烷氧基中的一种或多种；所述树枝状聚合物(d)具有2个或2个以上胺基；所述含有硼酸和基官能团的化合物(b)可通过基与树枝状聚合物上的胺基发生化学键合反应进行结合；

所述含有基和可直接检测官能团的化合物或含有基和可被间接检测官能团的化合物(a)通过基与所述树枝状聚合物上的胺基发生化学键合反应进行结合。

本发明提供的检测含有糖链生物分子的试剂原料包括树枝状聚合物(d)。所述树枝状聚合物(d)含有2个或2个以上胺基。所述树枝状聚合物(d)优选为聚酰胺-胺型树枝状聚合物或含有聚酰胺-胺型树枝状聚合物的嵌段聚合物。所述聚酰胺-胺型树枝状聚合物优选为第二代到第十代中的一代或几代的组合。本发明中，若树枝状聚合物为单独一代时，优选为第4代或第8代。若所述树枝状聚合物为组合物，优选为第4代和第8代组合。所述聚酰胺-胺型树枝状聚合物为pamam。本发明中，所述树枝状聚合物的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的树枝状聚合物即可。

本发明提供的检测含有糖链生物分子的试剂原料包括含有硼酸和基官能团的化合物(b)。所述含有硼酸和基官能团的化合物(b)可通过基与树枝状聚合物上的胺基发生化学键合反应进行结合，其中r可为烷基、羟基、氢、卤素、烷氧基中的一种或多种。本发明中，所述含有硼酸和基官能团的化合物(b)的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的化合物的来源即可。

在本发明中，所述含有基和可直接检测官能团的化合物(a)中所述可直接检测官能团为荧光官能团或发光官能团。所述荧光官能团含吖啶橙、吖啶黄、4',6-二脒基-2-苯基吲哚、荧光素、alexafluor系列染料、花青系列染料、罗丹明、德克萨斯红、邻苯二甲醛、香豆素类染料、尼罗红、俄勒冈绿色染料、碘化丙啶、级联蓝、荧光素酶、绿色荧光蛋白的结构或其衍生物中的一种或多种。本发明中，所述荧光物质的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的荧光物质的来源即可。

本发明中，所述发光官能团含鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯及吖淀酰胺类、金刚烷的结构或其衍生物中的一种或多种。本发明中，所述发光物质的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的发光物质的来源即可。

本发明中，所述含有基和可被间接检测官能团的化合物(a)中可被间接检测官能团含生物素或亲和素的结构。本发明中，所述含有基和可被间接检测官能团的化合物的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的被检测化合物的来源即可。

本发明中，所述含有硼酸和基官能团的化合物(b)包括对甲酰基苯硼酸及其衍生物或类似物。所述对甲酰基苯硼酸衍生物或类似物包括2-乙酰基苯硼酸、3-氨基苯硼酸、3-苄氧基苯硼酸、3-(n,n)-二甲酰胺基苯硼酸、4-(n,n)-二甲酰胺基苯硼酸、3-甲酰胺基苯硼酸、3-乙氧基苯硼酸、3-巯基苯硼酸、3-甲砜基苯硼酸、4-苄氧羰基苯硼酸、4-苄氧基苯硼酸、4-溴甲基苯硼酸、4-丁氧基苯硼酸、4-甲酰氯基苯硼酸、4-碘苯硼酸、4-甲氧甲基苯硼酸、4-甲氧基苯硼酸、4-甲硫基苯硼酸、4-甲砜基苯硼酸、4-戊基苯硼酸、4-异丙氧基苯硼酸、2,3-二氯苯硼酸、2,3-二氟苯硼酸、2,6-二氯苯硼酸、2,6-二甲氧基苯硼酸、3,5-二氯苯硼酸、2,3,4-三氯苯硼酸、2,3,5-三氟苯硼酸、2,4,6-三氟苯硼酸、2-氯-5-甲氧基苯硼酸、3-氨基-4-氟苯硼酸、3-氯-4-苄氧基苯硼酸、3-羧基-4-氟苯硼酸、4-氯-2-氟苯硼酸、4-氯-3-三氟甲基苯硼酸、5-氟-2-羟基苯硼酸、5-氟-2-甲基苯硼酸、9-菲硼酸、3-丁氧基苯硼酸、3-异丙氧基苯硼酸、4-乙酰胺基苯硼酸、4-羧酸苯硼酸、4-二甲酰基苯硼酸、2.5-二甲氧基苯硼酸、2-氯-5-氰基苯硼酸、2-氯-5-氟苯硼酸、3-氰基-4-氟苯硼酸、3-乙氧羰基-4-氟苯基硼酸、3-甲氧基-4-羧基苯硼酸、3-甲氧基-4-甲氧羰基苯硼酸、3-甲氧基-4-甲基苯硼酸、5-乙酰基-2-氯苯硼酸、5-乙酰基-2-氟苯硼酸、6-甲氧基-2-萘硼酸、2-吡啶硼酸、2-氯-3-氟吡啶-4-硼酸、2-叔丁氧基-5-嘧啶硼酸、2，4-二叔丁氧基嘧啶-5-硼酸、2-(5-四吡唑)苯硼酸、4-氟-3-苯氧基苯甲醛、2，3-二氯溴苯、3-溴-n-苯基咔唑、1-丁氧基萘、2-氯-5-氟吡啶-4-硼酸或5-氟-2-甲氧基吡啶-4-硼酸等硼酸基团。

本发明还提供了上述技术方案所述的试剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将树枝状聚合物(d)和含有硼酸和基官能团的化合物(b)通过基和树枝状聚合物上的胺基进行化学键合反应，得到硼酸功能化树枝状聚合物；

2)将所述硼酸功能化的树枝状聚合物通过胺基与含有基和可直接检测官能团的化合物或含有基和可被间接检测官能团的化合物(a)的基进行化学键合反应，得到检测含有糖链生物分子的试剂。

本发明中，将树枝状聚合物(d)上的胺基和含有硼酸和基官能团的化合物(b)中的基进行化学键合反应。树枝状聚合物(d)和含有硼酸和基官能团的化合物(b)在反应前优选分别先溶解于溶剂中，将得到的树枝状聚合物溶液和含有硼酸和基官能团的化合物溶液混合，进行化学键合反应。在本发明中，所述溶剂优选为醇类、醚类、酯类等有机试剂或水。所述树枝状聚合物的质量与溶剂的体积比优选为(1～1000)g：(1000～10)ml，更优选为(1～100)g：(10～100)ml。所述含有硼酸和(其中r可为烷基、羟基、氢、卤素、烷氧基中的一种)基官能团的化合物(b)的质量与溶剂的体积比优选为(1～1000)g：(1000～10)ml，更优选为(1～100)g：(10～100)ml。

本发明中，所述树枝状聚合物(d)和含有硼酸和(其中r可为烷基、羟基、氢、卤素、烷氧基中的一种)基官能团的化合物(b)的摩尔比优选为10：1～10：9，更优选为10：8。

本发明中，所述树枝状聚合物(d)上的胺基和含有硼酸和(其中r可为烷基、羟基、氢、卤素、烷氧基中的一种)基官能团的化合物(b)中的基之间的化学键合反应优选在搅拌的条件下进行。所述搅拌的转速优选为100～1500rpm，更优选为500rpm。所述化学键合反应的时间优选为2～36h，更优选为5～30h，最优选为10～24h。所述化学键合反应的温度优选为0～100℃，更优选为25-60℃。

本发明中，所述树枝状聚合物(d)上的胺基和含有硼酸和(其中r可为烷基、羟基、氢、卤素、烷氧基中的一种)基官能团的化合物(b)中的基之间的化学键合反应后优选将得到的反应产物纯化，得到纯化后的硼酸功能化树枝状聚合。

在本发明中，所述透析用透析袋或超滤用超滤膜的孔径优选为2000～10000da；所述透析的时间优选为6～36h，更优选为24h；所述超滤的时间优选为20～40min，更优选为30min；

得到硼酸功能化树枝状聚合物后，本发明优选将所述硼酸功能化树枝状聚合物溶于溶剂中进行重溶。所述溶剂优选为醇类、醚类、酯类等有机试剂或水、无机盐缓冲液等。所述纯化后的硼酸功能化树枝状聚合物的质量与重溶溶剂体积比为(1～100)g：(1～100)ml。

将所述硼酸功能化的树枝状聚合物通过胺基与含有基和可直接检测官能团的化合物或含有基(其中r可为烷基、羟基、氢、卤素、烷氧基中的一种或多种)和可被间接检测官能团的化合物(a)中的基进行化学键合反应，得到检测含有糖链生物分子的试剂；

本发明中，所述含有基和可直接检测官能团的化合物或含有基(其中r可为烷基、羟基、氢、卤素、烷氧基中的一种或多种)和可被间接检测官能团的化合物(a)进行反应之前优选利用溶剂进行溶解。所述溶剂优选为醇类、醚类、酯类等有机试剂或水、无机盐缓冲液等。

所述含有基和可直接检测官能团的化合物或含有基(其中r可为烷基、羟基、氢、卤素、烷氧基中的一种或多种)和可被间接检测官能团的化合物(a)的质量和溶剂体积比为(1～100)g：(1～100)ml。

本发明中，所述硼酸功能化的树枝状聚合物和含有基和可直接检测官能团的化合物或含有基(其中r可为烷基、羟基、氢、卤素、烷氧基中的一种或多种)和可被间接检测官能团的化合物(a)的摩尔比为10：1～10:9，更优选为10：2。

本发明中，所述硼酸功能化的树枝状聚合物和含有基和可直接检测官能团的化合物或含有基(其中r可为烷基、羟基、氢、卤素、烷氧基中的一种或多种)和可被间接检测官能团的化合物(a)之间的化学键合反应优选在搅拌的条件下进行。所述搅拌的转速优选为100～1500rpm，更优选为500rpm。所述化学键合反应的时间优选为0.5～36h，更优选为1～30h，最优选为2～24h。所述化学键合反应的温度优选为0～100℃，更优选为25℃。

本发明中，所述硼酸功能化的树枝状聚合物和含有基和可直接检测官能团的化合物或含有基(其中r可为烷基、羟基、氢、卤素、烷氧基中的一种或多种)和可被间接检测官能团的化合物(a)之间的化学键合反应后，优选将得到的反应产物纯化，得到检测含有糖链生物分子的试剂。在本发明中，所述纯化的方法优选为：将反应液透析或超滤。在本发明中，所述透析用透析袋或超滤用超滤膜的孔径优选为2000～10000da；所述透析的时间优选为6～36h，更优选为24h；所述超滤的时间优选为20～40min，更优选为30min。

本发明提供了所述试剂或所述方法制备的试剂在含有糖链生物分子的富集、纯化、分离和检测中的应用。

本发明中，所述含有糖链生物分子优选为含有戊糖、己糖、甘露糖、半乳糖、山梨糖、岩藻糖、唾液酸糖型结构的生物分子或以上糖型衍生物的生物分子。

本发明所提供的试剂对糖蛋白的检测灵敏度随所键合的直接检测官能团或间接检测官能团的不同而变化，如当所述检测试剂化学键合生物素作为间接检测官能团时，利用avidin-hrp配合ecl发光液进行检测，对糖蛋白的最低检测灵敏度可达0.1ng；当化学键合荧光素作为直接检测基团时，对糖蛋白的最低检测限可达10fg。

下面结合实施例对本发明提供的一种检测含有糖链生物分子的试剂及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

制备生物素修饰的对甲酰基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂

取20mg第四代聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶于600μl无水甲醇中，称量1mg对甲酰基苯硼酸溶于600μl无水甲醇中。二者充分混合后于60℃机械搅拌反应24小时，即得硼酸功能化的树枝状聚合物。将得到的硼酸功能化的树枝状聚合物，利用透析袋(3000da)纯化，溶于300μl磷酸盐缓冲溶液中，称量0.8mg生物素琥珀酰亚胺酯溶于300μl磷酸盐缓冲溶液中，二者充分混合后，于室温机械搅拌反应2小时，利用透析袋(3000da)纯化后，即得生物素修饰的对甲酰基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂。

生物素修饰的对甲酰基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂的红外表征图如图1所示，其中(a)为第四代聚酰胺-胺树枝状聚合物；(b)为硼酸功能化的聚酰胺-胺树枝状聚合物；(c)为生物素修饰的对甲酰基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂。由图1可以看出，硼酸官能团和生物素官能团均成功键合于第四代聚酰胺-胺树枝状聚合物表面。以上结果说明，生物素修饰的对甲酰基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂制备成功。

实施例2

制备生物素修饰的对氨基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂

取20mg第四代聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶于600μl无水甲醇中，加入20μl含25％(w/w)的戊二醛溶液，室温下机械搅拌2小时，利用超滤膜(3000da)纯化，将纯化后的产物溶于300μl无水甲醇中，称量1mg对氨基苯硼酸溶于300μl无水甲醇中。二者充分混合后于60℃机械搅拌反应24小时，即得硼酸功能化的树枝状聚合物。将得到的硼酸功能化的树枝状聚合物利用超滤膜(3000da)纯化，溶于300μl磷酸盐溶液中，称量0.8mg生物素琥珀酰亚胺酯溶于300μl磷酸盐溶液中，二者充分混合后，于室温机械搅拌反应2小时，利用超滤膜(3000da)纯化后，即得生物素修饰的对氨基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂。

实施例3

制备生物素修饰的对甲酰氯苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂

取20mg第四代聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶于600μl无水甲醇中，称量1mg对甲酰氯苯硼酸溶于600μl无水甲醇中。二者充分混合后于60℃机械搅拌反应24小时，即得硼酸功能化的树枝状聚合物。将得到的硼酸功能化的树枝状聚合物利用透析袋(3000da)纯化，溶于300μl磷酸盐溶液中，称量0.8mg生物素琥珀酰亚胺酯溶于300μl磷酸盐溶液中，二者充分混合后，于室温机械搅拌反应2小时，利用超滤膜(3000da)纯化后，即得生物素修饰的对甲酰基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂。

实施例4

制备基于第八代聚酰胺-胺型树枝状聚合物的生物素修饰的对甲酰基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂

取300mg第八代聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶于1ml无水甲醇中，称量16mg对甲酰基苯硼酸溶于1ml无水甲醇中。二者充分混合后于60℃机械搅拌反应24小时，即得硼酸功能化的树枝状聚合物。将得到的硼酸功能化的树枝状聚合物利用超滤膜(3000da)纯化，溶于1ml磷酸盐溶液中，称量10mg生物素琥珀酰亚胺酯溶于500μl磷酸盐溶液中，二者充分混合后，于室温机械搅拌反应2小时，利用透析袋(3000da)纯化后，即得生物素修饰的对甲酰基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂。

实施例5

制备荧光素修饰的对甲酰基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂

取20mg第四代聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶于600μl无水甲醇中，称量1mg对甲酰基苯硼酸溶于600μl无水甲醇中。二者充分混合后于60℃机械搅拌反应24小时，即得硼酸功能化的树枝状聚合物。将得到的硼酸功能化的树枝状聚合物，利用透析袋(3000da)纯化，溶于300μl磷酸盐缓冲溶液中，称量1mg异硫氰酸荧光素溶于300μl磷酸盐溶液中，二者充分混合后，于室温机械搅拌反应4小时，利用透析袋(3000da)纯化后，即得荧光素修饰的对甲酰基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂。

实施例6

制备鲁米诺修饰的对甲酰基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂

取20mg第四代聚酰胺-胺型树枝状聚合物溶于600μl无水甲醇中，称量1mg对甲酰基苯硼酸溶于600μl无水甲醇中。二者充分混合后于60℃机械搅拌反应24小时，即得硼酸功能化的树枝状聚合物。将得到的硼酸功能化的树枝状聚合物，利用超滤膜(3000da)纯化，溶于300μl磷酸盐溶液中，加入20μl含25％(w/w)的戊二醛溶液，室温下机械搅拌2小时，利用超滤膜(3000da)纯化，将纯化后的产物溶于300μl无水甲醇中，称量1mg鲁米诺溶于300μl无水甲醇中。二者充分混合后于60℃机械搅拌反应24小时，利用透析袋(3000da)纯化后，即得鲁米诺修饰的对甲酰基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂。

实施例7

实施例1制备的生物素修饰的对甲酰基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂应用于聚偏氟乙烯(pvdf)膜上糖蛋白的斑点印记(dot-blotting)检测

将聚偏氟乙烯(pvdf)膜用甲醇活化后晾干。将不同浓度的糖蛋白(trf、igg、ova、asf、ugt2b7)和非糖蛋白(bsa、hsa)溶液各取0.5μl，点于活化且晾干后的pvdf膜上。随后将膜置于封闭液(0.25mol/l醋酸铵、0.5mol/l氯化钠、0.5％吐温20、5％bsa)中，于摇床上孵育1h。用三蒸水洗两遍，每遍5min。将膜置于封闭液(0.25mol/l醋酸铵、0.5mol/l氯化钠、0.5％吐温20、5％bsa)中，于摇床上孵育1h。用三蒸水洗两遍，每遍5min。将膜置于10ml缓冲液中(含有1:3000稀释的本检测试剂、5％bsa、0.5％吐温20、0.25mol/l醋酸铵，ph8.8)，摇床上孵育1h。用缓冲液(含0.25mol/l醋酸铵、0.5mol/l氯化钠、0.5％吐温20，ph8.8)洗4遍，每遍5min；用醋酸铵(0.05mol/l，ph8.8)洗2两遍，每遍5min。将膜置于含有1:8000稀释的avidin-hrp醋酸铵溶液中(ph8.8，0.25mol/l醋酸铵、0.5mol/l氯化钠、0.5％吐温20、5％bsa)孵育45min。用缓冲液(含0.25mol/l醋酸铵、0.5mol/l氯化钠、0.5％吐温20，ph8.8)洗4遍，每遍5min。用ecl发光液(辣根过氧化物酶底物)进行检测。

检测结果如图2所示，从图2中可以看出，本检测试剂可在高浓度非糖蛋白的干扰下对糖蛋白实现高选择性、高灵敏度检测，其中(a)为不同浓度的糖蛋白(转铁蛋白-trf、免疫球蛋白-igg、卵清蛋白-ova、无唾液酸胎球蛋白-asf、葡萄糖醛酸转移酶2b7亚型-ugt2b7)；(b)为高浓度的非糖蛋白(bsa、hsa)。这表明本发明制备的糖蛋白检测试剂抗干扰能力强，能在10000倍非糖蛋白的干扰下选择性实现糖蛋白的检测或染色，且以生物素作为间接检测官能团，利用avidin-hrp配合ecl发光液进行检测时，对糖蛋白的最低检测灵敏度可达0.1ng。

实施例8

实施例1制备的生物素修饰的对甲酰基苯硼酸功能化的试剂应用于聚偏氟乙烯(pvdf)膜上糖蛋白的免疫印记(westernblotting)检测

将蛋白利用sds-page分离后，转至用甲醇活化后的聚偏氟乙烯(pvdf)膜上，随后将膜置于封闭液(0.25mol/l醋酸铵、0.5mol/l氯化钠、0.5％吐温20、5％bsa)中，于摇床上孵育1h。用三蒸水洗两遍，每遍5min。将膜置于10ml缓冲液中(含有1:3000稀释的本检测试剂、5％bsa、0.5％吐温20、0.25mol/l醋酸铵，ph8.8)，摇床上孵育1h。用ph8.8缓冲液(含0.25mol/l醋酸铵、0.5mol/l氯化钠、0.5％吐温20)洗4遍，每遍5min；用醋酸铵(0.05mol/l，ph8.8)洗2两遍，每遍5min。将膜置于含有1:8000稀释的avidin-hrp醋酸铵溶液中(ph8.8，0.25mol/l醋酸铵、0.5mol/l氯化钠、0.5％吐温20、5％bsa)孵育45min。用缓冲液(含0.25mol/l醋酸铵、0.5mol/l氯化钠、0.5％吐温20，ph8.8)洗4遍，每遍5min。用ecl发光液(辣根过氧化物酶底物)进行检测。

检测结果如图3、4所示。

图3结果表明，生物素修饰的对甲酰基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂应用于westernblot方法检测糖蛋白时非常稳定，储存一个月后的生物素修饰的对甲酰基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂，其检测性能无显著变化。

图4结果表明，生物素修饰的对甲酰基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂对糖蛋白定量准确性较高，误差小(r²>0.9)。

实施例9

实施例3制备的生物素修饰的对甲酰氯苯硼酸功能化的试剂应用于微孔板中糖蛋白的检测(elisa)

用0.05mol/lph9.6的碳酸缓冲液稀释糖蛋白至浓度在10ng/ml到1mg/ml之间，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml糖蛋白溶液，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用ph8.8的醋酸铵缓冲液清洗3次，每次3min。于各反应孔中，加入100μl含有0.2μl本检测试剂的醋酸铵缓冲液(0.25mol/l、1％bsa、0.5％吐温20，ph8.8)，37℃孵育0.5～1小时，用ph8.8的醋酸铵缓冲液清洗3次，每次3min。于各反应孔中，加入1:3000稀释的avidin-hrp醋酸铵溶液(0.25mol/l醋酸铵、0.5mol/l氯化钠、0.5％吐温20、5％bsa，ph8.8)37℃孵育45min。用缓冲液(含0.25mol/l醋酸铵、0.5mol/l氯化钠、0.5％吐温20，ph8.8)清洗4遍，每遍5min。tmb显色液a、b液1:100比例充分混匀，每孔加入100μl，37℃孵育20min，每孔加入100μl1mol/lh2so4终止反应。450nm波长检测吸光度。结果如图5所示。

图5为生物素修饰的对甲酰氯苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂应用于微孔板中糖蛋白的检测(elisa)。由图5可以看出，利用制备的检测试剂绘制的标准曲线，准确性较高，误差小(r²＝0.9873)，检测线性范围较广，在0～100ng/ml范围内线性关系较好。

实施例10

实施例5制备的荧光素修饰的对氨基苯硼酸功能化的检测含有糖链生物分子的试剂应用于微孔板中糖蛋白的检测(elisa)

使用步骤和流程与实施例9非常类似。不同之处在于，将孔板置于含有本检测试剂的溶液中孵育、并漂洗后，利用荧光酶标仪直接进行检测，检测结果如图6所示。

由图6可以看出，本检测试剂以荧光素作为直接检测基团时，对糖蛋白的检测灵敏度非常高，最低检测限可达10fg；线性范围宽，对糖蛋白的检测范围为5个数量级以上，在10fg～1ng范围内线性关系良好，r²为0.99以上。

由上述实施例结果表明，本发明所述检测试剂对糖蛋白和非糖蛋白有高度的选择性，同时所述糖蛋白检测试剂抗干扰能力强，能在10000倍非糖蛋白的干扰下选择性实现糖蛋白的检测或染色。研究表明所述试剂具有较高的稳定性和检测准确性。其对糖蛋白的检测灵敏度随所键合的直接检测官能团或间接检测官能团的不同而变化，如当所述检测试剂化学键合生物素作为间接检测官能团时，利用avidin-hrp配合ecl发光液进行检测，对糖蛋白的最低检测灵敏度可达0.1ng；当化学键合荧光素作为直接检测基团时，对糖蛋白的最低检测限可达10fg。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。